种间特异性PSCAxCD3、CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3双特异性单链抗体

摘要

本发明涉及双特异性单链抗体分子，所述分子包含能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域，其中所述表位是由SEQ ID NO.2、4、6和8组成的组中所包括的氨基酸序列的一部分；和能够与选自下组的抗原结合的第二结合域：前列腺干细胞抗原(PSCA)、B淋巴细胞抗原CD19(CD19)、肝细胞生长因子受体(C-MET)、内皮唾液酸蛋白、EpCAM的由外显子2编码的EGF样结构域1、成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)和胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR或IGF-1R)。本发明还提供了编码所述双特异性单链抗体分子的核酸以及载体和宿主细胞及其生产方法。本发明还涉及包含双特异性单链抗体分子的药物组合物和所述双特异性单链抗体分子的医药用途。

说明书

本发明涉及双特异性单链抗体分子，所述分子包含能够与人(human)和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域，其中所述表位是由SEQ ID NO.2、4、6和8组成的组中所包括的氨基酸序列的一部分；和能够与选自下组的抗原结合的第二结合域：前列腺干细胞抗原(PSCA)、B-淋巴细胞抗原CD19(CD19)、肝细胞生长因子受体(C-MET)、内皮唾液酸蛋白、EpCAM的由外显子2编码的EGF样结构域1、成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)和胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR或IGF-1R)。本发明还提供了编码所述双特异性单链抗体分子的核酸以及载体和宿主细胞及其生产方法。本发明还涉及包含双特异性单链抗体分子的药物组合物和所述双特异性单链抗体分子的医药用途。

T细胞识别由克隆特征性分布的αβ和γδT细胞受体(TcR)介导，这些受体与肽MHC(pMHC)的肽负载分子相互作用(Davis & Bjorkman，Nature 334(1988)，395-402)。TcR的抗原特异性链不具有信号传导结构域，而是与保守的多亚基信号传导器CD3偶联(Call，Cell 111(2002)，967-979，Alarcon，Immunol.Rev.191(2003)，38-46，Malissen Immunol.Rev.191(2003)，7-27)。TcR连接(TcR ligation)直接传达至信号传导器的机制仍然是T细胞生物学的根本问题(Alarcon，上述引文；Davis，Cell 110(2002)，285-287)。持续的T细胞响应涉及共同受体介入、TcR低聚和免疫突触中TcR-pMHC复合体的更高级的排列(Davis & van der Merwe，Curr.Biol.11(2001)，R289-R291，Davis，Nat.Immunol.4(2003)，217-224)，这一点似乎很清楚。然而，非常早期的TcR信号传导在不存在这些事件下发生，并可能包括配体诱导的CD3ε构象变化(Alarcon，上述引文；Davis(2002)，上述引文；Gil，J.Biol.Chem.276(2001)，11174-11179，Gil，Cell 109(2002)，901-912)。信号传导复合体的ε、γ、δ和ζ亚基彼此结合以形成CD3ε-γ异二聚体、CD3ε-δ异二聚体和CD3ζ-ζ同二聚体(Call，上述引文)。不同研究已经表明，CD3分子对于αβTcR在细胞表面的正确表达和正常T细胞发育至关重要(Berkhout，J.Biol.Chem.263(1988)，8528-8536，Wang，J.Exp.Med.188(1998)，1375-1380，Kappes，Curr.Opin.Immunol.7(1995)，441-447)。小鼠CD3εγ异二聚体的胞外结构域片段的溶液结构显示，εγ亚基两者都是C2-set Ig结构域，它们彼此相互作用以形成异常的边对边(side-to-side)二聚体构型(Sun，Cell 105(2001)，913-923)。尽管富含半胱氨酸的主干(stalk)看来在驱使CD3二聚化中起重要作用(Su，上述引文，Borroto，J.Biol.Chem.273(1998)，12807-12816)，但是通过CD3ε与CD3γ的细胞外结构域方式的相互作用足以组装这些蛋白与TcRβ(Manolios，Eur.J.Immunol.24(1994)，84-92，Manolios & Li，Immunol.Cell Biol.73(1995)，532-536)。尽管仍有争论，但TcR的优势化学计量学最可能包含一个αβTcR、一个CD3εγ异二聚体、一个CD3εδ异二聚体和一个CD3ζζ同二聚体(Call，上述引文)。由于人CD3εγ异二聚体在免疫应答中的关键作用，近来解释了与治疗性抗体OKT3结合的该复合体的晶体结构(Kjer-Nielsen，PNAS 101，(2004)，7675-7680)。

许多治疗策略都通过靶向TcR信号传导，尤其是临床上广泛用于免疫抑制方案的抗人CD3的单克隆抗体(mAb)来调节T细胞免疫性。CD3特异性小鼠mAb OKT3是第一个批准用于人的mAb(Sgro，Toxicology 105(1995)，23-29)，并且作为免疫抑制剂在临床上广泛用于移植(Chatenoud，Clin.Transplant 7(1993)，422-430，Chatenoud，Nat.Rev.Immunol.3(2003)，123-132，Kumar，Transplant.Proc.30(1998)，1351-1352)、1型糖尿病(Chatenoud(2003)，上述引文)和银屑病(Utset，J.Rheumatol.29(2002)，1907-1913)。此外，抗CD3的mAb可诱导部分T细胞信号传导和克隆无反应(Smith，J.Exp.Med.185(1997)，1413-1422)。文献已经描述了OKT3为有效的T细胞促分裂原(Van Wauve，J.Immunol.124(1980)，2708-18)以及有效的T细胞杀伤剂(Wong，Transplantation 50(1990)，683-9)。OKT3以时间依赖性方式表现这两种活性；在导致细胞因子释放的T细胞早期激活之后，进一步施用时，OKT3随后阻断所有已知的T细胞功能。正是由于这种随后对T细胞功能的阻断，OKT3得以作为免疫抑制剂如此广泛地应用于治疗方案中，以减少或甚至消除同种异体移植的组织排斥。

OKT3最有可能通过阻断所有T细胞(T细胞在急性排斥中起主要作用)的功能而逆转同种异体移植的组织排斥。OKT3与人T细胞膜中的CD3复合体反应并阻断其功能，其中所述CD3复合体与T细胞的抗原识别结构(TCR)结合并对信号转导是必需的。被OKT3结合的TCR/CD3亚基已经是很多研究的主题。尽管一些证据指出OKT3对TCR/CD3复合体的ε亚基具有特异性(Tunnacliffe，Int.Immunol.1(1989)，546-50；Kjer-Nielsen，PNAS 101，(2004)，7675-7680)，进一步的证据显示，OKT3结合TCR/CD3复合体需要该复合体的其它亚基存在(Salmeron，J.Immunol.147(1991)，3047-52)。

CD3分子特异性的其它众所周知的抗体列在Tunnacliffe，Int.Immunol.1(1989)，546-50中。如上所述，这种CD3特异性抗体能够诱导各种T细胞应答，例如淋巴因子的产生(Von Wussow，J.Immunol.127(1981)，1197；Palacious，J.Immunol.128(1982)，337)、增殖(Van Wauve，J.Immunol.124(1980)，2708-18)和抑制性T细胞的诱导(Kunicka，in″Lymphocyte Typing II″1(1986)，223)。即，根据实验条件，CD3特异性单克隆抗体可抑制或诱导细胞毒性(Leewenberg，J.Immunol.134(1985)，3770；Phillips，J.Immunol.136(1986)1579；Platsoucas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)，4500；Itoh，Cell.Immunol.108(1987)，283-96；Mentzer，J.Immunol.135(1985)，34；Landegren，J.Exp.Med.155(1982)，1579；Choi(2001)，Eur.J.Immunol.31，94-106；Xu(2000)，Cell Immunol.200，16-26；Kimball(1995)，Transpl.Immunol.3，212-221)。

尽管本领域中描述的许多CD3抗体都被报道为识别CD3复合体的CD3ε亚基，但是它们中大多数实际上结合构象表位，并因此仅识别TCR的天然环境中的CD3ε。构象表位的特征为存在两个或更多个不连续的氨基酸残基，其在一级序列中是分开的，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时聚集到分子表面上(Sela，(1969)Science 166，1365和Laver，(1990)Cell 61，553-6)。本领域中描述的被CD3ε抗体结合的构象表位可分为两组。在主要组中，所述表位由诸如CD3ε链和CD3γ或CD3δ链的两个CD3亚基形成。例如，若干研究中已发现，最广泛使用的CD3ε单克隆抗体OKT3、WT31、UCHT1、7D6和Leu-4不与以CD3-ε链单转染的细胞结合。然而，这些抗体使以CD3ε和CD3γ或CD3ε和CD3δ的组合双转染的细胞染色(Tunnacliffe，上述引文；Law，Int.Immunol.14(2002)，389-400；Salmeron，J.Immunol.147(1991)，3047-52；Coulie，Eur.J.Immunol.21(1991)，1703-9)。在第二个较小的组中，构象表位在CD3ε亚基本身内形成。该组的一个成员是例如针对变性的CD3ε而产生的mAb APA 1/1(Risueno，Blood 106(2005)，601-8)。总之，本领域描述的大多数CD3ε抗体识别位于CD3的两个或更多个亚基上的构象表位。因此，形成这些表位的三维结构的不连续的氨基酸残基可位于CD3ε亚基本身上或位于CD3ε亚基和诸如CD3γ或CD3δ的其它CD3亚基上。

CD3抗体的另一个问题是已发现许多CD3抗体都是物种特异性的。抗CD3的单克隆抗体通过高度特异性地识别其靶分子而发挥作用(通常认为这对任何其它单克隆抗体都是适用的)。其仅识别其靶CD3分子上的单个位点或表位。例如，最广泛使用且最佳表征的CD3复合体特异性的单克隆抗体之一是OKT-3。该抗体与黑猩猩CD3反应但不与诸如猕猴(macaque)的其它灵长类的CD3同源物或狗的CD3反应(Sandusky等，J.Med.Primatol.15(1986)，441-451)。类似地，WO2005/118635或WO2007/033230描述了与人CD3ε反应但不与小鼠、大鼠、兔或诸如恒河猴、猕猴或狒狒的非黑猩猩灵长类的CD3ε反应的人单克隆CD3ε抗体。抗CD3单克隆抗体UCHT-1也与黑猩猩的CD3反应但不与猕猴的CD3反应(自有的数据)。另一方面，也有识别猕猴抗原但不识别其人对应物的单克隆抗体的实例。该组的一个实例是针对猕猴CD3的单克隆抗体FN-18(Uda等，J.Med.Primatol.30(2001)，141-147)。有趣的是，已发现，由于在猕猴属中CD3抗原的多态性，约12％的食蟹猴的外周淋巴细胞缺少与抗恒河猴CD3单克隆抗体FN-18)的反应性。Uda等人描述了食蟹猴CD3序列中与源自动物的与FN-18抗体反应的CD3相比较不与FN-18抗体反应的两个氨基酸取代(Uda等，J Med Primatol.32(2003)，105-10；Uda等，JMed Primatol.33(2004)，34-7)。

不仅CD3单克隆抗体(及其片段)固有而且一般单克隆抗体都固有的这种区分能力(即物种特异性)是将其开发为治疗人疾病的治疗剂的显著障碍。为了获得市场许可，任何新的候选药物都必须经过严格测试。这种测试可细分为临床前阶段和临床阶段：前者在动物中进行，而后者(进一步细分为通常已知的临床I期、II期和III期)在人患者中进行。临床前测试的目的是证实候选药物具有期望的活性和最重要的安全性。只有已经在临床前测试中证实了候选药物在动物中的安全性和可能的效力时，该候选药物才会被相关监管机构批准在人中进行临床测试。可以以以下三种方式测试候选药物在动物中的安全性：(i)在相关物种中，即在候选药物可识别直向同源抗原的物种中，(ii)在包含人抗原的转基因动物中和(iii)通过使用可与动物中存在的直向同源抗原结合的候选药物的替代物。转基因动物的局限性在于该技术一般限于啮齿类动物。啮齿类动物和人之间存在显著的生理学差异，不能将安全性结果简单地外推至人。候选药物的替代物的局限性在于，其与实际候选药物相比不同的物质组成，以及所用动物通常是具有上述局限性的啮齿类动物。因此，在啮齿类动物中产生的临床前数据对于候选药物的预测力有限。安全性测试的所选方法是使用相关物种，优选低等灵长类。本领域描述的适合人的治疗性干预的单克隆抗体目前的局限性在于，相关物种是高等灵长类，尤其是黑猩猩。黑猩猩被认为是濒危物种，并且由于其类似人的性质，使用这种动物进行药物安全性测试在欧洲已被禁止，而且在别处也受到高度限制。CD3还已经成功地被用作双特异性单链抗体的靶标，以使细胞毒性T细胞再针对病变细胞，从而引起相关生物体中病变细胞的去除。例如，Bargou等(Science 321(2008)：974-7)最近报道了被称作blinatumomab的CD19xCD3双特异性抗体构建体的临床活性，其具有使人患者体内所有的细胞毒性T细胞裂解癌细胞的潜能。在非霍奇金淋巴瘤患者体内以每天每平方米0.005mg的低剂量导致血液中靶细胞的消除。以0.015mg剂量水平首次观察到部分的和完全的肿瘤消退，并且以0.06mg的剂量水平治疗的所有七位患者都具有肿瘤消退。Blinatumomab还导致骨髓和肝脏中肿瘤细胞的清除。虽然该研究形成了双特异性单链抗体形式在源自血细胞的癌症治疗中的治疗性潜能的定论的临床证据，但是仍然需要用于其它癌症类型的治疗的成功定论。

2008年，在美国估计新诊断出患有前列腺癌的男性将有186,320位，并且约有28,660位男性将死于此病。关于癌症死亡率的最新报道显示，在2004年，美国男性中前列腺癌的总死亡率为每100,000位中有25例。在20世纪八十年代晚期，前列腺特异性抗原(PSA)检测的广泛采用代表了前列腺癌控制的主要成就。该检测测定血液中通常在前列腺癌患者体内提高的PSA蛋白的量。在1986年，美国食品和药品管理局批准使用PSA检测用于监测前列腺癌患者，并且还在1994年批准其用作该疾病的筛查试验。由于PSA检测在美国的广泛实施，目前约90％的前列腺患者在早期被诊断出来，由此使患者在诊断后存活更长的时间。然而，需要两个进行中的临床试验，由NCI资助的前列腺、肺、结肠直肠和卵巢(PLCO)筛查试验和欧洲前列腺癌筛查研究(ERSPC)的结果，以确定PSA筛查是否确实挽救生命。在过去25年进行的临床试验已经研究了天然和合成化合物在前列腺癌预防中的功效。例如，由19,000健康男性参加的前列腺癌预防试验(PCPT)发现，被批准用于治疗良性前列腺增生(BPH，前列腺的非癌性增大)的药物非那雄胺将形成前列腺癌的风险降低25％。另一个试验，硒和维生素E的癌症预防试验(SELECT)研究了大于35,000位男性以确定每日补充硒和维生素E是否能够降低前列腺癌在健康男性中的发生率。目前的其它前列腺癌预防试验评价了复合维生素、维生素C和D、大豆、绿茶和番茄中发现的天然化合物番茄红素的保护性潜能。在2005年报道的一项研究显示，所分析的60％-80％的前列腺癌中具有特定的基因融合。该研究代表了前列腺癌中非随机的基因重排的首个观察结果。这种遗传改变可能最终用作有助于该疾病的诊断以及可能的治疗的生物标记物。其它研究已经显示，8号染色体特定区的遗传变化可增加男性形成前列腺癌的风险。这些遗传变化约占白种男性中发生的前列腺癌的25％，其是首个经证实使形成前列腺癌的风险提高的遗传变化并且可以帮助科学家更好的了解该疾病的遗传原因。正在进行的研究还关注于患者血液中循环的蛋白如何能够用于提高前列腺癌和其它癌症的诊断。在2005年，科学家鉴定出患者免疫系统在对前列腺癌的应答中产生的一组特异蛋白。这些蛋白(一种自身抗体)能够以高于90％的准确率检测血液样品中前列腺癌细胞的存在。当与PSA组合使用时，这些蛋白以及其它血液蛋白可以最终用于单独进行PSA检测获得的假阳性结果的数量，并由此降低每年由于假阳性PSA检测结果而大量进行的不必要的前列腺活组织检查。

除了PSA，还鉴定出了前列腺癌的其它数个标记物，包括例如前列腺的六次跨膜上皮抗原(STEAP)(Hubert等，PNAS 96(1999)，14523-14528)，前列腺特异性膜抗原(PSM/PSMA)(Israeli等，Cancer Res.53(1993)，227-230)和前列腺干细胞抗原(PSCA)(Reiter等，Proc.Nat.Acad.Sci.95：1735-1740，1998)。前列腺干细胞抗原(PSCA)是在LAPC-4前列腺异种移植模型中寻找在癌症进展中被上调的基因时被首次鉴定的123个氨基酸的蛋白。它是属于Thy-1/Ly-6表面抗原家族的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白。PSCA与2型干细胞抗原具有30％的同源性。虽然PSCA的功能仍未被阐明，但PSCA同源物具有不同的活性，并且其自身参与癌症的产生。已经证明2型干细胞抗原抑制不成熟的胸腺细胞的凋亡。Thy-1通过经由src酪氨酸激酶的信号传导激活T细胞(Amoui等，Eur.J.Immunol.27(1997)，1881-86)。Ly-6基因参与肿瘤产生和细胞粘附(Schrijvers等，Exp.Cell.Res.196(1991)，264-69)。最初的信使RNA研究以及随后的单克隆抗体(mAb)染色已经证明，PSCA在正常以及恶化的前列腺细胞的细胞表面表达(Reiter等，上述引文；Gu等，Oncogene 19(2000)，1288-96；Ross等，Cancer Res.62(2002)，2546-53)。在正常的前列腺中，在基底细胞和分泌细胞亚群中检测到了PSCA mRNA。在前列腺癌中，在大约50-80％的原发癌和大约70％的转移癌中检测到了PSCA mRNA表达(Reiter等，上述引文)。已经报道了112个原发前列腺癌和9个转移至骨的前列腺癌的免疫组化(Gu等，上述引文)。在94％的临床局限性前列腺癌中检测到PSCA表达，在40％的临床局限性前列腺癌中检测到PSCA过表达。还在所研究的全部9例前列腺癌骨转移中检测到了高水平的PSCA蛋白表达。除了在前列腺中，还在移形上皮的伞状细胞层、一些肾集合管、胃部神经内分泌细胞和胎盘滋养层中检测到了PSCA。重要的是，最近的研究报道了PSCA在很大比例的胰腺癌和侵入性和非侵入性移行细胞癌中的过表达(Amara等，Cancer Res.61(2001)，4660-4665；Argani等，Cancer Res.61(2001)，4320-24)。由于PSCA在细胞表面的表达和在占高比例的不同癌细胞中的过表达，所以PSCA被讨论作为癌症治疗策略的靶标。然而，需要进一步的临床相关性，以验证这种可能性。

某些CD抗原的表达被高度限定于特定谱系的淋巴造血细胞上，并且在过去的几年，针对淋巴细胞特异性抗原的抗体已经用于开发在体外或动物模型中有效的治疗。在该方面，已经证明CD19是非常有用的靶标。CD19在从前B细胞至成熟B细胞的所有B细胞谱系中均有表达，其不脱落，均一地表达于所有淋巴瘤细胞上，而在干细胞中则缺乏(Haagen，Clin Exp Immunol 90(1992)，368-75，14；Uckun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，8603-7)。CD19参与某些B细胞介导的疾病，例如各种形式的非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自体免疫疾病或B细胞的消除。

参与人的多种癌症类型的进行和传播的分子的另一个实例是肝细胞生长因子受体MET(C-MET)。编码肝细胞生长因子(HGF)和分散因子(SF)的受体酪氨酸激酶(RTK)的MET致癌基因控制导致细胞生长、侵袭和保护免受凋亡的遗传程序。MET激活的下调不仅对致瘤性的获得还对侵袭表型的实现至关重要(Trusolino，L.& Comoglio，P.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2，289-300)。从数个试验方法发现了MET在人肿瘤中的作用并且得到了遗传形式的癌中MET激活突变的发现的明确证明(1997)，68-73；Kim et al.，J.Med.Genet.40(2003)，e97)。MET的组成型激活常见于散发性癌中，并且一些研究显示MET致癌基因在特定组织型的肿瘤中过表达或者通过自分泌机制而激活(系列参见http://www.vai.org/met/)。此外，在结肠直肠癌的血液转移中MET基因增强(Di Renzo等，Clin.Cancer Res.1(1995)，147-154)。

成纤维细胞分泌在培养物中的分散因子(SF，其具有诱导上皮细胞的细胞间解离的能力)和肝细胞生长因子(HGF，源自急性肝衰竭患者的血小板或血液的培养干细胞的有效有丝分裂原)被独立地鉴定为Met配体，最终发现其为同一分子。Met和SF/HGF在多种组织中广泛表达。Met(受体)的表达通常限于上皮来源的细胞，而SF/HGF(配体)的表达局限于间充质来源的细胞。

Met是以单链前体的形式产生的跨膜蛋白。该前体在furin位点被蛋白水解切割，以产生高度糖基化且完全在细胞外的50kd α-亚基和具有大的细胞外区(参与结合配体)、跨膜区和细胞内区(包含催化活性)的145kd β-亚基(Giordano(1989)339：155-156)。所述α链和β链由二硫键连接。Met的细胞外部分包含与臂板蛋白(semaphorins)同源的区域(Sema结构域，其包含Met的完整α链和β链的N-末端部分)、富含半胱氨酸的Met相关序列(MRS)和随后的富含甘氨酸-脯氨酸(G-P)重复以及四个免疫球蛋白样结构(Birchmeier等，Nature Rev.4(2003)，915-25)。Met的细胞内区域包含3个区：(1)近膜部分，其包含(a)丝氨酸残基(Ser 985)，当被蛋白激酶C或Ca²⁺钙调素依赖性激酶磷酸化时下调了所述受体激酶的活性(Gandino等，J.Biol.Chem.269(1994)，1815-20)；和(b)酪氨酸(Tyr 1003)，其与负责Met多泛素化、内吞和降解的泛素连接酶Cbl结合(Peschard等，Mol.Cell 8(2001)，995-1004)；(2)酪氨酸激酶结构域，其在受体激活时在Tyr1234和Tyr1235上经历转磷酸作用；(3)C-末端区，其包含插入到简并基序(degenerae motif)中的两个重要的酪氨酸(Tyr1349和Tyr1356)，所述简并基序代表了能够募集几种含有Src同源物-2(SH2)结构域的下游接头蛋白的多底物停泊位点。Met受体，象大多数受体酪氨酸激酶(RTK)一样，使用不同的酪氨酸以结合特异的信号传导分子。已经证明停泊位点的所述两个酪氨酸是必须的且对体外或体内的信号传导是足够的(Maina等，Cell 87(1996)，531-542；Ponzetto等，Cell 77(1994)，261-71)。

虽然已经利用C-MET作为肿瘤靶标开发了有效且可选的临床候选药物，但随后的临床试验必需揭示这些药物是否确实安全且在人体中显示治疗功效。考虑到这些不确定性，仍然需要用于癌症治疗的新构想。

2005年，癌症已经超过心脏病成为85岁以下美国人的头号杀手。在德国，目前癌症排在心血管病之后作为第二死因。除非癌症预防在接下来的数年取得与心血管病相当的重大突破，否则在15-20年内癌症将在德国成为主要死因。抑制肿瘤血管形成是在过去数年已经在临床医生和癌症研究科学家中产生大量成就的抗癌策略之一。在这些研究工作期间，鉴定出了数个肿瘤内皮细胞标记物。诸如内皮唾液酸蛋白(即TEM1或CD248)的肿瘤内皮细胞标记物在肿瘤血管生成过程中过表达(St.Croix等，Science 289(2000)，1197-1202)。尽管存在其功能目前还没有被详细表征这一事实，但在胚胎发育和肿瘤研究中已经明确认定其在血管内皮细胞中强表达(Carson-Walter等，Cancer Res.61：6649-6655，2001)。因此，165-kDa的I型跨膜蛋白内皮唾液酸蛋白在多种人癌症的肿瘤血管内皮细胞表面表达，但在许多正常组织的血管或其它细胞类型中没有检测到其表达。内皮唾液酸蛋白是757个氨基酸的C型血凝素样分子，其由信号前导肽，五个球状的细胞外结构域(包括C型血凝素结构域、一个与Sushi/ccp/scr模式类似的结构域和三个EGF重复)，随后的粘液素样区、跨膜部分和短的胞质尾组成(Christian等，J.Biol.Chem.276：7408-7414，2001)。内皮唾液酸核心蛋白荷载大量唾液酸化的O-连接寡糖，且对O-唾液酸糖蛋白内肽酶敏感，属于唾液酸粘蛋白样分子组。内皮唾液酸蛋白N-末端的360个氨基酸显示与参与调节血液凝集的受体凝血调节蛋白和补体受体C1qRp同源。这种结构关系显示了内皮唾液酸蛋白作为肿瘤内皮细胞受体的功能。虽然内皮唾液酸蛋白mRNA在正常人的内皮细胞和鼠的体细胞组织中广泛表达，但内皮唾液酸蛋白很大程度上局限于黄体和高血管组织例如愈合伤口或肿瘤的肉芽组织中(Opavsky et al.，J.Biol.Chem.276(2001，38795-38807；Rettig et al.，PNAS 89(1992)，10832-36)。内皮唾液酸蛋白的表达在癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)、肉瘤和神经外胚层肿瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)的肿瘤内皮细胞上被上调(Rettig等，上述引文)。此外，内皮唾液酸蛋白在肿瘤间质成纤维细胞亚群上以低水平表达(Brady等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.63(2004)，1274-83；Opavsky等，上述引文)。由于内皮唾液酸蛋白在正常组织中的局限性分布以及在多种不同类型的实体肿瘤的肿瘤内皮细胞上的丰富表达，已经讨论将其作为癌症的基于抗体的抗血管生成疗法的靶标。然而，目前还没有利用内皮唾液酸蛋白作为肿瘤内皮细胞靶标的有效治疗方法。

在多数人腺癌的细胞和数种鳞状细胞癌的细胞上极为频繁且高度表达的分子是EpCAM(CD326)(Went等，Br.J.Cancer 94(20006)，128-135)。最近的研究显示，EpCAM是能够上调原癌基因c-Myc和细胞周期蛋白的核表达的信号传导分子(Munz等，Oncogene 23(2004)，5748-58)。当在静止细胞中过表达时，EpCAM诱导细胞增殖、生长因子非依赖性和集落在软琼脂中的生长，这些都是致癌蛋白的标志。当通过小干扰RNA(siRNA)在乳腺癌细胞中敲减EpCAM表达时，这些细胞停止增殖、迁移和侵袭(Osta等，Cancer Res.64(2004)，5818-24)。EpCAM的这种致癌性信号传导可以解释为什么EpCAM过表达与包括乳腺癌和卵巢癌在内的许多人恶性肿瘤的整体存活差有关。已经采用EpCAM作为包括人抗体(Oberneder等，Eur.J.Cancer 42(2006)，2530-8)和EpCAMxCD3单链双特异性抗体MT110在内的数个基于抗体的治疗方法的靶标抗原。MT110的特征最近得到了详细阐述(Brischwein等，43(2006)，1129-43)。该抗体具有对抗表达所述靶标抗原的多种人癌系的活性，且目前正处于安全性和功效早期表现的I期研究的试验中。

更具体地，2005年癌症已经超过心脏病成为85岁以下美国人的头号杀手。在德国，目前癌症排在心血管病之后作为第二死因。除非癌症预防在接下来的数年取得与心血管病相当的重大突破，否则在15-20年内癌症将成为德国的主要死因。在大于100种类型的不同癌症中，上皮癌在德国是癌症死亡的主要因素。在上皮癌中，恶性上皮细胞向组成组织的侵袭和转移伴随有靶标器官中源自间充质的支持基质的适应性变化。为了提供潜在的治疗靶标，已经对这些未转化基质细胞中变化的基因表达进行了讨论。细胞表面蛋白酶成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)是活化的肿瘤成纤维细胞的这种靶标的一个实例。成纤维细胞激活蛋白α是诱导型细胞表面糖蛋白，最初利用单克隆单体F19在培养的成纤维细胞中被鉴定出来。免疫组化研究显示，FAPα在某些正常的胎儿间充质组织内暂时表达，但成人组织和恶性上皮细胞、神经细胞和造血细胞通常为FAPα阴性。然而，多数常见类型的上皮癌包含大量FAPα-活性的基质成纤维细胞。Scanlan等(Proc.Nat.Acad.Sci.91：5657-5661，1994)通过利用F19抗体的免疫筛选从WI-38人成纤维细胞cDNA表达文库克隆了FAPα cDNA。预测为760个氨基酸的人FAPα蛋白是具有大的C-末端细胞外结构域、疏水跨膜部分和短胞质尾的II型膜整合蛋白，其中，所述C-末端细胞外结构域包含6个潜在的N-糖基化位点、13个半胱氨酸残基和与高度保守的丝氨酸蛋白酶催化结构域对应的3个片段。FAPα显示与二肽基肽酶IV(DPP4)具有48％的氨基酸同一性，与DPP4-相关蛋白(DPPX)具有30％的同一性。RNA印迹分析在成纤维细胞中检测到2.8-kb FAPα mRNA。Seprase是170-kD的整合膜明胶酶，它的表达与人黑色素瘤和癌细胞的侵袭性有关。Goldstein等(Biochim.Biophys.Acta 1361：11-19，1997)克隆并表征了相应的seprase cDNA。作者发现，seprase和FAPα是同一蛋白且为同一基团的产物。Pineiro-Sanchez等(J.Biol.Chem.272：7595-7601，1997)从人黑色素瘤LOX细胞的细胞膜和脱落囊泡中分离出seprase/FAPα蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制剂阻断了seprase/FAPα的明胶酶活性，这提示seprase/FAPα包含催化活性丝氨酸残基。作者发现，seprase/FAPα由蛋白水解失活的N-糖基化的97-kD亚基单体组成。他们得出结论：seprase/FAPα类似于DPP4，因为它们的蛋白水解活性均取决于亚基结合。由于seprase/FAPα对明胶和热变性I型和IV型胶原的降解活性，提出seprase/FAPα在细胞外基质的再模建、肿瘤生长和癌转移中发挥转移。此外，seprase/FAPα在正常组织中显示局限的表达模式，而在许多恶性肿瘤的支持基质中均匀表达。因此，seprase/FAPα可用作用于开发旨在人上皮癌免疫疗法的肿瘤基质计划的靶标。然而，虽然已经启动了研究seprase/FAPα作为肿瘤抗原靶标的作用的数个临床试验，但传统免疫治疗方法或抑制seprase/FAPα酶促活性目前还没有带来治疗效果(参见例如Welt等，J.Clin.Oncol.12：1193-203，1994；Narra等，Cancer Biol.Ther.6，1691-9，2007；Henry等，Clinical Cancer Research 13，1736-1741，2007)。

胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR或IGF-1R)是具有酪氨酸激酶活性的受体，其与胰岛素受体IR具有70％的同源性。IGF-1R是分子量约为350,000的糖蛋白。该糖蛋白是杂四聚物受体，各半由二硫键连接，由细胞外α亚基和跨膜的β亚基组成。IGF-1R以非常高的亲合力与IGF 1和IGF 2结合，但与胰岛素结合的能力相当，亲合力降低100-1000倍。相反，IR以非常高的亲合力与胰岛素结合，不过IGF仅以降低100倍的亲合力结合至胰岛素受体。IGF-1R和IR的酪氨酸激酶结构域具有非常高的序列同源性，不过同源性较弱的区域分别涉及位于α亚基的半胱氨酸富含区和β亚基的C-末端部分。在α亚基中观察到的序列差异位于配体的结合区域，因此其是IGF-1R和IR分别对IGF和胰岛素的相对亲合力的起源。β亚基的C-末端部分的差异导致所述两个受体的信号传导通路的差异：IGF-1R介导促有丝分裂、分化和抗凋亡作用，而IR的激活主要涉及代谢通路水平上的作用(Baserga等，Biochim.Biophys.Acta，1332：F105-126，1997；Baserga R.，Exp.Cell.Res.，253：1-6，1999)。所述配体和所述受体细胞外结构域的结合激活了胞质酪氨酸激酶蛋白。所述激酶的激活进一步参与包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb 10在内的不同的细胞内底物的刺激(Peruzzi F.等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。IGF-IR的两个主要的底物是IRS和Shc，这两个底物通过下游多个效应子的激活介导与IGF与该受体的结合有关的大多数生长和分化作用。底物的可利用性可随后支配与IGF-1R的激活相关的最终的生物作用。当IRS-1占优势时，细胞趋向于增殖和转化。当Shc占优势时，细胞趋向于分化(Valentinis B.等；J.Biol.Chem.274：12423-12430，1999)。保护免受凋亡的作用主要涉及的通路似乎是磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)途径(Prisco M.等，Horm.Metab.Res.，31：80-89，1999；Peruzzi F.等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。IGF系统在肿瘤产生中的作用已经成为近十年精深研究的主题。这种兴趣导致发现除了其促有丝分裂和抗凋亡性质外转化表型的建立和保持似乎也需要IGF-1R这一事实。实际上，已经明确确定，IGF-1R的过表达或组成型激活在多种细胞中均导致不依赖于缺乏胎牛血清的培养基中的支持物的细胞生长和裸鼠中肿瘤的形成。这本身并不是独特的性质，原因是包括多种生长因子受体在内的过表达基因的多种产物都可以转化细胞。然而，清楚地证明了IGF-1R在转化中的主要作用的重大发现是编码IGF-1R的基因失活的R细胞对通常能够转化该细胞的不同试剂(例如牛乳头瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR过表达、SV40的T抗原、激活的ras或后两个因子的组合)的转化完全难以控制这一实证(Sell C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11217-11221，1993；Sell C.等，Mol.Cell.Biol.，14：3604-3612，1994；Morrione A.J.，Virol.，69：5300-5303，1995；Coppola D.等，Mol.Cell.Biol.，14：458a-4595，1994；DeAngelis T等，J.Cell.Physiol.，164：214-221，1995)。IGF-1R在多种肿瘤和肿瘤细胞系中均有表达，并且IGF通过与IGF-1R结合增强肿瘤生长。支持IGF-IR在癌产生中的作用的其它论据来自于利用针对所述受体的鼠单克隆抗体或利用IGF-IR的负显性突变进行的研究。实际上，针对IGF-1R的鼠单克隆抗体抑制了所培养的多种细胞系的增殖和肿瘤细胞在体内的生长(Arteaga C.等，Cancer Res.，49：6237-6241，1989Li等，Biochem.Biophys.Res.Com.，196：92-98，1993；Zia F等，J.Cell.Biol.，24：269-275，1996；Scotlandi K等，Cancer Res.，58：4127-4131，1998)。在Jiang等(Oncogene，18：6071-6077，1999)的工作中同样证明，IGF-1R负显性突变能够抑制肿瘤细胞增殖。

虽然在癌症治疗方法的新型靶标的鉴定中付出了很多努力，但癌症仍然是诊断最多的疾病之一。因此，仍然需要用于癌症的有效治疗。

本发明提供了双特异性单链抗体分子，所述分子包含能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链的表位结合的第一结合域，其中所述表位是由SEQ ID NO.2、4、6和8组成的组中所包括的氨基酸序列的一部分；和能够与选自下组的抗原结合的第二结合域：前列腺干细胞抗原(PSCA)、B淋巴细胞抗原CD19(CD19)、肝细胞生长因子受体(C-MET)、内皮唾液酸蛋白、EpCAM的由外显子2编码的EGF样结构域1、成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)和胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR或IGF-1R)。

虽然本领域描述的结合T细胞的双特异性单链抗体具有用于治疗恶性疾病的巨大治疗潜能，但这些双特异性分子中多数被局限于其是物种特异性的且仅识别人抗原和黑猩猩对应物(由于遗传相似性)。本发明的优势是提供了包含具有对人和非黑猩猩灵长类的CD3ε链具有种间特异性的结合域的双特异性单链抗体。

在本发明中，令人惊奇地鉴定出，与本领域描述的CD3ε的所有其它已知表位相比，CD3ε的细胞外结构域的N-末端的1-27个氨基酸残基的多肽片段在脱离CD3复合体的天然环境(并任选地融合于诸如EpCAM或免疫球蛋白Fc部分的异源氨基酸序列)时保持了其三维结构完整性。

因此，本发明提供了双特异性单链抗体分子，所述分子包含第一结合域和第二结合域，其中，所述第一结构域能够与人和至少一种非黑猩猩灵长类CD3ε链的CD3ε(所述CD3ε是，例如脱离其天然环境和/或(呈递在T细胞表面)被T细胞包含)的)的细胞外结构域的N-末端1-27个氨基酸残基多肽片段的表位结合，所述表位是由SEQ ID NO.2、4、6和8组成的组中所包括的氨基酸序列的一部分，并且所述第二结合域能够与前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合。在本文其它部分提到了优选的非黑猩猩灵长类。尤其优选选自普通狨猴(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)、松鼠猴(Saimiri sciureus)和食蟹猕猴(Macaca fascicularis，SEQ ID 2225或2226或两者)的至少一种(或选择的或全部)灵长类。普通猕猴(Macaca mulatta)，也称为恒河猴(Rhesus monkey)也被认为是另一种优选的灵长类。因此，认为本发明的抗体背景独立地与(能够结合于)人和普通狨猴、绒顶柽柳猴、松鼠猴和食蟹猕猴(SEQ ID NO.2225或2226或两者)的CD3ε的细胞外结构域的N-末端1-27个氨基酸残基多肽片段的表位结合，并且任选结合至普通猕猴。根据所附实施例(尤其是实施例2)中描述的方案能够获得(可获得)或者能够制备包含本文所定义的第一结合域的双特异性单链抗体分子。为此，可以设想(a)用人和/或松鼠猴的CD3ε的细胞外结构域的N-末端1-27个氨基酸残基多肽片段免疫小鼠；(b)产生免疫鼠抗体scFv文库；(c)通过测定与至少SEQ ID NO.2、4、6和8结合的能力鉴定CD3ε特异性结合物。

在本发明中提供的CD3表位的背景独立性(context-independence)与CD3ε的N-末端的前27个氨基酸或该27个氨基酸段的功能片段有关。本文使用的与CD3表位有关的术语“背景独立的”表示，本文描述的创造性的结合分子/抗体分子的结合不导致抗原决定簇或表位周围的构象、序列或结构的变化或修饰。相反，由常规CD3结合分子(如WO 99/54440或WO 04/106380中公开的)所识别的CD3表位位于所述的背景独立表位的N-末端1-27个氨基酸的C-末端的CD3ε链，其中它仅当被埋入ε链的其余部分且通过ε链与CD3γ或与δ链的异二聚化而保持在正确的空间位置时才具有正确构象。本文提供的作为双特异性单链抗体分子的一部分并针对背景独立的CD3表位产生(且靶向)的抗CD3结合分子/结构域提供了令人惊奇的关于T细胞再分布的临床改进，以及因此提供了更有利的安全性状况。不受限于理论，由于该CD3表位是背景独立的，其形成自主的自给自足的亚结构域而不太影响CD3复合体的其余部分，因此本文提供的CD3结合分子/结构域与识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子(如WO 99/54440或WO 04/106380中提供的分子)相比引起较小的CD3构象变构改变。

本发明的双特异性单链抗体(PSCAxCD3、CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)的CD3结合域识别的CD3表位的背景独立性与用本发明所述双特异性单链抗体治疗的初始阶段中较少的或者没有T细胞再分布(T细胞再分布等同于初始表位的下降和绝对T细胞数的恢复)有关，这导致与本领域已知的识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子相比本发明CD3结合分子的安全性状况更佳。尤其是，由于用CD3结合分子治疗的初始阶段中的T细胞再分布是不良事件(例如CNS不良事件)的主要风险因素，因此本发明的双特异性单链抗体通过识别背景独立的而不是背景依赖性CD3表位而具有超过本领域已知的CD3结合分子的显著安全性优势。在用常规CD3结合分子治疗的初始阶段中具有与T细胞再分布有关的这种CNS不良事件的患者通常遭受精神混乱和定向障碍，在一些情况下也遭受小便失禁。精神混乱是精神状态的改变，其中患者不能够以他或她通常的清晰水平进行思考。所述患者通常难以集中精力，并且思维不仅变模糊和不清楚，还经常显著减慢。在用常规CD3结合分子治疗的初始阶段中具有与T细胞再分布有关的CNS不良事件的患者也可能遭受失忆。通常，精神混乱导致丧失识别人、地点或时间和日期的能力。定向障碍的感觉在精神混乱中是常见的，并且决策能力受损。在用常规CD3结合分子治疗的初始阶段中与T细胞再分布有关的CNS不良事件还可包括言语模糊和/或选词困难。该疾患可损害语言的表达和理解以及读和写。除了小便失禁，在一些患者中，眩晕和头昏还可伴随在用常规CD3结合分子治疗的初始阶段中与T细胞再分布有关的CNS不良事件。

CD3ε的所述N-末端27个氨基酸多肽片段中三维结构的维持可用于产生结合域，所述结合域在体外能够与N-末端CD3ε多肽片段结合并且在体内以相同结合亲和力结合到T细胞上的天然CD3复合体(天然CD3ε亚基)，所述结合域优选地为人的结合域。这些数据有力地表明，本文描述的N-末端片段形成类似于其在体内正常存在的结构的三级构象。进行了关于CD3ε的N-末端多肽片段的氨基酸1-27结构完整性的重要性的一个非常敏感的试验。将CD3ε的N-末端多肽片段的氨基酸1-27的单个氨基酸改变为丙氨酸(丙氨酸扫描)以测试CD3ε的N-末端多肽片段的氨基酸1-27对于轻微破坏的敏感性。作为本发明双特异性单链抗体的一部分的CD3结合域被用于测试与CD3ε的N-末端多肽片段的氨基酸1-27的丙氨酸突变体的结合(参见所附的实施例5)。在所述片段的最N-末端的前五个氨基酸残基和在CD3ε的N-末端多肽片段的氨基酸1-27的位置23和25的两个氨基酸的单独交换对于抗体分子的结合至关重要。将位置1-5区域中的包括残基Q(位置1的谷氨酰胺)、D(位置2的天冬氨酸)、G(位置3的甘氨酸)、N(位置4的天冬酰胺)和E(位置5的谷氨酸)的氨基酸残基取代为丙氨酸，破坏了本发明优选地为人的双特异性单链抗体与所述片段的结合。而对至少一些本发明的优选地为人的双特异性单链抗体而言，在所述片段C-末端的两个氨基酸残基T(位置23的苏氨酸)和I(位置25的异亮氨酸)降低对本发明的优选地为人的双特异性单链抗体的结合能。

出乎意料地，已经发现这种分离的优选地为人的双特异性单链抗体不仅识别人CD3ε的N-末端片段，还识别各种灵长类CD3ε的相应同源片段，所述灵长类包括新世界猴(狨猴(Marmoset)、普通狨猴；绒顶柽柳猴；松鼠猴)和旧世界猴(食蟹猕猴，也称为食蟹猴(Cynomolgus monkey)；或普通猕猴，也称为恒河猴。因此，检测到本发明的双特异性单链抗体的多灵长类特异性。以下序列分析证实了人和灵长类在CD3ε的细胞外结构域的N-末端具有高度同源的序列段。

上述CD3ε的N-末端片段表示为SEQ ID No.2(人)、SEQ ID No.4(普通狨猴)、SEQ ID No.6(绒顶柽柳猴)、SEQ ID No.8(松鼠猴)、SEQ ID No.2225 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC或SEQ ID No.2226 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT(食蟹猕猴，也称为食蟹猴)和SEQ ID No.2227 QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT(普通猕猴，也称为恒河猴)。

在本发明的一个实施方式中，本发明的PSCAxCD3双特异性单链抗体的第二结合域与前列腺干细胞抗原(PSCA)结合。在可选择地实施方式中，所述第二结合域与CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白(CD248)、EpCAM、FAPα或IGF-1R结合。如以下实施例所示，本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的第二结合域与由EpCAM基因的外显子2编码的EpCAM的EGF样结构域1的氨基酸残基26-61结合。所述人EpCAM的EGF样结构域1的氨基酸残基26-61表示为SEQ ID NO.571。因此，本发明的针对EpCAM的双特异性单链分子形成了EpCAM-结合分子的特有的自身类别，该类别明显不同于基于之前描述的EpCAM-结合物HD69的EpCAM-结合分子。所述EpCAM-结合物HD69与不同表位(即不位于人EpCAM的EGF样结构域1中的表位)结合。

优选地，PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的第二结合域与人PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)或非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合；更优选地，其与人PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)和非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合并因此是种间特异性的；甚至更优选其与人PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)和猕猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合(并因此也是种间特异性的)。尤其优选地，猕猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)是食蟹猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)和/或恒河猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)。应该理解，本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的第二结合域优选与由非黑猩猩灵长类EpCAM基因的外显子2编码的非黑猩猩灵长类EpCAM的EGF样结构域1结合。如上所述，非黑猩猩灵长类EpCAM优选是猕猴EpCAM，更优选是食蟹猴EpCAM和/或恒河猴EpCAM。

然而，第二结合域还可以与其他物种的PSCA(分别是CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)同源物结合，例如与黑猩猩PSCA(分别是CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)或啮齿动物PSCA(分别是CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)同源物结合，这并没有被排除在本发明的范围之外。

应该理解，在优选的实施方式中，本发明抗体的第一结合域和第二结合域的种间特异性是相同的。

前列腺癌是男性的第二大癌症。2008年，在美国估计有186,320位男性将被新诊断为前列腺癌，并且约28,660位男性将死于此病(参见，例如http://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate)。前列腺癌的风险与年龄高度相关：在50岁以下男性中在案的男性病例非常少，四分之三的病例出现在大于65岁的男性中。诊断出病例数量最高的是70-74岁的男性。当前，老年人口的增长速度显著高于总人口的增长速度。到2025-2030年，规划表明大于60岁的人口将快速增长，为总人口的3.5倍。规划在下半个世纪全世界老年人的比例将大于2倍，这意味着经诊断的前列腺癌发病率将进一步提高。然而，PSCA并不仅是前列腺癌靶标。确实，PSCA过表达也发现于膀胱癌(Amara等，Cancer Res 61(2001)：4660-4665)和胰腺癌(Argani等，Cancer Res 61(2001)：4320-4324)。基于以上，本发明的PSCAxCD3双特异性单链抗体提供了用于杀死包括但不限于人前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌的表达PSCA的癌细胞的有利工具。如以下实施例所示，本发明的PSCAxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的细胞毒活性。

有利的是，本发明还提供了包含结合人PSCA和猕猴PSCA同源物(即非黑猩猩灵长类的同源物)的第二结合域的PSCAxCD3双特异性单链抗体。在优选的实施方式中，所述双特异性单链抗体由此包含显示对人和非黑猩猩灵长类前列腺干细胞抗原(PSCA)的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。换而言之，同一分子可用在临床前的动物研究中和在人体内的临床研究中。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的PSCAxCD3双特异性单链抗体的CD3和PSCA结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

CD19是仅有B淋巴细胞和造型系统的滤泡树突细胞表达的细胞表面分子。它是要表达的最早的B-谱系限制性抗原，并且存在于多数前B细胞和多数非T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞和B细胞型慢性淋巴细胞性白血病细胞上。

在优选的实施方式中，本发明的双特异性单链抗体包含显示对人和非黑猩猩灵长类CD19的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的CD19xCD3双特异性单链抗体的CD3和CD19结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

如本文以上所述，编码用于肝细胞生长因子(HGF)和分散因子(SF)的受体酪氨酸激酶(PTK)的MET致癌基因控制导致细胞生长、侵袭和保护免受凋亡的遗传程序。如以下实施例所示，本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体因此提供了用于杀死以人C-MET阳性乳腺癌细胞系MDA-MB-231为例的表达C-MET的癌细胞的有利工具。本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的细胞毒活性。由于优选地，本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体的CD3和C-MET结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类的抗原都反应，因此本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

有利的是，本发明还提供了另外的可选实施方式，即包含结合人C-MET和猕猴C-MET同源物(即非黑猩猩灵长类的同源物)的第二结合域的C-METxCD3双特异性单链抗体。在优选的实施方式中，所述双特异性单链抗体由此包含显示对人和非黑猩猩灵长类C-MET的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。换而言之，同一分子可用在临床前的动物研究中和在人体内的临床研究中。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体的CD3和C-MET结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类的抗原都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

血管生成，即形成新毛细血管，对于许多重要的生理事件(正常的和病理的)都是必须的。最近，由于血管生成抑制剂在控制实体肿瘤中的潜在治疗价值，增加的注意力集中于该过程的抑制剂的增殖和表征。由于其在正常组织中的局限性分布和在许多不同类型的实体肿瘤的肿瘤内皮细胞上的大量表达，内皮唾液酸蛋白可被用作癌症的基于抗体抗血管生成的治疗策略的靶标。特别地，靶向肿瘤内皮细胞而非癌细胞的优点是在肿瘤血管的未转化内皮细胞上的靶向表达(target expression)比在遗传上不稳定的癌细胞上的靶向表达更稳定。本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体提供了用于抑制实体肿瘤内新毛细血管的形成的有利工具，新形成的毛细血管在支持肿瘤生长中发挥重要作用。在这种新的且具创造性的治疗方法中，靶向的不是肿瘤细胞而是肿瘤血管。本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体将细胞毒性T细胞募集至肿瘤中的内皮唾液酸蛋白阳性内皮细胞，引起肿瘤中表达内皮唾液酸蛋白的内皮细胞消除，其中所述肿瘤包括但不限于癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)、肉瘤和神经外胚层肿瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)。通过这种方式，肿瘤血管生成得到抑制，从而引起肿瘤消退或者甚至是消除。如以下实施例所示，本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的活性。由于实体肿瘤(solid neoplasm)的生长需要募集支持性血管，本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于靶向并杀死肿瘤内皮细胞的新型且具创造性的方法。

有利的是，本发明还提供了包含结合人内皮唾液酸蛋白和猕猴内皮唾液酸蛋白同源物(即非黑猩猩灵长类的同源物)的第二结合域的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体。在优选的实施方式中，所述双特异性单链抗体由此包含显示对人和非黑猩猩灵长类内皮唾液酸蛋白的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。换而言之，同一分子可用在临床前的动物研究中和在人体内的临床研究中。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体的CD3和内皮唾液酸蛋白结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

最近发现EpCAM在所谓的“肿瘤干细胞”上表达(Dalerba等，PNAS 104(2007)，10158-63；Dalerba等，Ann.Rev.Med.58(2007)，267-84)。因此，本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体不仅提供了用于杀死上皮癌或微量残留癌(minimal residual cancer)中表达EpCAM的癌细胞，还可以用于除去在治疗后引起肿瘤复发的可能根源(culprit)。此外，本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的细胞毒活性。

在优选的实施方式中，本发明的双特异性单链抗体包含显示对人和非黑猩猩灵长类EpCAM的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的CD3和EpCAM结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体提供了用于攻击实体肿瘤(例如上皮瘤)的基质的有利工具，其中所述基质在肿瘤的支持性生长和新血管生成中发挥主要作用。在这种新的且具创造性的治疗方法中，靶向的不是肿瘤细胞而是活化的基质成纤维细胞。之前的研究表明，包括大于90％的原发性和恶性乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌在内的大多数常规类型的上皮癌都含有丰富的FAPα-活性基质成纤维细胞(Scanlan等，PNAS 91(1994)，5657-5661和本文引用的文献)。相反，正常组织以及良性和前癌性上皮病灶仅含有很少的FAPα-阳性基质细胞。本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体将细胞毒性T细胞募集至原发性和恶性上皮瘤中的FAPα-阳性活化基质成纤维细胞，导致来自肿瘤的基质细胞被消除。特别地，靶向肿瘤基质细胞而非癌细胞的优点是在未转化基质细胞上的靶向表达(target expression)比在遗传上不稳定的癌细胞上的靶向表达更稳定。如以下实施例所示，本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的活性。由于实体肿瘤的生长需要募集支持性基质，本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于靶向并杀死肿瘤基质的新型且具创造性的方法。

有利的是，本发明还提供了包含结合人FAPα和猕猴FAPα同源物(即非黑猩猩灵长类的同源物)的第二结合域的FAPαxCD3双特异性单链抗体。在优选的实施方式中，本发明的双特异性单链抗体因此包含显示对人和非黑猩猩灵长类FAPα的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。换而言之，同一分子可用在临床前的动物研究中和在人体内的临床研究中。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体的CD3和FAPα结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

如以上所述，IGF-1R是具有酪氨酸激酶活性的受体(并因此是细胞表面抗原)，与胰岛素受体IR具有70％的同源性。IGF-1R在多种肿瘤和肿瘤系中表达，IGF通过其与IGF-1R的结合提高肿瘤生长。

在优选的实施方式中，本发明的双特异性单链抗体包含显示对人和非黑猩猩灵长类IGF-1R的种间特异性的第二结合域。在这种情况下，同一双特异性单链抗体分子可用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并作为用于人的药物。这产生高度可比的结果，并且与物种特异性替代分子相比动物研究的预测效力远远增加。由于本发明的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体的CD3和IGF-1R结合域都是种间特异性的，即与人和非黑猩猩灵长类都反应，因此其能够用于在灵长类中临床前评价这些结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学状况，并且以同样的形式作为用于人的药物。

已经发现，本发明可以产生优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体，其中同一分子可用于临床前动物实验以及临床研究，甚至是用于人治疗中。这是由于优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的意料不到的鉴定，所述抗体除了分别与人CD3ε和PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合(并且由于遗传相似性而可能与黑猩猩对应物结合)外，还与包括新世界猴和旧世界猴在内的非黑猩猩灵长类的所述抗原的同源物结合。如以下实施例所示，本发明的所述优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体可以用作对抗包括但不限于癌症的多种疾病的治疗剂或药物。

所述PSCAxCD3双特异性单链抗体对于前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌的治疗尤其有利。

本发明的所述优选人的CD19xCD3双特异性单链抗体可以用作对抗多种疾病的治疗剂，所述疾病包括但不限于癌症，优选B细胞恶性病如非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自免疫疾病或B细胞的去除。

本发明的所述优选人的c-METxCD3双特异性单链抗体可以用作对抗多种疾病的治疗剂，所述疾病包括但不限于癌症(cancer)，优选癌(carcinoma)、肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、肾母细胞瘤或造血系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

本发明的所述优选人的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体提供了用于靶向并杀死包括(但不限于)癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤和神经外胚层肿瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)的肿瘤内皮的新的且具创造性的方法。本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体可以使实体肿瘤丧失支持性血管，由此抑制所述瘤的血管生成和随后的生长。

本发明的所述优选人的EpCAMxCD3双特异性单链抗体可以用作对抗多种疾病的治疗剂，所述疾病包括但不限于癌症，优选上皮癌。

本发明的所述优选人的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体能够用作对抗多种疾病的治疗剂，所述疾病包括但不限于癌，优选骨癌或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。本发明的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体能够用作对抗自免疫疾病，优选银屑病的治疗剂。

根据上文，构建用于测试系统发育的物种间距离(与人)的替代性PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的需要不复存在。因此，可以将期望在临床试验中施用于人随后批准上市并作为治疗性药物施用的同一分子用在临床前动物实验中。在临床前动物试验和随后人体施用中使用同一分子的能力基本消除了或者至少大幅减少了在临床前动物实验中获得的数据对人病例的有限适用性的危险。简而言之，使用实际上将施用于人的同一分子在动物中获得的临床前安全性数据能够保证该数据对与人相关的情况的适用性。相反，在传统方法中试验替代分子，所述替代分子必须针对用于临床前安全性评价的动物实验系统进行分子改造。因此，用于人体治疗的分子实际上在序列上并且还可能在结构上不同于在药动参数和/或生物活性的临床前试验中使用的替代分子，后果是在临床前动物实验中获得的数据在人体情况下的适应性/可转移性受限。使用替代分子需要构建、生产、纯化和表征全新的结构。这产生了用于获得该分子所必需的额外的开发成本和时间。总之，除了实际用于人体治疗的药物外还必需独立开发替代物，由此必需进行用于两种分子的两个开发线。因此，本文所述的种间特异性的本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的主要优点是所述同一分子可以用于人体的治疗和临床前动物实验。

如下文更详细描述的，优选本发明的双特异性单链抗体的所述第一或第二结合域中的至少一个是CDR-移植的(CDR-grafted)、人源化的或人的。优选地，本发明的双特异性单链抗体的所述第一和第二结合域均是CDR-移植的、人源化的或人的。对于本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体，最大可能性地排除了向人患者施用所述分子时针对所述结合分子的免疫反应的产生。

本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的另一个主要优点是其对多种灵长类中的临床前试验的适应性。候选药物在动物中的行为应该从理想上表现该候选药物在施用于人时的预期行为。因此，由这种临床前试验获得的数据应由此对人的情况具有高预测力。然而，如从最近关于TGN1412(CD28单克隆抗体)的I期临床试验的惨痛结果认识到的，候选药物在灵长类物种和人中可能作用不同：尽管在所述抗体的临床前测试中在用食蟹猴进行的动物研究中已观察到无或仅有有限的副作用，但是六个人患者在施用所述抗体后产生了多器官衰竭(Lancet 368(2006)，2206-7)。这些不期望的明显的反面事件的结果表明，将临床前试验限于仅一种(非黑猩猩灵长类)物种可能并不足够。本发明的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体与一系列新世界和旧世界猴结合的事实可能有助于克服上述情况所面临的问题。因此，本发明提供在开发和测试人治疗药物时将物种效应差异最小化的手段和方法。

使用本发明的优选人的种间特异性PSCAxCD3(分别是CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体，也不再需要使试验动物适应于旨在施用于人的候选药物，例如，产生转基因动物。本发明的优选人的PSCAxCD3(分别是CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体根据本发明的应用和方法展现出种间特异性，可直接用于非黑猩猩灵长类临床前试验，且不需要对动物的任何遗传操纵。如本领域技术人员公知的，使测试动物适应于候选药物的方法通常具有在临床前安全性试验中获得的结果由于动物的改变而对人具有较少的代表性和预测性的风险。例如，在转基因动物中，转基因编码的蛋白通常高度过表达。因此，获得的针对该蛋白抗原的抗体的生物活性数据对于所述蛋白在其中以低得多的、更生理水平表达的人的预测价值可能是有限的。

使用显示种间特异性的本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的进一步优点是避免了作为濒危物种的黑猩猩用于动物试验的事实。黑猩猩与人的亲缘关系最近，且最近根据基因组测序数据将其归类于人科动物(Wildman等，PNAS 100(2003)，7181)。因此用黑猩猩获得的数据通常被认为对于人具有高度预测性。然而，因为其作为濒危物种的状态，可用于医学实验的黑猩猩的数量是高度受限的。因此，如上所述维持黑猩猩用于动物试验既成本既高又存在伦理问题。使用本发明本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体避免了临床前试验期间的伦理异议和经济负担，且不妨碍所获得的动物试验数据的质量，即适用性。因此，使用本发明本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体为在黑猩猩中进行的研究提供了合理的替代方案。

本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的进一步优点是在使用其作为动物临床前试验的一部分时，例如在药物代谢动力学动物研究过程中，抽取多个血液样品的能力。与以较低等动物例如小鼠相比，使用非黑猩猩灵长类能够更容易地获得多个血液抽取物。多个血液样品的抽取允许连续测试血液参数以确定由本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体诱导的生物效应。此外，多个血液样品的抽取使研究者能够评价如上定义的本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的药物代谢动力学状况。此外，可能由所述优选人的本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体诱导的反映在血液参数里的潜在副作用可在施用所述抗体期间抽取的不同血液样品中测量。这允许测定本文定义的本发明的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的潜在毒性状况。

显示种间特异性的本文定义的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体的优势可简要概括如下：

第一，用于临床前试验的本文定义的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体与用于人治疗的抗体是相同的。因此，不再需要开发药物代谢动力学性质和生物活性可能不同的两种独立的分子。这是非常有利的，因为例如，与常规的替代物方法相比药物代谢动力学结果更直接地转移和应用于人情况。

第二，与替代物方法相比，使用本文定义的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体制备人治疗剂所需成本和劳力较低。

第三，本文定义的优选人的PSCAxCD3(分别为CD19xCD3、C-METxCD3、内皮唾液酸蛋白xCD3、EpCAMxCD3、IGF-1RxCD3或FAPαxCD3)双特异性单链抗体可用于不仅在一种灵长类物种中，而且在一系列不同的灵长类物种中的临床前试验，从而限制了灵长类和人之间潜在的物种差异的风险。

第四，如果需要，能够避免把濒危物种黑猩猩用于动物测试。

第五，可抽取多个血液样品用于大规模的药物代谢动力学研究。

第六，因为根据本发明优选实施方式的优选为人的结合分子是人来源，当施用于人患者时，针对所述结合分子产生的免疫反应被最小化。排除了对来自非人物种(如小鼠)的候选药物特异性抗体产生免疫应答的诱导，所述诱导导致产生针对鼠来源的治疗分子的人抗小鼠抗体(HAMA)。

最后但并非最不重要的是：

●本发明的PSCAxCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于包括但不限于前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌的癌症的新的且具创造性的治疗方法。以下实施例清楚地证明了各个构建体的对抗PSCA阳性细胞的人和猕猴效应细胞细胞毒活性的有效募集。

●本发明的CD19xCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于癌症，优选优选B细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自体免疫疾病或B细胞的消除的新的且具创造性的治疗方法。如以下实施例所示，本发明的CD19xCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的活性。

●本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于癌症，优选癌、肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、肾母细胞瘤或造血系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤的新的且具创造性的治疗方法。如以下实施例所示，本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的活性。

●本发明的所述内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于靶向并杀死包括(但不限于)癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤和神经外胚层肿瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)的肿瘤内皮的新的且具创造性的方法。本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体可以使实体肿瘤丧失支持性血管，由此抑制所述瘤的血管生成和随后的生长。

●本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于癌症，优选上皮癌和/或微量残留癌的新的且具创造性的治疗方法。本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体不仅提供了用于杀死癌症中，优选上皮癌或微量残留癌中表达EpCAM的癌细胞，还可以用于除去在治疗后引起肿瘤复发的可能根源。此外，本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活性高于本领域描述的抗体的细胞毒活性。

●本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于靶向并杀死肿瘤基质的新的且具创造性的方法。本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体攻击实体肿瘤(例如上皮瘤)的支持性基质，由此抑制实体肿瘤的生长和新血管生成。

●本发明的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体的治疗性应用提供了用于癌症(优选骨癌或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌)或自体免疫疾病(优选银屑病)的新的且具创造性的方法。

如上文所述的，本发明提供了多肽，即双特异性单链抗体，其包含能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域和能够与PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合的第二结合域，其中所述第二结合域优选地还与人和非黑猩猩灵长类的PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合。双特异性单链抗体分子作为满足本发明的优选双特异性单链抗体的需求的候选药物的优点是这种分子在临床前动物试验中以及在临床研究中并且甚至在人治疗中的用途。在本发明的种间特异性单链抗体的优选实施方式中，与细胞表面抗原结合的第二结合域是人的。在本发明的种间特异性双特异性分子中，与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链表位结合的结构域以VH-VL或VL-VH的顺序位于双特异性分子的N-末端或C-末端。在第一结合域和第二结合域中VH和VL链以不同排列形式存在的本发明的种间特异性双特异性分子的实例描述于所附的实施例。

本文所用的“双特异性单链抗体”指的是包括两个结合域的单多肽链。每个结合域包括来自抗体重链的一个可变区(“VH区”)，其中所述第一结合域的VH区特异性地与CD3ε分子结合，而所述第二结合域的VH区特异性地与PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα结合。所述两个结合域任选地由短多肽间隔区彼此连接。多肽间隔区的非限制性实例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G-G-G-G-S)和其重复。每个结合域可另外包括来自抗体轻链的一个可变区(“VL区”)，在第一结合域和第二结合域各自中的VH区和VL区由多肽连接子彼此连接，例如EP 623679 B1中公开和要求保护的类型的多肽连接子，但所述多肽连接子在任何情况下都足够长以允许第一结合域的VH区和VL区与第二结合域的VH区和VL区彼此配对，以使它们一起能够特异性地与对应的第一结合域和第二结合域结合。

术语“蛋白”或“蛋白质”是本领域公知的，并且描述生物化合物。蛋白包含一个或多个氨基酸链(多肽)，其中氨基酸经由肽键彼此结合。本文所用的术语“多肽”描述由多于30个氨基酸组成的一组分子。本发明的多肽组包括“蛋白”，只要该蛋白由单个多肽链组成。并且与所述定义一致，术语“多肽”描述蛋白片段，只要这些片段由多于30个氨基酸组成。多肽可进一步形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可为相同或不相同的。因此，这种多聚体的相应的更高级结构称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。异多聚体(hereteromultimer)的一个实例是抗体分子，其在天然存在形式下由两条相同的多肽轻链和两条相同的多肽重链组成。术语“多肽”和“蛋白”还指天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰通过例如翻译后修饰如糖基化、乙酰化和磷酸化等实现。这种修饰是本领域熟知的。

本发明的术语“结合域”表征与给定靶结构/抗原/表位特异性结合/相互作用的多肽的结构域。因此，结合域是“抗原相互作用位点”。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义多肽的基序，其能够与特异性抗原或特异性抗原组，例如不同物种中的相同抗原特异性地相互作用。所述结合/相互作用还理解为定义“特异性的识别”。根据本发明，术语“特异性地识别”是指抗体分子能够与抗原(如本文定义的人CD3抗原)的至少两个，优选至少三个，更优选至少四个氨基酸特异性相互作用和/或结合。这种结合可通过“锁钥原则”的特异性来例示。因此，作为其一级、二级或三级结构的结果以及所述结构二级修饰的结果，结合域的氨基酸序列中的特异性基序与抗原彼此结合。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，例如因为抗原构象改变、抗原寡聚化等的诱导作用等，结合域/抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也可能导致信号的启动。本发明的结合域的一个优选实例是抗体。结合域可为单克隆或多克隆抗体或源自单克隆或多克隆抗体。

术语“抗体”包括仍保留结合特异性的衍生物或其功能片段。产生抗体的技术是本领域熟知的并描述于，如，Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，冷泉港实验室出版社，1988，以及Harlow和Lane“Using Antibodies：A Laboratory Manual”冷泉港实验室出版社，1999。术语“抗体”还包括不同类的免疫球蛋白(Ig)(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(例如IgG1、IgG2等)。

术语“抗体”的定义还包括诸如嵌合、单链和人源化抗体以及抗体片段尤其是如Fab片段的实施方式。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab′)₂、Fv、scFv片段或单结构域抗体、单可变结构域抗体或仅包含一个可变结构域的免疫球蛋白单可变结构域，该可变结构域可以为独立于其它V区或结构域而特异性地结合抗原或表位的VH或VL；参见，Harlow和Lane(1988)和(1999)，上述引文。这种免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离的抗体单可变结构域多肽，还包括更大的多肽，该多肽包含抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。

各种方法都是本领域已知的并可用于产生这种抗体和/或片段。因此，可通过模拟肽来产生(抗体)衍生物。此外，描述单链抗体生产的技术(尤其参见美国专利4,946,778)可适于产生对所选多肽具有特异性的单链抗体。而且，可利用转基因动物表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。为了制备单克隆抗体，可使用提供由连续细胞系培养物所产生的抗体的任何技术。这种技术的实例包括杂交瘤技术(和Milstein Nature 256(1975)，495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。在BIAcore系统中所用的表面等离子体共振可用于提高与靶多肽，例如CD3ε、PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα的表位结合的噬菌体抗体的效力(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。在本发明中还认为，术语“抗体”包括可在下文所述的宿主中表达的抗体构建体，例如可通过尤其是病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。

本发明使用的术语“特异性相互作用”是指结合域与多肽不产生或不显著产生交叉反应，其中所述多肽具有与那些被结合域结合的多肽相似的结构，且可能由与表达目标多肽的细胞相同的细胞表达。可测试一组被研究的结合域的交叉反应性，例如通过评估所述组的结合域在常规条件下的结合(参见，例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社，1988和Using Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社，1999)。结合域与特异性抗原的特异性相互作用的实例包括配体对其受体的特异性。所述定义尤其包括配体的相互作用，其中所述配体与其特异性受体结合时诱导信号。还尤其包括于该定义中的所述相互作用的实例为抗原决定簇(表位)与抗体的结合域(抗原结合位点)的相互作用。

本文所用的术语“种间特异性”或“跨种特异性”是指本文所述的结合域与人和非黑猩猩灵长类中相同的靶分子的结合。因此，“种间特异性”或“跨种特异性”应理解为对不同物种中表达的同一分子“X”(即同源物)但不对除了“X”以外的分子的种间反应性。识别如人CD3ε的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类CD3ε如猕猴CD3ε的种间特异性可例如由FACS分析确定。以以下方式进行FACS分析：测试相应的单克隆抗体与分别表达所述人和非黑猩猩灵长类CD3ε抗原的人和非黑猩猩灵长类细胞如猕猴细胞的结合。合适的测定显示于以下实施例。经过适当修改，以上提及的主题适用于PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R和FAPα抗原：可以通过，例如FACS确定识别例如人PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类的PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα(例如猕猴PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)的种间特异性。以以下方式进行FACS分析：测试相应的单克隆抗体对分别地表达所述人和非黑猩猩灵长类PSCA(CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)抗原的人和非黑猩猩灵长类细胞如猕猴细胞的结合。

本文所用的CD3ε是指作为T细胞受体的一部分表达的分子，并具有现有技术中通常描述的含义。在人中，其包括单独或独立组合形式的所有已知CD3亚基，例如CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、CD3α和CD3β。本文所指的非黑猩猩灵长类的非人CD3抗原是，例如，食蟹猕猴CD3和普通猕猴CD3。在食蟹猕猴中，其包括CD3εFN-18阴性和CD3εFN-18阳性、CD3γ和CD3δ。在普通猕猴中，其包括CD3ε、CD3γ和CD3δ。优选地，本文所用的所述CD3是CD3ε。

人CD3ε表示为GenBank登录号NM_000733，并包括SEQ ID NO.1。人CD3γ表示为GenBank登录号NM_000073。人CD3δ表示为GenBank登录号NM_000732。

食蟹猕猴的CD3ε“FN-18阴性”(即因为上述多态性而不被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)表示为GenBank登录号AB073994。

食蟹猕猴的CD3ε“FN-18阳性”(即被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)表示为GenBank登录号AB073993。食蟹猕猴的CD3γ表示为GenBank登录号AB073992。食蟹猕猴的CD3δ表示为GenBank登录号AB073991。

可由本领域中描述的重组技术鉴定和分离普通猕猴的各CD3ε、γ和δ同源物的核酸序列和氨基酸序列(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；冷泉港实验室出版社，第3版，2001)。经适当修改，这可适用于本文定义的其它非黑猩猩灵长类的CD3ε、γ和δ同源物。在所附的实施例中描述了普通狨猴、松鼠猴和绒顶柽柳猴的氨基酸序列的鉴定。普通狨猴的CD3ε细胞外结构域的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：3中，绒顶柽柳猴的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：5中，松鼠猴的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：7中。

人PSCA表示为GenBank登录号NM_005672。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.444和443。猕猴的PSCA同源物的克隆显示于以下实施例中，相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.446和445。

人CD19表示为GenBank登录号NM_001770。在该序列信息的基础上，本领域技术人员可能不需要任何创造性劳动就可以克隆(和表达)猕猴CD19分子。例如，以GenBank登录号NM_001770表示的人CD19 cDNA或其片段可以用作杂交探针，以在适当的杂交条件下筛选猕猴cDNA文库(例如食蟹猴或恒河猴的cDNA文库)。分子生物学的重组技术和筛选方法(包括杂交方法)描述于，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；冷泉港实验室出版社，第3版，2001。

人C-MET表示为GenBank登录号NM_000245。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.776和777。猕猴的C-MET同源物的克隆显示于以下实施例中，相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.788和789。

人内皮唾液酸蛋白表示为GenBank登录号NM_020404。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.913和914。猕猴的内皮唾液酸蛋白同源物的克隆显示于以下实施例中，相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.915和916。

人EpCAM表示为GenBank登录号NM_020404。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.1029和1028。如以下实施例所示，本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体的第二结合域与位于由EpCAM基因的外显子2编码的EpCAM的EGF样结构域1的氨基酸残基26-61中的表位结合。人EpCAM的EGF样结构域1的所述氨基酸残基26-61表示为SEQ ID NO.1130。在该序列信息的基础上，本领域技术人员可能不需要任何创造性劳动就可以克隆(和表达)猕猴EpCAM分子。例如，以GenBank登录号NM_002354表示的人EpCAM cDNA或其片段可以用作杂交探针，以在适当的杂交条件下筛选猕猴cDNA文库(例如食蟹猴或恒河猴的cDNA文库)。分子生物学的重组技术和筛选方法(包括杂交方法)描述于，例如Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual；冷泉港实验室出版社，第3版，2001。

人FAPα表示为GenBank登录号NM_004460。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.1149和1150。猕猴的FAPα同源物的克隆显示于以下实施例中，相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.1151和1152。

人IGF-1R表示为GenBank登录号NM_000875。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.1988和1989。猕猴IGF-1R的编码序列公开于GenBank(登录号XM_001100407)。相应的cDNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO.1998和1999

与上述一致，术语“表位”定义抗原决定簇，其被本文定义的结合域特异性地结合/鉴定。结合域可特异性地与构象表位或连续表位结合/相互作用，这对靶结构如人和非黑猩猩灵长类CD3ε链或人和非黑猩猩灵长类PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα是独特的。多肽抗原的构象或不连续表位表征为两个或更多个不连续的氨基酸残基的存在，其中所述氨基酸残基在一级序列中是分开的，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时在分子表面上聚集(Sela，(1969)Science 166，1365和Laver，(1990)Cell 61，553-6)。对表位有贡献的两个或更多个不连续的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的分开的部分上。当所述多肽链折叠为三维结构以构成表位时，这些残基在分子表面上聚集。相反，连续表位或线性表位由两个或更多个不连续的氨基酸残基组成，其中所述氨基酸残基存在于多肽链的单个线性区段中。本发明中，“背景依赖性”CD3表位是指所述表位的构象。位于CD3ε链的这种背景依赖性表位，仅当被埋入ε链的其余部分中且由ε链与CD3γ或δ链异二聚化而保持在正确位置时，可产生其正确构象。相反，本文提供的背景独立的CD3表位是指CD3ε的N-末端1-27个氨基酸残基多肽或其功能片段。当脱离在CD3复合体中的天然环境时，这种N-末端1-27个氨基酸残基多肽或其功能片段保持其三维结构的完整性和正确构象。因此，作为CD3ε细胞外结构域的一部分的N-末端1-27个氨基酸残基多肽或其功能片段的背景独立性，代表与WO 2004/106380中关于制备人结合分子的方法描述的CD3ε表位完全不同的表位。所述方法使用单独表达的重组CD3ε。这种单独表达的重组CD3ε的构象不同于其天然形式中采用的构象，即，其中TCR/CD3复合体的CD3ε亚基作为与TCR/CD3复合体的CD3δ或CD3γ亚基的非共价复合体的一部分存在的形式。当这种单独表达的重组CD3ε蛋白用作从抗体文库选择抗体的抗原时，从该文库鉴定出对这种抗原的特异性抗体，不过这种文库不包含对自体抗原/自身抗原具有特异性的抗体。这是因为以下事实：单独表达的重组CD3ε蛋白不存在于体内；其不是自身抗原。因此，表达对于该蛋白特异性的抗体的B细胞亚群在体内未被去除；从这种B细胞构建的抗体文库将含有对单独表达的重组CD3ε蛋白具有特异性的抗体的遗传物质。

然而，由于背景独立的N-末端1-27个氨基酸残基多肽或其功能片段是以其天然形式折叠的表位，基于WO 04/106380中描述的方法的方法不能鉴定出符合本发明的结合域。因此，在试验中可证明WO 2004/106380中公开的结合分子不能与CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸残基激活。因此，常规抗CD3结合分子或抗CD3抗体分子(例如WO 99/54440中公开的)在CD3ε链的结合位置比本文提供的背景独立的N-末端1-27个氨基酸残基多肽或功能片段距C-末端更近。现有技术抗体分子OKT3和UCHT-1在氨基酸残基35至85之间也具有对TCR/CD3复合体的ε亚基的特异性，且因此这些抗体的表位也是距C-末端更近。此外，UCHT-1与CD3ε链在氨基酸残基43至77之间的区域结合(Tunnacliffe，Int.Immunol.1(1989)，546-50；Kjer-Nielsen，PNAS 101，(2004)，7675-7680；Salmeron，J.Immunol.147(1991)，3047-52)。因此，现有技术的抗CD3分子不结合于且不直接针对本文定义的背景独立的N-末端1-27个氨基酸残基表位(或其功能片段)。特别地，现有技术不能提供与背景独立的N-末端1-27个氨基酸残基表位特异性结合且具有种间特异性(即与人和非黑猩猩灵长类的CD3ε结合)的抗CD3分子。

为了产生包含在本发明的双特异性单链抗体分子中的优选人的结合域，可以使用例如与人和非黑猩猩灵长类CD3ε(例如猕猴CD3ε)结合的单克隆抗体，或者与人和/或非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合的单克隆抗体。

本文所用的“人”和“人类”是指智人(Homo sapiens)种。就本文所述的构建体的医学应用而言，人患者将以相同分子治疗。

优选本发明的双特异性单链抗体的所述第一或第二结合域中至少之一是CDR-移植的、人源化的或人的。优选地，本发明的双特异性单链抗体的所述第一和第二结合域都是CDR-移植的、人源化的或人的。

本文使用的术语“人”抗体理解为表示本文定义的双特异性单链抗体包含人种系抗体库(germline antibody repertoire)中包含的氨基酸序列。出于本文定义的目的，如果双特异性单链抗体由人种系氨基酸序列组成，即如果所考虑的双特异性单链抗体的氨基酸序列与所表达的人种系氨基酸序列相同，可以由此认为所述双特异性单链抗体是人的。如果本文所定义的双特异性单链抗体由源自其最接近的人种系序列(该序列不高于由于体细胞高度突变的特性所预期的)组成，也可以认为所述双特异性单链抗体是人的。此外，许多非人哺乳动物，例如诸如小鼠和大鼠的啮齿动物的所述抗体包含预期也可存在于所表达的人抗体储库中的VH CDR3氨基酸序列。出于本发明的目的，任何预期可存在于所表达的人储库中的人或非人来源的此种序列也都被认为是“人的”。

本文使用的术语“人源化的”、“人源化”、“人样的”(与人似的)或其在语法上相关的任何变式都可交换地用以表示在其至少一个结合域中包含至少一个非人抗体或其片段的互补决定区(“CDR”)的双特异性单链抗体。人源化方法描述于，例如WO 91/09968和US 6,407,213中。作为非限制性实例，所述术语包括至少一个结合域的可变区包含单个CDR区，例如来自另一种非人动物(例如啮齿动物)的VH的第三CDR区(CDRH3)的情况，以及一个或两个可变区在其各个相应的第一、第二和第三CDR都包含来自所述非人动物的CDR的情况。在所述双特异性单链抗体的结合域的所有CDR都被其相应的来自例如啮齿动物的相应等同物代替的情况下，通常将其称为“CDR-移植”，并且该术语应理解为包括在本文使用的术语“人源化”或其在语法上相关的变式中。术语“人源化”或其在语法上相关的变式还包括以下情况，在该情况下除了第一和/或第二结合域的VH和/或VL内的一个或多个CDR区的替代外，CDR之间框架(“FR”)区内的至少一个单个氨基酸残基的进一步突变(例如取代)也受到影响，从而使在该/这些位置的氨基酸对应于用于替代的CDR区所来源的动物中所述位置的氨基酸。如本领域所知，为了恢复用作CDR-供体的非人抗体对其靶分子的原始结合亲合力，这些单独突变通常在CDR-移植之后在框架区进行。除了上述框架区内的氨基酸取代外，术语“人源化”可以进一步包括将来自非人动物的CDR区内的氨基酸取代为人抗体的相应CDR区的氨基酸。

如本文所使用的，术语“同源物”或“同源性”应理解为：蛋白质和DNA中的同源性通常是在序列相似性(尤其是生物信息学上)的基础上作出的结论。例如，通常如果两个或更多个基因具有高度相似的DNA序列，则它们可能是同源的。但序列相似性可能产生于不同的祖先：短序列可能偶然相似，并且由于选择的两个序列与特定的蛋白(例如转录因子)结合因此这些序列可能是相似的。这些序列相似但不同源。同源的序列区也被称为是保守的。这不混同于氨基酸序列的保守性，在氨基酸序列的保守性中，具体位置的氨基酸已经改变但所述氨基酸的物理-化学性质保持不变。同源性序列为两种类型：直向同源的和共生同源的。如果序列被物种形成事件分开则同源序列是直向同源的：当物种分化(diverge)成两个独立的物种，在所形成的物种中单个基因的分化拷贝被称为是直向同源的。直向同源性或直向同源基因是由于源自共同的祖先而彼此类似的不同物种中的基因。两个类似基因为同源直向的最有力证据是基因谱系的系统进化分析。在一个进化枝中发现的基因是进化自同一祖先的同源直向基因。同源直向物通常，但不总是具有相同的功能。同源直向序列为生物体的分类学分级研究提供了有用信息。遗传分化图谱可用于探索生物体的相关性。高度紧密相关的两个生物体可能在两个直向同源物之间显示非常相似的DNA序列。相反，在遗传上从另一个生物体进一步移出的生物体在所研究的直向同源物的序列上可能显示较高的分化性。如果同源序列被基因复制事件分开，则所述同源序列为共生同源的：如果生物体的基因被复制以在同一基因组内占据两个不同的位置，则这两个拷贝为共生同源的。共生同源的一组序列被称为彼此共生同源物。共生同源物通常具有相同或类似的功能，但在以下情况下可能不具有相同或类似的功能：由于缺乏对所复制的基因的一个拷贝的原始选择压力，该拷贝自由突变并获得新功能。实例可见于啮齿动物，例如大鼠和小鼠。啮齿动物具有一对共生同源的胰岛素基因，不过是否发生了功能分化还不清楚。共生同源基因通常属于同一物种，但并不必须如此：例如，人的血红蛋白基因和黑猩猩的肌红蛋白是共生同源物。生物信息学中的共同问题是：当不同物种的基因组已经经过测序并且已经发现了同源基因，则由于这些基因可能是功能已经分化的共生同源物而不能直接得出这些基因具有相同或相似功能的结论。本文所用的“非黑猩猩灵长类”或“非黑猩灵长类”或其在语法上的变式是指除了黑猩猩之外、即除了属于黑猩猩属(genus Pan)的动物的任何灵长类，并且包括物种倭黑猩猩(Pan paniscus)和黑猩猩(Pan troglodytes)，也称为Anthropopithecus troglodytes或Simia satyrus。然而，应该理解，本发明的抗体还可以利用其第一和/或第二结合域与所述黑猩猩的各表位/片段等结合，这是可能的。本发明仅仅是为了避免利用黑猩猩进行的动物实验(如果期望)。因此还可以设想在另一个实施方式中，本发明的抗体还利用其第一和/或第二结合域与所述黑猩猩的各表位结合。“灵长类”、“灵长类物种”或其在语法上的变式表示分为原猴和类人猿两个亚目的真哺乳亚纲哺乳动物目，并包括猿、猴和狐猴。具体地，本文所用的“灵长类”包括原猴亚目(Strepsirrhini，非眼镜猴的原猴)，其包括狐猴型下目(Lemuriformes，本身包括鼠狐猴总科(Cheirogaleoidea)和狐猴总科(Lemuroidea))、指猴型下目(Chiromyiformes，本身包括指猴科(Daubentoniidae))和懒猴型下目(Lorisiformes，本身包括懒猴科(Lorisidae)和婴猴科(Galagidae))。本文所用的“灵长类”还包括简鼻亚目Haplorrhini，其包括跗猴型下目(Tarsiiformes，本身包括跗猴科(Tarsiidae))、类人猿下目(Simiiformes，本身包括阔鼻小目(Platyrrhini)或新世界猴，和狭鼻小目(Catarrhini)，其包括猕猴总科Cercopithecidea或旧世界猴)。

本发明含义中，非黑猩猩灵长类物种可理解为狐猴、眼镜猴、长臂猿、狨猴(属于卷尾猴科(Cebidae)的新世界猴)或旧世界猴(属于猕猴总科(Cercopithecoidea))。

本文所用的“旧世界猴”包括属于猕猴总科(Cercopithecoidea)的任何猴，其本身细分为以下科：猕猴亚科(Cercopithecinae)，其主要是非洲的但包括亚洲和北非的各种猕猴属；和疣猴亚科(Colobinae)，其包括大多数亚洲属但也包括非洲疣猴。

具体地，在猕猴亚科(Cercopithecinae)中，有利的非黑猩猩灵长类可来自长尾猴族Cercopithecini，在短肢猴属(Allenopithecus)内(艾伦氏沼泽猴(Allen’s Swamp Monkey)，Allenopithecus nigroviridis)；在侏长尾猴属(Miopithecus)内(安哥拉侏长尾猴(Angolan Talapoin)，Miopithecus talapoin)；加蓬侏长尾猴(Gabon Talapoin)，Miopithecus ogouensis)；在赤猴属(Erythrocebus)内(Patas猴，Erythrocebus patas)；在绿猴属(Chlorocebus)内(绿猴(Green Monkey)，Chlorocebus sabaceus；黑长尾猴(Grivet)，Chlorocebus aethiops；贝尔山长尾黑颚猴(Bale Mountains Vervet)，Chlorocebus djamdjamensis；坦塔罗斯猴(Tantalus Monkey)，Chlorocebus tantalus；长尾黑颚猴(Vervet Monkey)，Chlorocebus pygerythrus；狗尾猴(Malbrouck)，Chlorocebus cynosuros)；或在长尾猴属(Cercopithecus)内(德赖斯猴(Dryas Monkey)或Salongo猴，Cercopithecus dryas；黛安娜猴(Diana Monkey)，Cercopithecus diana；罗洛威须猴(Roloway Monkey)，Cercopithecus roloway；大斑鼻猴(Greater Spot-nosed Monkey)，Cercopithecus nictitans；蓝猴，Cercopithecus mitis；银猴(Silver Monkey)，Cercopithecus doggetti；金猴(Golden Monkey)，Cercopithecus kandti；赛克司猴(Sykes Monkey)，Cercopithecus albogularis；加纳猴(Mona Monkey)，Cercopithecus mona；Campbell氏加纳猴，Cercopithecus campbelli；Lowe氏加纳猴，Cercopithecus lowei；有冠加纳猴(Crested Mona Monkey)，Cercopithecus pogonias；Wolf氏加纳猴，Cercopithecus wolfi；Dent氏加纳猴，Cercopithecus denti；小斑鼻猴(Lesser Spot-nosed Monkey)，Cercopithecus petaurista；白喉长尾猴(White-throated Guenon)，Cercopithecus erythrogaster；Sclater氏长尾猴，Cercopithecus sclateri；红耳长尾猴，Cercopithecus erythrotis；髭长尾猴(Moustached Guenon)，Cercopithecus cephus；红尾猴(Red-tailed Monkey)，Cercopithecus ascanius；L′Hoest氏猴，Cercopithecus lhoesti；Preuss氏猴，Cercopithecus preussi；太阳尾猴(Sun-tailed Monkey)，Cercopithecus solatus；Hamlyn氏猴或枭面猴(Owl-faced Monkey)，Cercopithecus hamlyni；De Brazza氏猴，Cercopithecus neglectus)。

可选地，猕猴亚科(Cercopithecinae)和狒狒族(Papionini)中的有利的非黑猩猩灵长类可来自猕猴属(Macaca)内(地中海猕猴(Barbary Macaque)，Macaca sylvanus；狮尾猕猴(Lion-tailed Macaque)，Macaca silenus；南方豚尾猕猴(Southern Pig-tailed Macaque)或Beruk，Macaca nemestrina；北方豚尾猕猴(Northern Pig-tailed Macaque)，Macaca leonina；Pagai岛猕猴(Pagai Island Macaque)或Bokkoi，Macaca pagensis；Siberut猕猴，Macaca siberu；沼泽猕猴(Moor Macaque)，Macaca maura；穿靴猕猴(Booted Macaque)，Macaca ochreata；Tonkean猕猴，Macaca tonkeana；Heck氏猕猴，Macaca hecki；Gorontalo猕猴，Macaca nigriscens；Celebes有冠猕猴或黑“类人猿”，Macaca nigra；食蟹猴(Cynomolgus monkey)或吃螃蟹的猕猴或长尾猕猴或Kera，食蟹猕猴(Macaca fascicularis)；短尾猕猴(Stump-tailed Macaque)或熊猕猴(Bear Macaque)，Macaca arctoides；恒河猕猴，普通猕猴(Macaca mulatta)；台湾岩石猕猴(Formosan Rock Macaque)，Macaca cyclopis；日本猕猴，Macaca fuscata；Toque猕猴，Macaca sinica；冠毛猕猴(Bonnet Macaque)，Macaca radiata；地中海猕猴，Macaca sylvanmus；Assam猕猴，Macaca assamensis；西藏猕猴或Milne-Edwards氏猕猴，Macaca thibetana；Arunachal猕猴或Munzala，Macaca munzala)；在Lophocebus属中(灰颊白眉猴(Gray-cheeked Mangabey)，Lophocebus albigena；Lophocebus albigena albigena；Lophocebus albigena osmani；Lophocebus albigena johnstoni；黑色有冠白眉猴(Black Crested Mangabey)，Lophocebus aterrimus；Opdenbosch氏白眉猴(Opdenbosch′s Mangabey)，Lophocebus opdenboschi；高原白眉猴(Highland Mangabey)，Lophocebus kipunji)；在狒狒属(Papio)中(阿拉伯狒狒(Hamadryas Baboon)，Papio hamadryas；几内亚狒狒(Guinea Baboon)，Papio papio；橄榄狒狒(Olive Baboon)，Papio anubis；黄狒狒(Yellow Baboon)，Papio cynocephalus；大狒狒(Chacma Baboon)，Papio ursinus)；在狮尾狒狒属(Theropithecus)中(Gelada，Theropithecus gelada)；在白眉猴属(Cercocebus)内(乌黑白眉猴(Sooty Mangabey)，Cercocebus atys；Cercocebus atys atys；Cercocebus atys lunulatus；有领白眉猴(Collared Mangabey)，Cercocebus torquatus；敏捷白眉猴(Agile Mangabey)，Cercocebus agilis；金腹白眉猴(Golden-bellied Mangabey)，Cercocebus chrysogaster；塔纳河白眉猴(Tana River Mangabey)，Cercocebus galeritus；狲氏白眉猴(Sanje Mangabey)，Cercocebus sanjei)；或在山魈属(Mandrillus)中(Mandrill，Mandrillus sphinx；鬼狒(Drill)，Mandrillus leucophaeus)。

最优选的是食蟹猕猴(Macaca fascicularis，也称为食蟹猴(Cynomolgus monkey)，因此在实施例中称为“食蟹猴”)和普通猕猴(Macaca mulatta)(恒河猴(rhesus monkey)，称为“恒河猴”(“rhesus”))。

在疣猴亚科(Colobinae)中，有利的非黑猩猩灵长类可来自非洲群，在疣猴属(Colobus)中(黑色疣猴(Black Colobus)，Colobus satanas；安哥拉疣猴(Angola Colobus)，Colobus angolensis；王疣猴(King Colobus)，Colobus polykomos；熊疣猴(Ursine Colobus)，Colobus vellerosus；披斗篷疣猴(Mantled Guereza)，Colobus guereza)；在红疣猴属(Piliocolobus)中(西方红疣猴(Western Red Colobus)，Piliocolobus badius；Piliocolobus badius badius；Piliocolobus badius temminckii；Piliocolobus badius waldronae；Pennant氏疣猴，Piliocolobus pennantii；Piliocolobus pennantii pennantii；Piliocolobus pennantii epieni；Piliocolobus pennantii bouvieri；Preuss氏红疣猴，Piliocolobus preussi；Thollon氏红疣猴，Piliocolobus tholloni；中非红疣猴(Central African Red)，Piliocolobus foai；Piliocolobus foai foai；Piliocolobus foai ellioti；Piliocolobus foai oustaleti；Piliocolobus foai semlikiensis；Piliocolobus foai parmentierorum；乌干达红疣猴(Uzyngwa Red Colobus)，Piliocolobus tephrosceles；Uzyngwa红疣猴，Piliocolobus gordonorum；Zanzibar红疣猴，Piliocolobus kirkii；塔纳河红疣猴(Tana River Red Colobus)，Piliocolobus rufomitratus)；或在绿疣猴属(Procolobus)中(橄榄疣猴(Olive Colobus)，Procolobus verus)。

在疣猴亚科(Colobinae)中，有利的非黑猩猩灵长类可选地来自叶猴(Langur)(叶片猴子)群，在长尾叶猴属(Semnopithecus)内(尼泊尔灰叶猴(Nepal Gray Langur)，Semnopithecus schistaceus；克什米尔灰叶猴，Semnopithecus ajax；Tarai灰叶猴(Tarai Gray Langur)，Semnopithecus hector、北方平原灰叶猴(Northern Plains Gray Langur)，Semnopithecus entellus；黑脚灰叶猴(Black-footed Gray Langur)，Semnopithecus hypoleucos；南方平原灰叶猴(Southern Plains Gray Langur)，Semnopithecus dussumieri；簇毛灰叶猴(Tufted Gray Langur)，Semnopithecus priam)；在乌叶猴属(Trachypithecus)的T.vetulus群中(紫脸叶猴(Purple-faced Langur)，Trachypithecus vetulus；Nilgiri叶猴，Trachypithecus johnii)；在乌叶猴属的T.cristatus群中(Javan Lutung，Trachypithecus auratus；银色叶猴(Silvery Leaf Monkey)或银色Lutung，Trachypithecus cristatus；印度支那Lutung(Indochinese Lutung)，Trachypithecus germaini；Tenasserim Lutung，Trachypithecus barbei)；在乌叶猴属(Trachypithecus)的T.obscurus群中(暗色叶猴(Dusky Leaf Monkey)或眼镜叶猴(Spectacled Leaf Monkey)，Trachypithecus obscurus；Phayre氏叶猴(Dusky Leaf Monkey)，Trachypithecus phayrei)；在乌叶猴属(Trachypithecus)的T.pileatus群中(戴帽叶猴(Capped Langur)，Trachypithecus pileatus；Shortridge氏叶猴(Shortridge′s Langur)，Trachypithecus shortridgei；Gee氏金色叶猴(Gee′s Golden Langur)，Trachypithecus geei)；在乌叶猴属(Trachypithecus)的T.francoisi群中(Francois氏叶猴(Francois′Langur)，Trachypithecus francoisi；Hatinh叶猴(Hatinh Langur)，Trachypithecus hatinhensis；白头叶猴(White-headed Langur)，Trachypithecus poliocephalus；老挝叶猴(Laotian Langur)，Trachypithecus laotum；Delacour氏叶猴(Delacour′s Langur)，Trachypithecus delacouri；印度支那黑色叶猴(Indochinese Black Langur)，Trachypithecus ebenus)；或在叶猴属(Presbytis)中(苏门答腊叶猴(Sumatran Surili)，Presbytis melalophos；带纹叶猴(Banded Surili)，Presbytis femoralis；沙捞越叶猴(Sarawak Surili)，Presbytis chrysomelas；白腿叶猴(White-thighed Surili)，Presbytis siamensis；白额叶猴(White-fronted Surili)，Presbytis frontata；爪哇叶猴(Javan Surili)，Presbytis comata；Thomas氏叶猴(Thomas′s Langur)，Presbytis thomasi；Hose氏叶猴(Hose′s Langur)，Presbytis hosei；栗红叶猴(Maroon Leaf Monkey)，Presbytis rubicunda；孟他维叶猴(Mentawai Langur)或Joja，Presbytis potenziani；纳土纳岛叶猴(Natuna Island Surili)，Presbytis natunae)。

在疣猴亚科(Colobinae)中，有利的非黑猩猩灵长类可选地来自怪鼻猴群，在白臀叶猴属(Pygathrix)中(红腿白臀叶猴(Red-shanked Douc)，Pygathrix nemaeus；黑腿白臀叶猴(Black-shanked Douc)，Pygathrix nigripes；灰腿白臀叶猴(Gray-shanked Douc)，Pygathrix cinerea)；在仰鼻猴属(Rhinopithecus)中(金色扁鼻猴(Golden Snub-nosed Monkey)，金丝猴(Rhinopithecus roxellana)；黑色扁鼻猴(Black Snub-nosed Monkey)，滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)；灰色扁鼻猴(Gray Snub-nosed Monkey)、黔金丝猴(Rhinopithecus brelichi)；Tonkin扁鼻叶猴，越南金丝猴(Rhinopithecus avunculus))；在长鼻猴属(Nasalis)中(长鼻猴(Proboscis Monkey)，Nasalis larvatus)；或在豚尾叶猴属(Simias)中(豚尾叶猴(Pig-tailed Langur)，Simias concolor)。

本文所用的术语“狨猴(marmoset)”表示狨属(Callithrix)的任何新世界猴，例如属于狨亚属Callithrix(sic！)的大西洋狨猴(常见狨猴，狨Callithrix(Callithrix)jacchus；黑色簇毛狨猴(Black-tufted Marmoset)，丛尾狨Callithrix(Callithrix)penicillata；Wied氏狨猴，狨Callithrix(Callithrix)kuhlii；白头狨猴，狨Callithrix(Callithrix)geoffroyi；黄头狨猴(Buffy-headed Marmoset)，狨Callithrix(Callithrix)flaviceps；黄色簇毛狨猴(Buffy-tufted Marmoset)，狨Callithrix(Callithrix)aurita)；属于Mico亚属的亚马逊狨猴(Rio Acari狨猴，狨Callithrix(Mico)acariensis；Manicore狨猴，狨Callithrix(Mico)manicorensis；银色狨猴，狨Callithrix(Mico)argentata；白狨猴，狨Callithrix(Mico)leucippe；Emilia氏狨猴，狨Callithrix(Mico)emiliae；黑头狨猴，狨Callithrix(Mico)nigriceps；Marca氏狨猴，狨Callithrix(Mico)marcai；黑尾狨猴，狨Callithrix(Mico)melanura；Santarem狨猴，白肩狨Callithrix(Mico)humeralifera；Maués狨猴，狨Callithrix(Mico)mauesi；金白狨猴，黄肢狨Callithrix(Mico)chrysoleuca；Hershkovitz氏狨猴，狨Callithrix(Mico)intermedia；Satéré狨猴，狨Callithrix(Mico)saterei)；属于Callibella亚属的Roosmalens氏倭狨猴(Callithrix(Callibella)humilis)；或属于倭狨亚属Cebuella的侏儒狨猴(Pygmy Marmoset)(Callithrix(Cebuella)pygmaea)。

其它属的新世界猴包括柽柳猴属(Saguinus)的绢毛猴(tamarin)(包括绒顶柽柳猴(S.oedipus)群、赤掌柽柳猴(S.midas)群、黑须柽柳猴(S.nigricollis)群、长须柽柳猴(S.mystax)群、两色柽柳猴(S.bicolor)群和烙印柽柳猴(S.inustus)群和松鼠猴属(Samiri)的松鼠猴(squirrel monkey)(如，松鼠猴、巴拿马松鼠猴(Saimiri oerstedii)、马河松鼠猴(Saimiri ustus)、亚马逊松鼠猴(Saimiri boliviensis)、黑松鼠猴(Saimiri vanzolini))。

在本发明双特异性单链抗体的优选实施方式中，所述非黑猩猩灵长类是旧世界猴。在所述多肽的更优选实施方式中，所述旧世界猴是狒狒属(Papio genus)猕猴属(Macaque genus)的猴。最优选地，所述猕猴属的猴是阿萨姆(Assamese)猕猴(Macaca assamensis)，地中海猕猴(地中海猴(Macaca sylvanus))，Bonnet猕猴(冠毛猕猴(Macaca radiata))，穿靴猕猴或苏拉威西(Sulawesi)穿靴猕猴(Macaca ochreata)，苏拉威西有冠(crested)猕猴(Macaca nigra)，台湾岩石猕猴(Macaca cyclopsis)，日本雪猕猴或日本猕猴(Macaca fuscata)，食蟹猴或食蟹猕猴或长尾猕猴或爪哇猕猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))，狮尾猕猴(Macaca silenus)，豚尾猕猴(Macaca nemestrina)，恒河猕猴(普通猕猴(Macaca mulatta))，西藏猕猴(Macaca thibetana)，Tonkean猕猴(Macaca tonkeana)，Toque猕猴(Macaca sinica)，短尾猕猴或红脸猕猴或熊猴(Macaca arctoides)或沼泽猕猴(Macaca maurus)。最优选地，所述狒狒属的猴是阿拉伯狒狒(Hamadryas Baboon)，Papio hamadryas；几内亚狒狒(Guinea Baboon)，Papio papio；橄榄狒狒(Olive Baboon)，Papio anubis；黄狒狒(Yellow Baboon)，Papio cynocephalus；大狒狒(Chacma Baboon)，Papio ursinus。

在本发明双特异性单链抗体分子的可选优选实施方式中，所述非黑猩猩灵长类是新世界猴。在多肽的更优选实施方式中，所述新世界猴是Callithrix属(狨猴)、Saguinus属或Samiri属的猴。最优选地，所述Callithrix属的猴是普通狨猴(Callithrix jacchus)，所述Saguinus属的猴是绒顶柽柳猴，而所述Samiri属的猴是松鼠猴。

本文所用的术语“细胞表面抗原”表示展示在细胞表面上的分子。在大多数情况下，该分子将位于细胞的质膜中或质膜之上以使该分子的至少一部分在三级形式上保持从细胞外的可接近性。位于质膜中的细胞表面分子的非限制性实例是跨膜蛋白，其在它的三级构象中包含亲水区和疏水区。在此处，至少一个疏水区允许细胞表面分子埋入或插入细胞的疏水质膜，而亲水区在质膜的任一侧分别延伸至胞质和细胞外间隙中。位于质膜上的细胞表面分子的非限制性实例是在半胱氨酸残基处修饰以具有棕榈酰基的蛋白，在C-末端半胱氨酸残基处修饰以具有法呢基的蛋白或在C-末端修饰以具有糖基磷脂酰肌醇(“GPI”)锚的蛋白。这些基团允许蛋白共价连接到质膜的外表面，在此其保持可接近性以被诸如抗体的细胞外分子识别。细胞表面抗原的实例包括CD3ε和PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-IR或FAPα)。

如本文以上所述，PSCA是作为包括但不限于前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌的多种癌症治疗的靶标的细胞表面抗原。

如本文以上所述，CD19是作为包括但不限于B细胞恶性病如非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自体免疫疾病或B细胞消除的多种癌症治疗靶标的细胞表面抗原。

如本文以上所述，C-MET是作为包括但不限于癌、肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、肾母细胞瘤或造血系统恶性瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤的多种癌症治疗靶标的细胞表面抗原。

此外，本文以上所述，内皮唾液酸蛋白是作为包括但不限于癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤和神经外胚层肿瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)的多种癌症治疗靶标的细胞表面抗原。

如本文以上所述，EpCAM是作为包括但不限于上皮癌或微量残留癌的多种癌症治疗的靶标的细胞表面抗原。

此外，如本文以上所述，FAPα是作为包括但不限于上皮癌的多种癌症治疗的靶标的细胞表面抗原。

此外，如本文以上所述，IGF-1R是作为包括但不限于骨或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌，和自体免疫疾病包括但不限于优选银屑病的多种癌症治疗的靶标的细胞表面抗原。

因此，PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)也可以表征为肿瘤抗原。本文所用的术语“肿瘤抗原”可理解为呈现在肿瘤细胞上的那些抗原。这些抗原可被呈现在细胞表面上，具有通常与分子的跨膜和胞质部分结合在一起的细胞外部分。这些抗原有时可仅被肿瘤细胞呈现而从不被正常细胞呈现。肿瘤抗原可专门地在肿瘤细胞上表达或与正常细胞相比可代表肿瘤特异性突变。这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原。更常见的是被肿瘤细胞和正常细胞呈现的抗原，它们被称为肿瘤相关性抗原。与正常细胞相比这些肿瘤相关性抗原可过表达，或因为肿瘤组织与正常组织相比具有较不紧凑的结构而容易在肿瘤细胞中与抗体结合。本发明的肿瘤抗原的实例是PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R和FAPα。

如本文以上所述，本发明的双特异性单链抗体分子以第一结合域与人和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链的表位结合，其中所述表位是包含在由如SEQ ID NO.2、4、6或8所示的27个氨基酸残基组成的组中的氨基酸序列的一部分或其功能片段。

与本发明一致，对本发明双特异性单链抗体优选的是，所述表位是包含26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸的氨基酸序列的一部分。

更优选地，其中所述表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(Q-D-G-N-E-D)。

在本发明中，N-末端1-27个氨基酸残基的功能片段是指所述功能片段仍是背景独立的表位，当其脱离CD3复合体的天然环境(并融合于异源氨基酸序列，例如EpCAM或免疫球蛋白Fc部分，如实施例3.1显示的)时，保持其三维结构完整性。在CD3ε的N-末端27个氨基酸多肽或其功能片段中的三维结构的维持可用于产生结合域，所述结合域在体外与N-末端CD3ε多肽片段结合并且在体内以相同的结合亲和力与T细胞上的天然CD3复合体(的CD3ε亚基)结合。在本发明中，N-末端1-27个氨基酸残基的功能片段是指本文提供的CD3结合分子仍可以背景独立的方式与这种功能片段结合。本领域技术人员知晓用于确定表位的哪些氨基酸残基被这种抗CD3结合域识别的表位定位方法(如丙氨酸扫描，参见所附实施例)。

在本发明的一个实施方式中，本发明的双特异性单链抗体分子包含能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的(第一)结合域和能够与细胞表面抗原PSCA结合的第二结合域。在本发明的可选实施方式中，所述第二结合域能够与细胞表面抗原CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα结合。

在本发明中，进一步优选第二结合域与人细胞表面抗原PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)和/或非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合。特别优选地，第二结合域与人细胞表面抗原PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)和非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)，优选与猕猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合。应该理解，第二结合域与至少一种非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合，然而，其也可以与两种、三种或更多种非黑猩猩灵长类的PSCA同源物(分别为CD19同源物、C-MET同源物、内皮唾液酸蛋白同源物、EpCAM同源物、IGF-1R同源物或FAPα同源物)结合。例如，第二结合域与食蟹猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)以及恒河猴PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合。

为了产生本发明的双特异性单链抗体分子，例如本文定义的双特异单链抗体的第二结合域，可以使用与人和/或非黑猩猩灵长类各自的细胞表面抗原，例如PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合的单克隆抗体。本文定义的双特异性多肽的适当的结合域可由本领域中描述的重组方法衍生自种间特异性单克隆抗体。与人细胞表面抗原和非黑猩猩灵长类中的所述细胞表面抗原的同系物结合的单克隆抗体可由FACS测定按上文所述进行测试。本领域技术人员清楚，种间特异性抗体还可由文献中描述的杂交瘤技术产生(Milstein和Nature 256(1975)，495-7)。例如，小鼠可选地以人和非黑猩猩灵长类PSCA(分别为CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)免疫。经杂交瘤技术从这些小鼠分离产生种间特异性抗体的杂交瘤细胞并由FACS按上述进行分析。双特异性多肽例如本文所述的表现种间特异性的双特异性单链抗体的产生和分析显示在以下实施例中。表现种间特异性的双特异性单链抗体的优点包括下列各点。

对本发明双特异性单链抗体分子尤其优选的是，能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域包括VL区，其中所述VL区包括选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：

(a)SEQ ID NO.27所示的CDR-L1、SEQ ID NO.28所示的CDR-L2和SEQ ID NO.29所示的CDR-L3；

(b)SEQ ID NO.117所示的CDR-L1、SEQ ID NO.118所示的CDR-L2和SEQ ID NO.119所示的CDR-L3；和

(c)SEQ ID NO.153所示的CDR-L1、SEQ ID NO.154所示的CDR-L2和SEQ ID NO.155所示的CDR-L3。

可变区，即可变轻链(“L”或“VL”)和可变重链(“H”或“VH”)在本领域中理解为提供了抗体的结合域。该可变区包含互补决定区。

在本领域公知术语“互补决定区”(CDR)决定抗体的抗原特异性。术语“CDR-L”或“L CDR”或“LCDR”是指VL中的CDR，而术语“CDR-H”或“HCDR”或“HCDR”是指VH中的CDR。

在本发明双特异性单链抗体分子的可选地优选实施方式中，能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域包括VH区，其中所述VH区包括选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：

(a)SEQ ID NO.12所示的CDR-H1、SEQ ID NO.13所示的CDR-H2和SEQ ID NO.14所示的CDR-H3；

(b)SEQ ID NO.30所示的CDR-H1、SEQ ID NO.31所示的CDR-H2和SEQ ID NO.32所示的CDR-H3；

(c)SEQ ID NO.48所示的CDR-H1、SEQ ID NO.49所示的CDR-H2和SEQ ID NO.50所示的CDR-H3；

(d)SEQ ID NO.66所示的CDR-H1、SEQ ID NO.67所示的CDR-H2和SEQ ID NO.68所示的CDR-H3；

(e)SEQ ID NO.84所示的CDR-H1、SEQ ID NO.85所示的CDR-H2和SEQ ID NO.86所示的CDR-H3；

(f)SEQ ID NO.102所示的CDR-H1、SEQ ID NO.103所示的CDR-H2和SEQ ID NO.104所示的CDR-H3；

(g)SEQ ID NO.120所示的CDR-H1、SEQ ID NO.121所示的CDR-H2和SEQ ID NO.122所示的CDR-H3；

(h)SEQ ID NO.138所示的CDR-H1、SEQ ID NO.139所示的CDR-H2和SEQ ID NO.140所示的CDR-H3；

(i)SEQ ID NO.156所示的CDR-H1、SEQ ID NO.157所示的CDR-H2和SEQ ID NO.158所示的CDR-H3；和

(j)SEQ ID NO.174所示的CDR-H1、SEQ ID NO.175所示的CDR-H2和SEQ ID NO.176所示的CDR-H3。

还优选地，能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的结合域包括VL区，其中所述VL区选自由SEQ ID NO.35、39、125、129、161或165所示的VL区组成的组。

可选地优选能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域包括VH区，其中所述VH区选自由SEQ ID NO.15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示的VH区组成的组。

更优选地，本发明的双特异性单链抗体分子的特征为能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域，其包括选自由以下组成的组的VL区和VH区：

(a)SEQ ID NO.17或21所示的VL区和SEQ ID NO.15或19所示的VH区；

(b)SEQ ID NO.35或39所示的VL区和SEQ ID NO.33或37所示的VH区；

(c)SEQ ID NO.53或57所示的VL区和SEQ ID NO.51或55所示的VH区；

(d)SEQ ID NO.71或75所示的VL区和SEQ ID NO.69或73所示的VH区；

(e)SEQ ID NO.89或93所示的VL区和SEQ ID NO.87或91所示的VH区；

(f)SEQ ID NO.107或111所示的VL区和SEQ ID NO.105或109所示的VH区；

(g)SEQ ID NO.125或129所示的VL区和SEQ ID NO.123或127所示的VH区；

(h)SEQ ID NO.143或147所示的VL区和SEQ ID NO.141或145所示的VH区；

(i)SEQ ID NO.161或165所示的VL区和SEQ ID NO.159或163所示的VH区；和

(j)SEQ ID NO.179或183所示的VL区和SEQ ID NO.177或181所示的VH区。

根据本发明双特异性单链抗体分子的优选实施方式，与CD3ε结合的第一结合域中成对的VH-区和VL-区是以单链抗体(scFv)的形式存在。所述VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序排列。优选所述VH区N-末端定位于连接子序列。所述VL区C-末端定位于连接子序列。换而言之，本发明的双特异性单链抗体分子的CD3结合域中的结构域排列优选为VH-VL，其中所述CD3结合域C-末端定位于第二(细胞表面抗原，例如PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)结合域。优选地，VH-V1包含SEQ ID NO.185或为SEQ ID NO.185。

本发明上述的双特异性单链抗体分子的优选实施方式的特征为，能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位结合的第一结合域，其包括选自由SEQID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187组成的组的氨基酸序列。

本发明进一步涉及上述的双特异性单链抗体，其中所述第二结合域与细胞表面抗原PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα结合。

PSCAxCD3

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域包含一组选自如下组成的组的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：382-384的CDR H1-3和SEQ ID NO：377-379的CDR L1-3的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：400-402的CDR H1-3和SEQ ID NO：395-397的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：414-416的CDR H1-3和SEQ ID NO：409-411的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：432-434的CDR H1-3和SEQ ID NO：427-429的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：1215-1217的CDR H1-3和SEQ ID NO：1220-1222的CDR L1-3；

f)SEQ ID NO：1187-1189的CDR H1-3和SEQ ID NO：1192-1194的CDR L1-3；

g)SEQ ID NO：1173-1175的CDR H1-3和SEQ ID NO：1178-1180的CDR L1-3；

h)SEQ ID NO：1229-1231的CDR H1-3和SEQ ID NO：1234-1236的CDRL1-3；

i)SEQ ID NO：1201-1203的CDR H1-3和SEQ ID NO：1206-1208的CDR L1-3；

k)SEQ ID NO：1257-1259的CDR H1-3和SEQ ID NO：1262-1264的CDR L1-3；和

l)SEQ ID NO：1243-1245的CDR H1-3和SEQ ID NO：1248-1250的CDR L1-3。

本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域的相应VL区和VH区的序列以及各scFv示于序列表中。

如所附实施例中例示的，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH PSCA-VL PSCA-VH CD3-VL CD3或VL PSCA-VH PSCA-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：389、421、439、391、405、423、441、1226、1198、1184、1240、1212、1268或1254中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：390、422、440、392、406、424、442、1227、1199、1185、1241、1213、1269或1255中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：389、421、439、391、405、423、441、1226、1198、1184、1240、1212、1268或1254中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与SEQ ID NO：389、421、439、391、405、423、441、1226、1198、1184、1240、1212、1268或1254的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：390、422、440、392、406、424、442、1227、1199、1185、1241、1213、1269或1255中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：390、422、440、392、406、424、442、1227、1199、1185、1241、1213、1269或1255所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。应该理解，在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如85％(90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子(anti-codon)上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的PSCAxCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原PSCA是种间特异的。

CD19xCD3

根据本发明的可选的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组选自如下组成的组的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：478-480的CDR H1-3和SEQ ID NO：473-475的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：530-532的CDR H1-3和SEQ ID NO：525-527的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：518-520的CDR H1-3和SEQ ID NO：513-515的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：506-508的CDR H1-3和SEQ ID NO：501-503的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：494-496的CDR H1-3和SEQ ID NO：489-491的CDR L1-3；

f)SEQ ID NO：542-544的CDR H1-3和SEQ ID NO：537-539的CDR L1-3；

g)SEQ ID NO：554-556的CDR H1-3和SEQ ID NO：549-551的CDR L1-3；

h)SEQ ID NO：566-568的CDR H1-3和SEQ ID NO：561-563的CDR L1-3；

i)SEQ ID NO：578-580的CDR H1-3和SEQ ID NO：573-575的CDR L1-3；

j)SEQ ID NO：590-592的CDR H1-3和SEQ ID NO：585-587的CDR L1-3；

k)SEQ ID NO：602-604的CDR H1-3和SEQ ID NO：597-599的CDR L1-3；

l)SEQ ID NO：614-616的CDR H1-3和SEQ ID NO：609-611的CDR L1-3；

m)SEQ ID NO：626-628的CDR H1-3和SEQ ID NO：621-623的CDR L1-3；

n)SEQ ID NO：638-640的CDR H1-3和SEQ ID NO：633-635的CDR L1-3；

o)SEQ ID NO：650-652的CDR H1-3和SEQ ID NO：645-647的CDR L1-3；

p)SEQ ID NO：662-664的CDR H1-3和SEQ ID NO：657-659的CDR L1-3；

q)SEQ ID NO：674-676的CDR H1-3和SEQ ID NO：669-671的CDR L1-3；

r)SEQ ID NO：686-688的CDR H1-3和SEQ ID NO：681-683的CDR L1-3；

s)SEQ ID NO：698-700的CDR H1-3和SEQ ID NO：693-695的CDR L1-3；

t)SEQ ID NO：710-712的CDR H1-3和SEQ ID NO：705-707的CDR L1-3；

u)SEQ ID NO：722-724的CDR H1-3和SEQ ID NO：717-719的CDR L1-3；

v)SEQ ID NO：734-736的CDR H1-3和SEQ ID NO：729-731的CDR L1-3；

w)SEQ ID NO：746-748的CDR H1-3和SEQ ID NO：741-743的CDR L1-3；

x)SEQ ID NO：758-760的CDR H1-3和SEQ ID NO：753-755的CDR L1-3；

y)SEQ ID NO：1271-1273的CDR H1-3和SEQ ID NO：1276-1278的CDRL1-3；

z)SEQ ID NO：1285-1287的CDR H1-3和SEQ ID NO：1290-1292的CDR L1-3；

aa)SEQ ID NO：1299-1301的CDR H1-3和SEQ ID NO：1304-1306的CDR L1-3；

ab)SEQ ID NO：1313-1315的CDR H1-3和SEQ ID NO：1318-1320的CDR L1-3；

ac)SEQ ID NO：1327-1329的CDR H1-3和SEQ ID NO：1332-1334的CDR L1-3；

ad)SEQ ID NO：1341-1343的CDR H1-3和SEQ ID NO：1346-1348的CDR L1-3；

ae)SEQ ID NO：1355-1357的CDR H1-3和SEQ ID NO：1360-1362的CDR L1-3；

af)SEQ ID NO：1369-1371的CDR H1-3和SEQ ID NO：1374-1376的CDRL1-3；和

ag)SEQ ID NO：1383-1385的CDR H1-3和SEQ ID NO：1388-1390的CDRL1-3。

本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域的相应VL区和VH区的序列以及各scFv示于序列表中。

如所附实施例中例示的，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH CD19-VL CD19-VH CD3-VL CD3或VL CD19-VH CD19-VH CD3-VL CD3的顺序排列。优选地，结合域以VL CD19-VH CD19-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：481、485、483、533、521、509、497、545、557、569、581、593、605、617、629、641、653、665、677、689、701、713、725、737、749、761、1282、1296、1310、1324、1338、1352、1366、1380或1394中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：482、486、484、534、522、510、498、546、558、570、582、594、606、618、630、642、654、666、678、690、702、714、726、738、750、762、1283、1297、1311、1325、1339、1353、1367、1381或1395中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：481、485、483、533、521、509、497、545、557、569、581、593、605、617、629、641、653、665、677、689、701、713、725、737、749、761、1282、1296、1310、1324、1338、1352、1366、1380或1394中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与SEQ ID NO：481、485、483、533、521、509、497、545、557、569、581、593、605、617、629、641、653、665、677、689、701、713、725、737、749、761、1282、1296、1310、1324、1338、1352、1366、1380或1394的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：482、486、484、534、522、510、498、546、558、570、582、594、606、618、630、642、654、666、678、690、702、714、726、738、750、762、1283、1297、1311、1325、1339、1353、1367、1381或1395中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：482、486、484、534、522、510、498、546、558、570、582、594、606、618、630、642、654、666、678、690、702、714、726、738、750、762、1283、1297、1311、1325、1339、1353、1367、1381或1395所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。应该理解，在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如85％(90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的CD19xCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原CD19是种间特异的。

c-METxCD3

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组选自如下组成的组的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：821-823的CDR H1-3和SEQ ID NO：816-818的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：836-838的CDR H1-3和SEQ ID NO：833-835的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：845-847的CDR H1-3和SEQ ID NO：840-842的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：863-865的CDR H1-3和SEQ ID NO：858-860的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：881-883的CDR H1-3和SEQ ID NO：876-878的CDR L1-3；

f)SEQ ID NO：899-901的CDR H1-3和SEQ ID NO：894-896的CDR L1-3；

g)SEQ ID NO：1401-1403的CDR H1-3和SEQ ID NO：1406-1408的CDR L1-3；

h)SEQ ID NO：1415-1417的CDR H1-3和SEQ ID NO：1420-1422的CDR L1-3；

i)SEQ ID NO：1429-1431的CDR H1-3和SEQ ID NO：1434-1436的CDR L1-3；

j)SEQ ID NO：1443-1445的CDR H1-3和SEQ ID NO：1448-1450的CDR L1-3；

k)SEQ ID NO：1457-1459的CDR H1-3和SEQ ID NO：1462-1464的CDR L1-3；

l)SEQ ID NO：1471-1473的CDR H1-3和SEQ ID NO：1476-1478的CDR L1-3；

m)SEQ ID NO：1639-1641的CDR H1-3和SEQ ID NO：1644-1646的CDR L1-3；

n)SEQ ID NO：1625-1627的CDR H1-3和SEQ ID NO：1630-1632的CDR L1-3；

o)SEQ ID NO：1611-1613的CDR H1-3和SEQ ID NO：1616-1618的CDR L1-3；

p)SEQ ID NO：1597-1599的CDR H1-3和SEQ ID NO：1602-1604的CDR L1-3；

q)SEQ ID NO：1569-1571的CDR H1-3和SEQ ID NO：1574-1576的CDR L1-3；

r)SEQ ID NO：1555-1557的CDR H1-3和SEQ ID NO：1560-1562的CDR L1-3；

s)SEQ ID NO：1583-1585的CDR H1-3和SEQ ID NO：1588-1590的CDR L1-3；

t)SEQ ID NO：1541-1543的CDR H1-3和SEQ ID NO：1546-1548的CDR L1-3；

u)SEQ ID NO：1513-1515的CDR H1-3和SEQ ID NO：1518-1520的CDR L1-3；

v)SEQ ID NO：1527-1529的CDR H1-3和SEQ ID NO：1532-1534的CDR L1-3；

w)SEQ ID NO：1499-1501的CDR H1-3和SEQ ID NO：1504-1506的CDR L1-3；和

x)SEQ ID NO：1485-1487的CDR H1-3和SEQ ID NO：1490-1492的CDR L1-3。

本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域的相应VL区和VH区的序列以及各scFv示于序列表中。

如所附实施例中例示的，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH C-MET-VL C-MET-VH CD3-VL CD3或VL C-MET-VH C-MET-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列

(a)SEQ ID NO：829、853、871、889、831、855、873、891、905、1412、1426、1440、1454、1468或1482中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：830、854、872、890、832、856、874、892、906、1413、1427、1441、1455、1469或1483中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：829、853、871、889、831、855、873、891、905、1412、1426、1440、1454、1468或1482中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与SEQ ID NO：829、853、871、889、831、855、873、891、905、1412、1426、1440、1454、1468或1482的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：830、854、872、890、832、856、874、892、906、1413、1427、1441、1455、1469或1483中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：830、854、872、890、832、856、874、892、906、1413、1427、1441、1455、1469或1483所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。应该理解，在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如85％(90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的C-METxCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原C-MET是种间特异的。

内皮唾液酸蛋白xCD3

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组如下的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3，所述序列选自由SEQ ID NO：910-912的CDR H1-3和SEQ ID NO：907-909的CDR L1-3组成的组。

从用于第二结合域的重链和轻链的这些CDR序列开始，本领域技术人员可以生成本发明的双特异性单链抗体分子，而无需进一步的创造性劳动。特别地，CDR序列可以位于VL和VH链的框架内，并以scFv的形式排列。

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组选自如下的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：1653-1655的CDR H1-3和SEQ ID NO：1658-1660的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：1667-1669的CDR H1-3和SEQ ID NO：1672-1674的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：1681-1683的CDR H1-3和SEQ ID NO：1686-1688的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：1695-1697的CDR H1-3和SEQ ID NO：1700-1702的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：1709-1711的CDR H1-3和SEQ ID NO：1714-1716的CDR L1-3；和

f)SEQ ID NO：1723-1725的CDR H1-3和SEQ ID NO：1728-1730的CDR L1-3。

如所附实施例的例示，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH内皮唾液酸蛋白-VL内皮唾液酸蛋白-VH CD3-VL CD3或VL内皮唾液酸蛋白-VH内皮唾液酸蛋白-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含第一结构域和第二结构域，其中第一结构域是以上表征的能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε结合的第一结构域，第二结构域能够与内皮唾液酸蛋白结合并包含SEQ ID NO：910-912的CDR H1、2和3以及SEQ ID NO：907-909的CDR L1、2和3或与以上定义的CDR的各氨基酸序列中的每一个具有50％、60％、70％、75％、80％、85％或90％同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％、97％、98％或99％同一性的CDR氨基酸序列。应该理解，在整个CDRH或CDRL氨基酸序列上测定序列同一性。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：1664、1678、1692、1706、1720或1734中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：1665、1679、1693、1707、1721或1735中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：1664、1678、1692、1706、1720或1734中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与SEQ ID NO：1664、1678、1692、1706、1720或1734的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1665、1679、1693、1707、1721或1735中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：1665、1679、1693、1707、1721或1735所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。

除非另有说明，否则应该理解在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸或CDR序列具有例如50％(60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸或CDR序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原内皮唾液酸蛋白是种间特异的。

EpCAMxCD3

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组选自如下组成的组的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：940-942的CDR H1-3和SEQ ID NO：935-937的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：956-958的CDR H1-3和SEQ ID NO：951-953的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：968-970的CDR H1-3和SEQ ID NO：963-965的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：980-982的CDR H1-3和SEQ ID NO：975-977的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：992-994的CDR H1-3和SEQ ID NO：987-989的CDR L1-3；

f)SEQ ID NO：1004-1006的CDR H1-3和SEQ ID NO：999-1001的CDR L1-3；

g)SEQ ID NO：1028-1030的CDR H1-3和SEQ ID NO：1023-1025的CDR L1-3；

h)SEQ ID NO：1040-1042的CDR H1-3和SEQ ID NO：1035-1037的CDR L1-3；

i)SEQ ID NO：1052-1054的CDR H1-3和SEQ ID NO：1047-1049的CDR L1-3；

j)SEQ ID NO：1074-1076的CDR H1-3和SEQ ID NO：1069-1071的CDR L1-3；

k)SEQ ID NO：1086-1088的CDR H1-3和SEQ ID NO：1081-1083的CDR L1-3；

l)SEQ ID NO：1098-1000的CDR H1-3和SEQ ID NO：1093-1095的CDR L1-3；

m)SEQ ID NO：1110-1112的CDR H1-3和SEQ ID NO：1105-1107的CDR L1-3；

n)SEQ ID NO：1122-1124的CDR H1-3和SEQ ID NO：1117-1119的CDR L1-3；

o)SEQ ID NO：1016-1018的CDR H1-3和SEQ ID NO：1011-1013的CDR L1-3；和

p)SEQ ID NO：1765-1767的CDR H1-3和SEQ ID NO：1770-1772的CDR L1-3。

本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域的相应VL区和VH区的序列以及各scFv示于序列表中。

如所附实施例的例示，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH EpCAM-VL EpCAM-VH CD3-VL CD3或VL EpCAM-VH EpCAM-VH CD3-VL CD3的顺序排列。更优选地，结合域以VL EpCAM-VH EpCAM-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：944、948、946、960、972、984、996、1008、1032、1044、1056、1078、1090、1102、1114、1126、1020或1776中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：945、949、947、961、973、985、979、1009、1033、1045、1057、1079、1091、1103、1115、1127、1021或1777中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：944、948、946、960、972、984、996、1008、1032、1044、1056、1078、1090、1102、1114、1126、1020或1776中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与SEQ ID NO：944、948、946、960、972、984、996、1008、1032、1044、1056、1078、1090、1102、1114、1126、1020或1776的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：945、949、947、961、973、985、979、1009、1033、1045、1057、1079、1091、1103、1115、1127、1021或1777中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：945、949、947、961、973、985、979、1009、1033、1045、1057、1079、1091、1103、1115、1127、1021或1777所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。应该理解，在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如85％(90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的EpCAMxCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原EpCAM是种间特异的。

FAPαxCD3

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组如下的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3，所述序列选自由SEQ ID NO：1137-1139的CDR H1-3和SEQ ID NO：1132-1134的CDR L1-3组成的组。

本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域的相应VL区和VH区的序列以及各scFv示于序列表中。

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组选自如下组成的组的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：1137-1139的CDR H1-3和SEQ ID NO：1132-1134的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：1849-1851的CDR H1-3和SEQ ID NO：1854-1856的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：1835-1837的CDR H1-3和SEQ ID NO：1840-1842的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：1779-1781的CDR H1-3和SEQ ID NO：1784-1786的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：1793-1795的CDR H1-3和SEQ ID NO：1798-1800的CDR L1-3；

f)SEQ ID NO：1863-1865的CDR H1-3和SEQ ID NO：1868-1870的CDR L1-3；

g)SEQ ID NO：1807-1809的CDR H1-3和SEQ ID NO：1812-1814的CDR L1-3；

h)SEQ ID NO：1821-1823的CDR H1-3和SEQ ID NO：1826-1828的CDR L1-3；

i)SEQ ID NO：1891-1893的CDR H1-3和SEQ ID NO：1896-1898的CDR L1-3；

j)SEQ ID NO：1877-1879的CDR H1-3和SEQ ID NO：1882-1884的CDR L1-3；

k)SEQ ID NO：1961-1963的CDR H1-3和SEQ ID NO：1966-1968的CDR L1-3；

l)SEQ ID NO：1947-1949的CDR H1-3和SEQ ID NO：1952-1954的CDR L1-3；

m)SEQ ID NO：1975-1977的CDR H1-3和SEQ ID NO：1980-1982的CDR L1-3；

n)SEQ ID NO：1933-1935的CDR H1-3和SEQ ID NO：1938-1940的CDR L1-3；

o)SEQ ID NO：1919-1921的CDR H1-3和SEQ ID NO：1924-1926的CDR L1-3；和

p)SEQ ID NO：1905-1907的CDR H1-3和SEQ ID NO：1910-1912的CDR L1-3。

如所附实施例的例示，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH FAPα-VL FAPα-VH CD3-VL CD3或VL FAPα-VH FAPα-VH CD3-VL CD3的顺序排列。更优选地，结合域以VL FAPα-VH FAPα-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：1143、1147、1145、1860、1846、1790、1804、1874、1818或1832中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：1144、1148、1146、1861、1847、1791、1805、1875、1818或1833中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：1143、1147、1145、1860、1846、1790、1804、1874、1818或1832中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与1143、1147、1145、1860、1846、1790、1804、1874、1818或1832的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1144、1148、1146、1861、1847、1791、1805、1875、1818或1833中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：1144、1148、1146、1861、1847、1791、1805、1875、1818或1833所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。应该理解，在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如85％(90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的FAPαxCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原FAPα是种间特异的。

IGF-1RxCD3

根据本发明的优选实施方式，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合域中包含一组选自由以下组成的组的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3：

a)SEQ ID NO：2016-2018的CDR H1-3和SEQ ID NO：2021-2023的CDR L1-3；

b)SEQ ID NO：2030-2032的CDR H1-3和SEQ ID NO：2035-2037的CDR L1-3；

c)SEQ ID NO：2044-2046的CDR H1-3和SEQ ID NO：2049-2051的CDR L1-3；

d)SEQ ID NO：2058-2060的CDR H1-3和SEQ ID NO：2063-2065的CDR L1-3；

e)SEQ ID NO：2072-2074的CDR H1-3和SEQ ID NO：2077-2079的CDR L1-3；

f)SEQ ID NO：2086-2088的CDR H1-3和SEQ ID NO：2091-2093的CDR L1-3；

g)SEQ ID NO：2100-2102的CDR H1-3和SEQ ID NO：2105-2107的CDR L1-3；

h)SEQ ID NO：2114-2116的CDR H1-3和SEQ ID NO：2119-2121的CDR L1-3；

i)SEQ ID NO：2128-2130的CDR H1-3和SEQ ID NO：2133-2135的CDR L1-3；

j)SEQ ID NO：2142-2144的CDR H1-3和SEQ ID NO：2147-2149的CDR L1-3；

k)SEQ ID NO：2156-2158的CDR H1-3和SEQ ID NO：2161-2163的CDR L1-3；

l)SEQ ID NO：2170-2172的CDR H1-3和SEQ ID NO：2175-2177的CDR L1-3；

m)SEQ ID NO：2184-2186的CDR H1-3和SEQ ID NO：2189-2191的CDR L1-3；

n)SEQ ID NO：2198-2200的CDR H1-3和SEQ ID NO：2203-2205的CDR L1-3；和

o)SEQ ID NO：2212-2214的CDR H1-3和SEQ ID NO：2217-2219的CDR L1-3。

本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域的相应VL区和VH区的序列以及各scFv示于序列表中。

如所附实施例的例示，在本发明的双特异性单链抗体分子中，结合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的顺序排列。优选地，结合域以VH IGF-1R-VL IGF-1R-VH CD3-VL CD3或VL IGF-1R-VH IGF-1R-VH CD3-VL CD3的顺序排列。

本发明的尤其优选的实施方式涉及以上表征的多肽，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO：2027、2041、2055、2069、2083、2097、2111、2125、2139、2153、2167、2181、2195、2209或2223中任一个所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：2028、2042、2056、2070、2084、2098、2112、2126、2140、2154、2168、2182、2196、2210或2224中任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和

(c)与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少96％的同一性的氨基酸序列。

本发明涉及包含SEQ ID NO：2027、2041、2055、2069、2083、2097、2111、2125、2139、2153、2167、2181、2195、2209或222中任一个所示的氨基酸序列的双特异性单链抗体分子，还涉及与SEQ ID NO：2027、2041、2055、2069、2083、2097、2111、2125、2139、2153、2167、2181、2195、2209或2223的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO：2028、2042、2056、2070、2084、2098、2112、2126、2140、2154、2168、2182、2196、2210或2224中任一个所示的相应核酸序列，还涉及与SEQ ID NO：2028、2042、2056、2070、2084、2098、2112、2126、2140、2154、2168、2182、2196、2210或2224所示的核酸序列具有至少85％同一性，优选90％同一性，更优选至少95％同一性，最优选至少96、97、98或99％同一性的的核酸序列。应该理解，在整个核酸或氨基酸序列上测定序列同一性。为了序列比对，可以使用例如，包含在GCG软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)中的Gap或BestFit程序(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970)，443-453；Smith和Waterman，Adv.Appl.Math 2(1981)，482-489)。测定并鉴定出与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如85％(90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列是本领域技术人员的常规方法。例如，根据Crick摆动假说，反密码子上的5′碱基在空间上的限制不如其它两个碱基，并因此可能具有非标准的碱基配对。换而言之，密码三联体的第三个位置可以变化，从而使在第三个位置不同的两个三联体可以编码同一氨基酸残基。所述假说是本领域技术人员熟知的(参见，例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick，J Mol Biol 19(1966)：548-55)。

本发明的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体构建体的优选结构域排列示于以下实例中。

在本发明的优选实施方式中，双特异性单链抗体对于CD3ε以及其第二结构域识别的人和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原IGF-1R是种间特异的。

在可选的实施方式中，本发明提供了编码以上描述的本发明双特异性单链抗体分子的核酸序列。

本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体。

分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，载体的选择应基于期望的功能目，并包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和遗传工程中常规使用的其他载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建多种质粒和载体，参见，例如Sambrook等(上述引文中)和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.(1989)，(1994)中描述的技术。可选地，本发明多核苷酸和载体可重建入脂质体中用于向靶细胞递送。如下文更详细讨论的，使用克隆载体来分离单独的DNA序列。需要在表达载体中表达特定多肽时，可将相关序列转移进入该表达载体。一般的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。一般的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。

优选地，所述载体包含作为可操作地连接至本文定义的所述核酸序列的调节序列的核酸序列。

术语“调节序列”是指实现与其连接的编码序列的表达所必须的DNA序列。这类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子和在一些情况下的增强子、反式激活蛋白或转录因子。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达是必要的最少的所有组件(component)，并还可包括另外的有利组件。

术语“可操作地连接”是指其中所描述的组件的相互关系允许它们按照其预期方式发挥作用的并列。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下被完成的方式连接。在控制序列为启动子的情况下，对于本领域技术人员而言，优选使用双链核酸是显而易见的。

因此，所述载体优选为表达载体。“表达载体”是可用于转化选定宿主并提供编码序列在选定宿主中表达的构建体。表达载体可以是，例如克隆载体、二元载体或整合型载体。表达包括核酸分子优选地转录为可翻译的mRNA。本领域技术人员熟知保证原核和/或真核细胞中的表达的调节元件。在真核细胞的情况下，调节元件通常包括保证转录起始的启动子和可选的保证转录结束和转录物稳定的多聚腺苷酸信号。允许原核宿主细胞中的表达的可能调节元件包括例如大肠杆菌中的P_L、lac、trp或tac启动子，而允许真核宿主细胞中的表达的调节元件实例为酵母中的AOX1或GALl启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。

除负责转录起始的元件外，这类调节元件还可包括位于多核苷酸下游的转录终止信号，例如SV40-多聚腺苷酸位点或tk-多聚腺苷酸位点。另外，根据使用的表达系统，可以向所述核酸序列的编码序列添加能够将多肽定向至细胞区室或将其分泌到培养基中的前导序列，并且这些前导序列都是本领域所熟知的，还参阅所附实施例。前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列装配，并优选为能够引导所翻译的蛋白或其一部分分泌到周质间隙或细胞外培养基中的前导序列。任选地，异源序列可编码包括被赋予期望特性的N-末端鉴定肽的融合蛋白，其中所述特性例如所表达的重组产物的稳定性或简化纯化，见上文。在本文中，合适的表达载体为本领域已知，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Mack等PNAS(1995)92，7021-7025和Raum等，Cancer Immunol Immunother(2001)50(3)，141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。

优选地，所述表达控制序列为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可以使用原核宿主的控制序列。在将载体引入到适当的宿主中后，所述宿主就被保持在适合高水平表达核苷酸序列的条件下，并根据需要随后收集并纯化本发明的双特异性单链抗体分子，参见，例如所附实施例。

可用来表达细胞周期相互作用蛋白的另一表达系统为昆虫系统。在一个这类系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa calirornica)核型多角体病毒(AcNPV)作为在秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。可将所述核酸分子的编码序列克隆到该病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并置于多角体蛋白启动子的控制之下。所述编码序列的成功插入将使多角体蛋白基因失活并产生缺少衣壳蛋白外壳的重组病毒。然后使用该重组病毒来感染其中表达有本发明的蛋白的秋夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫(Smith，J.Virol.46(1983)，584；Engelhard，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91(1994)，3224-3227)。

其他调节元件可包括转录和翻译增强子。有利地，本发明上述载体包括选择性(selectable)和/或获取性(scorable)标记物。

用于选择经转化的细胞和例如植物组织和植物的选择性标记物基因是本领域技术人员熟知的，并包括例如以抗代谢物抗性作为选择基础的赋予甲氨蝶吟抗性的dhrr(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994)，143-149)；赋予氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素抗性的npt(Herrera-Estrella，EMBO J.2(1983)，987-995)和赋予潮霉素抗性的hygro(Marsh，Gene 32(1984)，481-485)。已描述了其他的选择性基因，即允许细胞使用吲哚代替色氨酸的trpB，允许细胞使用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，8047)，允许细胞利用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶(WO 94/20627)和赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue，1987，In：Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory edt.)或来自土曲霉(Aspergillus terreus)的赋予杀稻瘟素(Blasticidin S)抗性的脱氨基酶(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)，2336-2338)。

有用的获取性标记物也是本领域技术人员已知的，并可商业获得。有利的是，所述标记物为编码荧光素酶(Giacomin，PI.Sci.116(1996)，59-72；Scikantha，J.Bact.178(1996)，121)、绿色荧光蛋白(Gerdes，FEBS Lett.389(1996)，44-47)或β-葡糖醛酸酶(Jefferson，EMBO J.6(1987)，3901-3907)的基因。该实施方式特别适用于简单快速筛选含有所述载体的细胞、组织和生物体。

如上所述，为了例如纯化以及基因治疗的目的，可单独或作为载体的一部分使用所述核酸分子，以在细胞中表达本发明的双特异性单链抗体分子。将含有编码本发明上述任一双特异性单链抗体分子的DNA序列的核酸分子或载体引入细胞，所述细胞随后产生感兴趣的多肽。以通过离体或体内技术向细胞引入治疗基因为基础的基因疗法是基因转移最重要的应用之一。合适用于体外或体内基因疗法的载体、方法或基因递送系统在文献中有描述并是本领域技术人员已知的；参加，例如Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813；Verma，Nature 389(1994)，239；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodera，Blood 91(1998)，30-36；Verma，Gene Ther.5(1998)，692-699；Nabel，Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997)，289-292；Verzeletti，Hum.Gene Ther.9(1998)，2243-51；Wang，Nature Medicine 2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957、US 5,580,859；US 5,589,466；或Schaper，Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，635-640；dos Santos Coura and Nardi Virol J.(2007)，4：99。所述核酸分子和载体可经设计而直接引入细胞或通过脂质体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入细胞。优选所述细胞为种系细胞、胚细胞或卵细胞或由此衍生的细胞，最优选所述细胞为干细胞。胚胎干细胞的实例可以为特别是如Nagy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，8424-8428中所述的干细胞。

本发明还提供用本发明载体转化或转染的宿主。可通过向宿主中引入本发明上述载体或本发明上述核酸分子而产生所述宿主。至少一种载体或至少一种核酸分子在所述宿主中的存在可介导编码上述单链抗体构建体的基因的表达。

上述被引入宿主的本发明核酸分子或载体可以整合进宿主基因组中或其可以保持在染色体之外。

宿主可以是任何原核或真核细胞。

术语“原核生物”旨在包括所有可以用DNA或RNA分子转化或转染以表达本发明蛋白的细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核的”旨在包括酵母、高等植物、昆虫和优选的哺乳动物细胞。根据重组产生方法中使用的宿主，本发明多核苷酸编码的蛋白可以是糖基化的或可以是非糖基化的。特别优选使用含有本发明双特异性单链抗体分子的编码序列并用遗传学手段向其中融合了N-末端FLAG标签和/或C-末端His标签的质粒或病毒。优选所述FLAG标签长度为约4-8个氨基酸，最优选8个氨基酸。可通过本领域普通技术人员公知的任何技术利用上述多核苷酸转化或转染宿主。此外，用于制备融合的、可操作地连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法为本领域所公知(Sambrook，上述引文)。

优选所述宿主为细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。

特别地，认为所述宿主可以是哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞包括CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞系如SP2/0或NS/0。如所附实施例中所例示的，特别优选CHO细胞作为宿主。

更优选所述宿主为人细胞或人细胞系，例如per.c6(Kroos，Biotechnol.Prog.，2003，19：163-168)。

在进一步的实施方式中，本发明因此涉及用于产生本发明双特异性单链抗体分子的方法，所述方法包括在允许表达本发明双特异性单链抗体分子的条件下培养本发明宿主并从培养物中回收产生的多肽。

转化的宿主可以在发酵罐中生长并根据本领域已知技术培养以达到最佳细胞生长。然后可从生长培养基、细胞裂解产物或细胞膜级分中分离本发明的双特异性单链抗体分子。可通过任何常规方法例如制备型色谱分离和免疫分离来分离和纯化例如微生物所表达的本发明双特异性单链抗体分子，其中所述免疫分离例如涉及针对如本发明双特异性单链抗体分子标签的单克隆或多克隆抗体的使用或如所附实施例中所述的。

本领域已知允许表达的宿主培养条件依赖于这类方法中使用的宿主系统和表达系统/载体。本领域已知为达到允许重组多肽表达的条件而需进行修饰的参数。因此，本领域技术人员可以无需更多的创造性投入即可确定合适的条件。

表达后可根据本领域标准方法纯化本发明双特异性抗体单链抗体分子，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱层析和凝胶电泳等，参见，Scopes，“Protein Purification”，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。对于制药用途而言，优选具有至少约90％到95％均一性的基本纯的多肽，更优选98％-99％或更高均一性的基本纯的多肽。如根据需要部分纯化或纯化至均一后，可将本发明双特异性单链抗体分子用于治疗(包括体外地)或用于开发和实施测定方法。此外，用于从培养物中回收本发明双特异性单链抗体分子的方法实例在附带的实施例中详细描述。还可以通过用于分离能够与人和非黑猩猩灵长类CD3ε的表位结合的本发明双特异性单链抗体分子的方法实现回收，所述方法包括以下步骤：

(a)使所述多肽与通过其C-末端固定至固相的包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly(SEQ ID NO.341)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.342)的最大27个氨基酸的CD3ε的细胞外结构域接触；

(b)从所述片段洗脱结合的多肽；和

(c)从(b)的洗脱物分离所述多肽。

优选通过本发明的上述方法分离的多肽是人的。

分离本发明的双特异性单链抗体分子的这种方法理解为是从多种候选多肽中分离出对包含N-末端氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly(SEQ ID NO.341)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.342)的CD3ε的细胞外结构域片段具有相同特异性的一种或多种不同多肽的方法，以及用于从溶液中纯化多肽的方法。后一种用于从溶液中纯化双特异性单链抗体分子的方法的非限制性实例为，例如从培养物上清或从此培养物的制备物中纯化重组表达的双特异性单链抗体分子。

如上所述，在该方法中使用的片段是灵长类CD3ε分子的细胞外结构域的N-末端片段。不同物种的CD3ε分子的细胞外结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1、3、5和7。N-末端八氨基酸序列(octamer)的两种形式示于SEQ ID NO：341和342。优选这种N-末端对于本发明方法待鉴定的多肽的结合是自由可用的(freely available)。在本发明上下文中术语“自由可用”理解为没有另外的基序(motives)，例如His-标签。这种His-标签对本发明方法鉴定的结合分子的干扰描述于所附的实施例6和20。

根据本发明方法，所述片段通过其C-末端固定于固相。本领域技术人员将容易地和不需要任何创造性劳动地按照本发明方法所用的实施方式来选择合适的固相支持体。固相支持体的实例包括但不限于基质例如珠(如，琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、葡聚糖珠)、板(培养板或多孔板)以及已知的例如来自Biacore的芯片。将片段固定/固定化于所述固相支持体的手段和方法的选择取决于所述固相支持体的选择。固定/固定化的常用方法是通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶联。支持这种偶联的化学原理以及固定/固定化的可选方法是本领域技术人员已知的，例如来自Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，Inc.(1996)。为了固定于/固定化到色谱支持体上，常用以下手段：NHS活化的琼脂糖凝胶(如，GE Life Science-Amersham的HiTrap-NHS)、CnBr活化的琼脂糖凝胶(如，GE Life Science-Amersham)、NHS活化的葡聚糖珠(Sigma)或活化的聚甲基丙烯酸酯。这些试剂还可用于批处理方法。此外，包括氧化铁的葡聚糖珠(如，从Miltenyi可得)可用于批处理方法。这些珠可以和用于将所述珠从溶液分离的磁体联合使用。可通过使用NHS活化的羧甲基葡聚糖将多肽固定在Biacore芯片(如CM5芯片)上。合适的固相支持体的进一步实例是胺反应性的多孔板(如Nunc Immobilizer^TM板)。

根据本发明方法，所述CD3ε的细胞外结构域片段可直接或经由一段氨基酸偶联于固相支持体，其中所述一段氨基酸可为连接子或另一蛋白/多肽部分。可选地，CD3ε的细胞外结构域可通过一个或多个连接分子间接偶联。

洗脱与被固定的表位结合的肽的手段和方法是本领域公知的。从洗脱物分离所鉴定的多肽的方法也如此。

从多个候选多肽分离对在其N-末端包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly的CD3ε的细胞外结构域片段具有相同特异性的一个或多个不同双特异性单链抗体分子的方法可包括选择抗原特异性分子的如下方法的一个或多个步骤：

CD3ε特异性结合域可选自抗体衍生库(antibody derived repertoire)。噬菌体展示文库可根据标准方法构建，例如在“Phage Display：A Laboratory Manual”；Ed.Barbas，Burton，Scott & Silverman；冷泉港实验室出版社，2001中所公开的方法。抗体文库中抗体片段的形式可为scFv，但通常还可为Fab片段或甚至是单结构域抗体片段。对于抗体片段的分离，可使用天然抗体片段文库。为了在随后治疗应用中选择潜在的低免疫原性结合分子，人抗体片段文库对于直接选择人抗体片段可能是有利的。在一些情况下，它们可形成合成抗体文库的基础(Knappik等J Mol.Biol.2000，296：57 ff)。相应的形式可以为Fab、scFv(如下文所述)或结构域抗体(dAbs，如Holt等，Trends Biotechnol.2003，21：484 ff中综述的)。

本领域还已知的是，在许多情况下都没有针对靶抗原的可用的免疫人抗体源。因此，用靶抗原免疫动物并从动物组织如脾脏或PBMC分离相应的抗体文库。N-末端片段可被生物素酰化(biotinylated)或共价连接于蛋白如KLH或牛血清白蛋白(BSA)。根据常用方法，使用啮齿类动物用于免疫。出于其它原因，例如存在衍生自骆驼类物种(cameloid species)的单结构域抗体(VHH)，非人来源的一些免疫抗体库可能尤其有利(如描述于Muyldermans，J Biotechnol.74：277；De Genst等，Dev Como Immunol.2006，30：187 ff)。因此，抗体文库相应的形式可为Fab、scFv(如下述的)或单结构域抗体(VHH)。

在一种可能的方法中，可以用全细胞，例如表达跨膜EpCAM的全细胞免疫由balb/c x C57黑鼠杂交的10周龄F1小鼠，其中所述EpCAM以作为翻译融合体在N-末端展示成熟CD3ε链的N-末端氨基酸1-27。或者，可以用1-27CD3ε-Fc融合蛋白免疫小鼠(相应的方法描述在所附实施例2)。加强免疫后，可获取血液样品并可在例如FACS分析中测试针对CD3阳性T细胞的抗体血清滴度。通常，免疫动物中的血清滴度显著高于未免疫动物中的血清滴度。

免疫的动物可形成构建免疫抗体文库的基础。这种文库的实例包括噬菌体展示文库。这种文库可通常基于标准方法构建，例如通过″Phage Display：A Laboratory Manual″；Ed.Barbas，Burton，Scott & Silverman；冷泉港实验室出版社，2001中所公开的方法。

所述非人抗体也可经由噬菌体展示而被人源化，由于产生更多种多样的抗体文库，该抗体文库可随后在选择期间富集结合子(binder)。

在噬菌体展示方法中，展示抗体文库的任一个噬菌体池形成了利用相应抗原作为靶分子筛选结合分子的基础。分离结合有抗原的抗原特异性噬菌体的核心步骤称为淘选(panning)。由于抗体片段在噬菌体表面上的展示，该一般方法被称为噬菌体展示。一个优选的筛选方法是使用小蛋白，例如通过翻译融合于噬菌体展示的scFv的N-末端的丝状噬菌体N2结构域。本领域已知的可用于分离结合分子的另一展示方法是核糖体展示方法(综述于Groves & Osbourn，Expert Opin Biol Ther.2005，5：125 ff；Lipovsek & Pluckthun，J Immunol Methods 2004，290：52 ff)。为了证明scFv噬菌体粒子结合于1-27CD3ε-Fc融合蛋白，可以通过PEG(聚乙二醇)从相应的培养物上清液收集荷载克隆的scFv库的噬菌体文库。ScFv噬菌体粒子可与固定化的CD3ε Fc融合蛋白一起温育。固定化的CD3ε Fc融合蛋白可包被于固相。可洗脱结合分子，且洗脱物可用于感染新鲜的未感染的细菌宿主。成功地被编码人scFv片段的噬菌粒拷贝转导的细菌宿主可再次进行羧苄青霉素抗性筛选，并接着被例如VCMS 13辅助噬菌体感染而开始第二轮抗体展示和体外筛选。通常总共进行4-5轮筛选。可以使用流式细胞试验在CD3ε阳性Jurkat细胞、HPBall细胞、PBMC或具有融合至表面展示的EpCAM的N-末端CD3ε序列的转染的真核细胞上测试所分离的结合分子的结合(参见所附实施例4)。

优选地，以上方法可以是这样的方法，其中所述CD3ε的细胞外结构域的片段由具有SEQ ID NO.2、4、6或8所示的任何一个氨基酸序列的多肽的一个或多个片段组成。更优选地，所述片段的长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个氨基酸残基。

鉴定双特异性单链抗体分子的这个方法可以是筛选多个包含与人和非黑猩猩灵长类CD3ε的表位结合的种间特异性结合域的双特异性单链抗体分子的方法。或者，所述鉴定方法是纯化/分离包含与人和非黑猩猩灵长类CD3ε的表位结合的种间特异性结合域的双特异性单链抗体分子的方法。

此外，本发明还提供了包含本发明的或用如上公开的方法产生的双特异性单链抗体分子的组合物。优选地，所述组合物为药物组合物。

本发明还提供了本文定义的或用本文定义的方法产生的双特异性单链抗体分子，其中，所述双特异性单链抗体分子用于预防、治疗或改善癌症或自体免疫疾病。

优选对于PSCAxCD3双特异性单链抗体分子，所述癌症是前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌。

对于CD19xCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是B-细胞恶性肿瘤，例如B-NHL(B细胞性非霍奇金淋巴瘤)、B-ALL(急性B淋巴细胞白血病)、B-CLL(慢性B淋巴细胞白血病)或多发性骨髓瘤(其中本发明的双特异性单链抗体分子有利地去除CD19阳性的癌干细胞/癌启动细胞)。然而，所述双特异性单链抗体分子还用于B细胞介导的自体免疫疾病或与病原性B细胞有关的自体免疫疾病的预防、治疗或改善。

对于c-METxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是癌，肉瘤，胶质母细胞瘤/星形细胞瘤，黑色素瘤，间皮瘤，肾母细胞瘤或造血系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。利用所述双特异性单链抗体可以治疗的多种癌症类型的全面列表可见于http://www.vai.org/met/。

对于内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症包括但不限于癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤和神经外胚层肿瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)。

对于EpCAMxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是上皮癌或微量残留癌。

对于FAPαxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是上皮癌。

对于IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌是骨或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈癌和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。或者，IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子还用于预防、治疗或改善自身免疫疾病，优选银屑病。

优选所述双特异性单链进一步包括载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。此外，优选所述双特异性单链抗体分子适合与另外的药物联合施用。所述药物可以为非蛋白质化合物或蛋白质化合物，并且可以与本文定义的双特异性单链抗体分子同时或不同时施用。

根据本发明，术语“药物组合物”是指用于对患者，优选人患者施用的组合物。本发明特别优选的药物组合物包含针对背景独立的CD3表位并针对其产生的双特异性单链抗体。优选地，药物组合物包含载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。在优选的实施方式中，药物组合物包括用于肠胃外、透皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或通过直接注射入组织的组合物。特别地，认为所述组合物通过输注或注射施用给患者。可通过不同的路径施用适当的组合物，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或真皮内施用。特别地，本发明提供了所述合适的组合物的不间断施用。作为非限制性实例，不间断、即连续的施用可通过小泵系统来实现，其中所述小泵系统由患者佩戴以计量治疗剂进入患者体内的流量。可通过使用所述泵系统施用包含针对本发明的背景独立的CD3表位并针对其产生的双特异性单链抗体的药物组合物。此类泵系统通常为本领域已知，并且通常取决于定期更换的、含有要输入治疗剂的药筒。当在此泵系统中更换药筒时，不间断地流入患者体内的治疗剂会随之发生暂时中断。在这种情况下，替换药筒之前的施用阶段和替换药筒之后的施用阶段仍被认为在本发明的药物治疗手段和方法的含义范围内，并且共同组成此类治疗剂的一种“不间断的施用”。

本发明的这些针对背景独立的CD3表位并针对其产生的双特异性单链抗体的连续或不间断的施用可以是通过流体递送设备或小泵系统而通过静脉内或皮下施用的，其中所述流体递送设备或小泵系统包括一个用于将流体从储器中推出的流体推动装置和一个用于驱动所述推动装置的驱动装置。用于皮下施用的泵系统可包括用以穿透患者皮肤并递送合适组合物到患者身体的针头或插管。所述泵系统可独立于静脉、动脉或血管直接固定或连接于患者皮肤，从而允许泵系统和患者皮肤之间直接接触。泵系统可连接到患者皮肤持续24小时至数天。泵系统可为小尺寸的，并带有一个小容积的储器。作为非限制性实例，合适待施用的药物组合物的储器容积可为0.1ml-50ml。

所述连续施用可以是通过贴在皮肤上并以一定时间间隔更换的贴片来透皮施用。本领域技术人员知晓适合这个目的药物递送贴片系统。应当注意，透皮施用尤其适合连续施用，因为更换第一张用完的贴片可以通过同时将其替换为第二张新贴片来方便地实现，例如贴在紧邻第一张用完的贴片的皮肤表面上，并且在除去第一张贴片前即刻进行。不产生流动中断问题或电池故障问题。

包含尤其是针对背景独立的CD3表位并针对其产生的双特异性单链抗体的本发明组合物可进一步包含药学上可接受的载体。合适药物载体的实例是本领域熟知的并包括溶液，如，磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。可以通过已知的常规方法配制包含这种载体的组合物。制剂可包含碳水化合物、缓冲溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可以是非还原性糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸酯(octasulfate)、山梨糖醇或木糖醇。这种制剂可用于连续施用，所述连续施用可以为利用和/或不利用泵系统的静脉内或皮下施用。氨基酸可为带电荷的氨基酸，优选赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸。表面活性剂可为优选分子量＞1.2KD的去污剂，和/或优选分子量＞3KD的聚醚。优选去污剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85。优选聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。用于本发明的缓冲系统可具有优选5-9的pH，并可包括柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和乙酸盐。本发明的组合物可以合适剂量施用于受试者，所述合适剂量可以例如通过向非黑猩猩灵长类(例如猕猴)施用剂量增加的显示本文所述的种间特异性的本发明双特异性单链抗体分子的剂量增强研究而确定。如上所述，显示本文所述的种间特异性的本发明双特异性单链抗体分子可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类的临床前试验和作为用于人的药物。这些组合物还可与其它蛋白质和非蛋白质药物联合施用。这些药物可以与包含本文定义的双特异性单链抗体分子的本发明组合物同时施用或以定期的间隔和剂量在施用所述双特异性单链抗体分子之前或之后分开施用。给药方案由主治医师和临床因素确定。如医药领域中众所周知，用于任意一个患者的剂量依赖于多种因素，包括患者身材大小、体表面积、年龄、将施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、健康状况和同时施用的其它药物。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬剂和乳液。不含水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯类如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/含水溶液、乳液或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养物补充剂和电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可存在防腐剂和其它添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。另外，本发明的组合物可以包含优选人来源的蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白。可以设想，除了本文定义的本发明双特异性单链抗体分子之外，本发明的组合物可以进一步包含生物活性剂，这依赖于该组合物的计划用途。此类试剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞生长抑制剂的药物、防止高尿酸血症(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的例如细胞因子的物质。

可以通过，例如细胞毒性测定确定本文定义的药物组合物的生物活性，如在以下实施例、WO 99/54440或Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)的描述。本文所用的“效力”或“体内效力”是指对本发明药物组合物治疗的响应，其使用例如标准化的NCI响应标准。使用本发明药物组合物治疗的成功或体内效力是指组合物对其预期目的的有效性，即组合物导致其期望效应即受刺激的去除病理性细胞如肿瘤细胞的能力。体内效力可由针对各疾病实体建立的标准方法监测，所述方法包括但不限于白细胞计数、差异分析(differentials)、荧光激活细胞分选术、骨髓穿刺。此外，还可以使用多种疾病特异性临床化学参数和其它已建立的标准方法。而且，可以使用例如计算机辅助的X射线断层术、X射线、核磁共振X射线断层术(如，基于国家癌症研究所标准的响应评估[Cheson BD，Horning SJ，Coiffier B，Shipp MA，Fisher RI，Connors JM，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris NL，Armitage JO，Carter W，Hoppe R，Canellos GP.Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin’s lymphomas.NCI Sponsored International Working Group.J Clin Oncol.1999 Apr；17(4)：1244])、正电子发射X射线断层扫描、白细胞计数、差异分析(differentials)、荧光激活细胞分选术、骨髓穿刺、淋巴结活组织切片/组织学和多种癌症的特异性临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)以及其它已建立的标准方法。

药物(例如本发明药物组合物)开发中的另一主要挑战是药物代谢动力学性质的可预测性调节。为此，建立候选药物的药物代谢动力学概况，即实现特定药物治疗给定病况的能力的药物代谢动力学参数的概况。影响药物治疗特定疾病实体的能力的药物的药物代谢动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容积、肝首过代谢和血清结合度。给定药剂的效力可被上述各参数影响。

“半衰期”指被施用的50％的药物通过生物过程(例如代谢、排泄等)被除去所用的时间。

“肝首过代谢”指药物首次接触肝时即在肝中首过期间被代谢的倾向。“分布容积”指药物经身体各区室如细胞内和细胞外间隙、组织和器官等的保留度和药物在这些区室中的分布。“血清结合度”指药物与血清蛋白(例如白蛋白)相互作用和结合的倾向，导致药物生物活性减少或丧失。

药物代谢动力学参数还包括所施用的给定量药物的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收率以及再起始和/或Cmax。

“生物利用度”指药物在血液区室中的量。

“滞后时间”指在药物的施用和它在血液或血浆中被检测和测量到之间的时间延迟。

“Tmax”是药物达到最大血液浓度的时间，而“Cmax”是给定药物获得的最大血液浓度。达到所述药物的生物效应所需的血液或组织浓度的时间受所有参数影响。如Schlereth等人的出版物(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)也陈述了显示种间特异性的本发明双特异性单链抗体分子的药物代谢动力学参数，其可在如上列出的非黑猩猩灵长类中进行的临床前动物试验中确定。

本文所用的术语“毒性”是指药物显露在不良事件或严重不良事件中的毒性效应。这些副作用可能指施用后药物的全身耐受性的缺乏和/或局部耐受性的缺乏。毒性还可包括药物引起的致畸或致癌效应。

本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了在药物施用后当即(局部耐受性)和长期应用中不引起严重不良事件的药物施用。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可在例如治疗和随访期中以规律的间隔评估。测量包括临床评估如器官表现，以及实验室异常的筛查。临床评估可以实施并偏向于根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码的正常发现。器官表现可包括例如不良事件通用术语标准v3.0(CTCAE)中所列的标准，诸如过敏反应/免疫学、血液/骨髓、心律不齐和凝集等。可检测的实验室参数包括，例如血液学、临床化学、凝集概况和尿分析，以及其它体液诸如血清、血浆、淋巴液或脊髓液和液体的检查。因此可评价安全性，如通过身体检查、成像技术(即超声波、x-射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、使用技术设备的其它测量(即心电图)、生命特征、通过测量实验室参数并记录不良事件。例如，可通过组织病理学和/或组织化学方法检查本发明的用途和方法在非黑猩猩灵长类中的不良事件。

本文所用的术语“有效且无毒的剂量”是指本文定义的双特异性单链抗体的可耐受剂量，所述剂量足够高以引起病理性细胞的消除、肿瘤的去除、肿瘤的收缩或疾病的稳定，而不会或基本不会引起大的毒性效应。这种有效且无毒的剂量可通过如本领域中描述的剂量增强研究来确定，并应低于引起严重不良事件(剂量限制性毒性，DLT)的剂量。

以上术语在例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH Steering Committee meeting on July 16，1997中也有提及。

此外，本发明还涉及用于预防、治疗或改善癌症或自体免疫疾病的包含本发明的或由本发明的方法产生的双特异性单链抗体分子的药物组合物。

对于PSCAxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌。

对于CD19xCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是B-细胞恶性疾病，例如非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自体免疫疾病或B细胞的去除。

对于c-METxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是癌，肉瘤，胶质母细胞瘤/星形细胞瘤，黑色素瘤，间皮瘤，肾母细胞瘤或造血系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

对于内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤或神经外胚瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)。

对于EpCAMxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是上皮癌或微量残留癌。

对于FAPαxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌症是上皮癌。

对于IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子，优选所述癌是骨或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈癌和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。或者，上文定义的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子/多肽还用于预防、治疗或改善自身免疫疾病，优选银屑病。

优选地，所述药物组合物进一步包含载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。

本发明再一方面涉及本文以上定义的或由本文以上定义的方法产生的双特异性单链抗体分子/多肽用于制备用于预防、治疗或改善疾病的药物组合物的应用。优选所述疾病是癌症或自体免疫疾病。

对于上文定义的PSCAxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌。

对于上文定义的CD19xCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是B-细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自体免疫疾病或B细胞的去除。

对于上文定义的c-METxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是癌，肉瘤，胶质母细胞瘤/星形细胞瘤，黑色素瘤，间皮瘤，肾母细胞瘤或造血系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

对于上文定义的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤或神经外胚瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)。

对于上文定义的EpCAMxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是上皮癌或微量残留癌。

对于上文定义的FAPαxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是上皮癌。

对于上文定义的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，优选所述癌是骨或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈癌和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。或者，上文定义的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子/多肽还用于预防、治疗或改善自身免疫疾病，优选银屑病。

在本发明的双特异性单链抗体分子的应用的另一优选实施方式中，所述药物组合物与另外的药物联合施用，即作为协同治疗(co-therapy)的一部分。在所述协同治疗中，活性剂可任选地与本发明双特异性单链抗体分子包含在同一药物组合物中，或可包含在独立的药物组合物中。在后一种情况下，所述独立的药物组合物适于在施用包含本发明双特异性单链抗体分子的药物组合物之前、同时或之后施用。另外的药物或药物组合物可为非蛋白质化合物或蛋白质化合物。在另外的药物是蛋白质化合物的情况下，蛋白质化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号是有利的。

优选所述蛋白质化合物或非蛋白质化合物可与本发明的双特异性单链抗体分子、上文定义的核酸分子、上文定义的载体、或上文定义的宿主同时或不同时施用。

本发明另一方面涉及用于预防、治疗或改善有此需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括施用本发明有效量的药物组合物的步骤。优选地，所述疾病是癌症或自体免疫疾病。

对于上文定义的PSCAxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌。

对于上文定义的CD19xCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是B-细胞恶性疾病，例如非霍奇金淋巴瘤、B细胞介导的自体免疫疾病或B细胞的去除。

对于上文定义的c-METxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是癌，肉瘤，胶质母细胞瘤/星形细胞瘤，黑色素瘤，间皮瘤，肾母细胞瘤或造血系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

对于上文定义的内皮唾液酸蛋白xCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是癌(乳腺、肾、肺、结肠直肠、结肠、胰腺间皮瘤)，肉瘤或神经外胚瘤(黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤)。

对于上文定义的EpCAMxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是上皮癌或微量残留癌。

对于上文定义的FAPαxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌症是上皮癌。

对于上文定义的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子/多肽，更优选所述癌是骨或软组织癌(例如尤文氏肉瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、宫颈癌和子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。或者，上文定义的IGF-1RxCD3双特异性单链抗体分子/多肽还用于预防、治疗或改善自身免疫疾病，优选银屑病。

在本发明方法的另一优选实施方式中，所述药物组合物适于与另外的药物联合施用，即作为协同治疗的一部分。在所述协同治疗中，活性剂可任选地与本发明双特异性单链抗体分子包含在同一药物组合物中，或可包含在单独的药物组合物中。在后一种情况下，所述单独的药物组合物适于在施用包含本发明双特异性单链抗体分子的药物组合物之前、同时或之后施用。另外的药物或药物组合物可为非蛋白质化合物或蛋白质化合物。在另外的药物是蛋白质化合物的情况下，蛋白质化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号是有利的。

优选地，所述蛋白质化合物或非蛋白质化合物可与本发明的双特异性单链抗体分子、上文定义的核酸分子、上文定义的载体、或上文定义的宿主同时地或非同时地施用。

对本发明上述方法，优选地所述受试者是人。

在再一个方面，本发明涉及包含本发明的双特异性单链抗体分子、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主的试剂盒。

这些和其他实施方式公开于或包含在本发明的说明书和实施例中。免疫学中的重组技术和方法在例如以下文献中被描述：A Laboratory Manual；冷泉港实验室出版社，第3版，2001；Lefkovits；Immunology Methods Manual；The Comprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press，1997；Golemis；Protein-Protein Interactions：A Molecular Cloning Manual；Cold Spring Laboratory Press，2002。关于根据本发明所使用的抗体、方法、应用和化合物中任一个的进一步的文献可从公共图书馆和数据库使用例如电子设备检索。例如，在互联网上可获得的公共数据库“Medline”可以被使用，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/或列在EMBL服务主页http://www.embl.de/services/index.html的进一步的数据库和网址是本领域技术人员已知的，并也可使用例如http://www.google.com而获得。

附图如下：

图1

灵长类CD3ε的N-末端氨基酸1-27与异源可溶蛋白的融合。

图2

该图显示在瞬时转染的293细胞上清液中，检测由与人IgG1的铰链和Fc γ部分和C-末端6个组氨酸标签融合的成熟人CD3ε链的N-末端氨基酸1-27组成的构建体的存在的ELISA试验中测定的四个重复样品的平均吸收值。标注“27 aa huCD3E”的第一个柱显示所述构建体的平均吸收值，标注“无关SN”的第二个柱显示作为阴性对照的无关构建体转染的293细胞上清液的平均值。所述构建体获得的值与阴性对照获得的值的比较清晰地证明了重组构建体的存在。

图3

该图显示在检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的种间特异性抗CD3结合分子与构建体的结合的ELISA试验中测定的四个重复样品的平均吸收值，其中所述构建体包含与人IgG1的铰链和Fcγ部分和C-末端His6标签融合的成熟人CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸。柱从左到右显示被命名为A2J HLP、I2C HLP E2M HLP、F7O HLP、G4H HLP、H2C HLP、E1L HLP、F12Q HLP、F6A HLP和H1E HLP的特异性的平均吸收值。标注“阴性对照”的最右边的柱显示作为阴性对照的鼠抗人CD3抗体的单链制品的平均吸收值。所述抗CD3特异性所获得的值与阴性对照所获得的值的比较清晰地证明了抗CD3特异性与成熟人CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸的强结合。

图4

灵长类CD3ε的N-末端氨基酸1-27与异源性膜结合蛋白的融合。

图5

检测重组跨膜融合蛋白的存在的FACS试验中检测的不同转染子的直方重叠图，其中所述重组跨膜融合蛋白由食蟹猴EpCAM和人、狨猴、绢毛猴、松鼠猴和家猪各自的CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸组成。从左至右和从上至下的直方重叠图分别显示表达包含人27个氨基酸残基(mer)、狨猴27个氨基酸残基、绢毛猴27个氨基酸残基、松鼠猴27个氨基酸残基和猪27个氨基酸残基的构建体的转染子的结果。在单个重叠图上，细线代表作为阴性对照的含有2％的FCS而非抗Flag M2抗体的PBS温育的样品，而粗线显示用抗Flag M2抗体温育的样品。对于每种构建体，所述直方重叠图显示抗FlagM2抗体与转染子的结合，其清楚地证明了所述重组构建体在转染子上的表达。

图6

检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的种间特异性抗CD3结合分子和分别与食蟹猴EpCAM融合的人、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链N-末端氨基酸1-27的结合的FACS试验中被测试的不同转染子的直方重叠图。

图6A：

从左至右和从上至下的直方重叠图显示使用分别被命名为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子进行检测时，表达包含人27个氨基酸残基的1-27 CD3-EpCAM的转染子的结果。

图6B：

从左至右和从上至下的直方重叠图显示使用分别被命名为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子进行检测时，表达包含狨猴27个氨基酸残基的1-27 CD3-EpCAM的转染子的结果。

图6C：

从左至右和从上至下的直方重叠图显示使用分别被命名为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子进行检测时，表达包含绢毛猴27个氨基酸残基的1-27 CD3-EpCAM的转染子的结果。

图6D：

从左至右和从上至下的直方重叠图显示使用分别被命名为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子进行检测时，表达包含松鼠猴27个氨基酸残基的1-27 CD3-EpCAM的转染子的结果。

图6E：

从左至右和从上至下的直方重叠图显示使用分别被命名为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子进行检测时，表达包含猪27个氨基酸残基的1-27 CD3-EpCAM的转染子的结果。

在单个重叠图上，细线代表用作为阴性对照的鼠抗人CD3抗体的单链制品温育的样品，而粗线显示用所示相应的抗CD3结合分子温育的样品。鉴于与猪27个氨基酸残基转染子不结合和图5中显示的构建体的表达水平，直方重叠图显示所检测的完全种间特异性的人双特异性单链抗体的抗CD3特异性对表达分别包含与食蟹猴EpCAM融合的人、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链的N-末端氨基酸1-27的重组跨膜融合蛋白的细胞的特异性强结合，并因此显示所述抗CD3结合分子的多灵长类种间特异性。

图7

用于测定经转染的鼠EL4T细胞上人CD3ε的FACS试验。图像分析显示直方重叠图。粗线显示用抗人CD3抗体UCHT-1温育的经转染细胞。细线代表用小鼠IgG1同种型对照温育的细胞。抗CD3抗体UCHT1的结合清楚地显示了人CD3ε链在经转染的鼠EL4T细胞细胞表面的表达。

图8

在丙氨酸扫描实验中种间特异性抗CD3抗体与丙氨酸突变体的结合。在单独的图中，柱从左到右显示的野生型转染子(WT)和位置1-27的所有丙氨酸突变体的以对数刻度任意单位计算的结合值。所述结合值用下式计算：

在这个方程式中，“样品值”指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图所示特定的丙氨酸突变体的结合程度，“样品”指的是在特定的丙氨酸扫描转染子上测定获得的特定抗CD3抗体的几何平均荧光值，“阴性对照”指的是在特定的丙氨酸突变体上测定获得的阴性对照的几何平均荧光值，UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定获得的UCHT-1抗体的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定获得的特定抗CD3抗体的几何平均荧光值，x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体，wt表示相应的转染子是野生型的。单独的丙氨酸突变位置用野生型氨基酸的单字母代码和该位置的数字标注。

图8A：

该图显示作为嵌合IgG分子表达的种间特异性抗CD3抗体A2J HLP的结果。观察到在位置4(天冬酰胺)、在位置23(苏氨酸)和在位置25(异亮氨酸)突变成丙氨酸后结合活性降低。观察到在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后结合完全丧失。

图8B：

该图显示作为嵌合IgG分子表达的种间特异性抗CD3抗体E2M HLP的结果。观察到在位置4(天冬酰胺)、在位置23(苏氨酸)和在位置25(异亮氨酸)突变成丙氨酸后结合活性降低。观察到在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后结合完全丧失。

图8C：

该图显示作为嵌合IgG分子表达的种间特异性抗CD3抗体H2C HLP的结果。观察到在位置4(天冬酰胺)突变成丙氨酸后结合活性降低。观察到在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸谷氨酰胺后结合完全丧失。

图8D：

显示作为在细胞周质表达的单链抗体的种间特异性抗CD3抗体F12Q HLP的结果。观察到在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后结合完全丧失。

图9

检测种间特异性的抗CD3结合分子H2C HLP与具有和不具有N-末端His6标签的人CD3的结合的FACS试验。

绘制了用野生型人CD3ε链(左侧直方图)或具有N-末端His6标签的人CD3ε链(右侧直方图)转染的EL4细胞系在检测种间特异性的结合分子H2CHLP的结合的FACS试验中测定的直方重叠图。使用作为阴性对照的适当的同种型对照(细线)、作为阳性对照的抗人CD3抗体UCHT-1(虚线)和嵌合IgG分子形式的种间特异性抗CD3抗体H2C HLP(粗线)温育样品。

直方重叠图显示UCHT-1抗体对两个转染子的结合与同种型对照相当，这证明两个重组构建体的表达。直方重叠图还显示抗CD3结合分子H2C HLP只结合野生型人CD3ε链但不结合His6-人CD3ε链。这些结果证明游离的N-末端对于种间特异性的抗CD3结合分子H2C HLP的结合是必要的。

图10

所指的种间特异性双特异性单链构建体对用人MCSP D3转染的CHO细胞、人CD3+T细胞系HPB-ALL、用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119 LnPx的FACS结合分析。按照实施例10中的描述进行FACS染色。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白温育随后用抗his抗体和PE标记的检测抗体温育的细胞。细直方图线表示阴性对照：只用抗his抗体和检测抗体温育的细胞。

图11

所指的种间特异性双特异性单链构建体对用人MCSP D3转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119 LnPx的FACS结合分析。按照实施例10中的描述进行FACS染色。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白温育随后用抗his抗体和PE标记的检测抗体温育的细胞。细直方图线表示阴性对照：只用抗his抗体和检测抗体温育的细胞。

图12

所指的种间特异性双特异性单链构建体对用人MCSP D3转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119 LnPx的FACS结合分析。按照实施例10中的描述进行FACS染色。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白温育随后用抗his抗体和PE标记的检测抗体温育的细胞。细直方图线表示阴性对照：只用抗his抗体和检测抗体温育的细胞。

图13

由再针对(redirect)所示靶细胞系的所指种间特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119 LnPx作为效应细胞，用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例11中的描述进行所述试验。

图14

由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)和B)使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例11中的描述进行所述试验。

图15

由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)和B)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例11中的描述进行所述试验。

图16

由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119 LnPx作为效应细胞，用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例11中的描述进行所述试验。

图17

由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119 LnPx作为效应细胞，用食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例11中的描述进行所述试验。

图18

通过所指单链构建体样品诱导的细胞毒活性测量检测的MCSP和CD3种间特异性的双特异性单链抗体的血浆稳定性，其中所述样品使用50％的人血浆分别在37℃和4℃温育24小时，或在细胞毒性测试之前即刻加入50％的人血浆，或者不加入血浆。用人MCSP转染的CHO细胞作为靶细胞系，而使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞。按照实施例12中的描述进行所述试验。

图19

基本没有循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)的B-NHL患者(表4的患者编号1、7、23、30、31和33)在静脉输注识别常规的背景依赖性CD3表位的CD3结合分子CD19xCD3的初始阶段过程中外周血中绝对T细胞计数(空心方块)的初始下降和恢复(即再分布)。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量显示于患者编号旁的括号内。

图20

(A)在没有循环的CD19阳性靶B细胞(实心三角)并以5μg/m²/24h的初始剂量静脉输注CD19×CD3一天随后突然剂量增加到15μg/m²/24h的连续静脉输注情况下发展为CNS症状的B-NHL患者#19(表4)中的重复T细胞再分布(空心方块)。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。循环T细胞从由5μg/m²/24h开始的治疗触发的第一再分布事件恢复后，从5μg/m²/24h至15μg/m²/24h的逐步剂量增加触发了与主要为精神混乱和定向障碍的CNS症状的发展有关的T细胞再分布第二事件。

(B)以1.5μg/m²重复静脉内推注(bolus infusion)CD19×CD3的情况下发展为CNS症状的B-NHL患者中重复的T细胞再新分布。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。每次推注施用的输注时间是2-4小时。竖向箭头表示推注开始。每次推注施用开始时的数据点显示推注开始前即刻的T细胞计数。每次推注触发了T细胞再分布事件，随后在下次推注前恢复T细胞计数。最后，第三次T细胞再分布事件与在该患者中CNS症状的发展有关。

图21

在没有循环的CD19阳性靶B细胞(实心三角)的B-NHL患者#20(表4)中，在CD19×CD3输注的坡度起始(ramp initiation)期间，即在治疗最初的24小时内流速从几乎为零平稳地逐渐增加至15μg/m²/24h期间，复杂的T细胞再分布模式(空心方块)。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量显示于患者编号旁的括号内。通过在坡度阶段仍增加CD19×CD3的水平，使初次接触CD19×CD3触发的初始再分布后循环血液中重新出现的T细胞部分地被诱导以从循环血液再次消失。

图22

用CD19×CD3治疗期间，具有显著数目的循环CD19阳性靶B(淋巴瘤)细胞(实心三角)的B-NHL患者#13(表4)的T和B细胞计数。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3的剂量显示于患者编号旁边的括号中。开始CD19×CD3输注时T细胞(空心方块)完全从循环消失，且直到外周血的循环CD19阳性B(淋巴瘤)细胞(实心三角)被去除才重新出现。

图23

基本没有循环的CD19阳性靶B细胞(实心三角)且在开始输注CD19×CD3而没有稳定该药物所需的额外HSA的情况下发展为CNS症状(上图)的B-NHL患者#24(表4)中重复的T细胞再分布(空心方块)。循环T细胞从初始再分布首次恢复后，因为缺少稳定HSA而不均匀的药物流量触发了T细胞再分布的第二事件，其与主要是精神混乱和定向障碍的CNS症状的发展有关。当同一患者使用包含稳定药物的额外HSA的CD19×CD3溶液正确地重新开始时，没有观察到重复的T细胞再分布(下图)且患者不再发展为任何CNS症状。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3的剂量显示于患者编号旁边的括号内。

图24

通过单价结合于背景依赖性CD3表位诱导的T细胞粘附至内皮细胞的模型。常规CD3结合分子与CD3ε上其背景依赖性表位的单价相互作用可导致CD3构象的变构改变，随后是募集Nck2到CD3ε的胞质域(Gil等(2002)Cell 109：901)。由于Nck2经由PINCH和ILK直接连接于整合蛋白(Legate等(2006)Nat Rev Mol Cell Biol 7：20)，故在通过常规CD3结合分子(如实施例13的CD19×CD3)与CD3ε上其背景依赖性表位结合而使CD3构象变构改变之后，Nck2向CD3ε胞质域的募集可以通过经内外信号传导将T细胞表面上的整合蛋白瞬时转换为其粘附性更高的同工型而提高T细胞对内皮细胞的粘附。

图25

在实施例14所述的食蟹猴体内研究中使用的CD33-AF5 VH-VL×I2CVH-VL试验材料的细胞毒活性。在CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL浓度增加的标准⁵¹铬释放试验中测定CD33阳性靶细胞的特异性裂解。试验持续时间是18小时。使用猕猴T细胞系4119 LnPx作为效应细胞源。用食蟹猴CD33转染的CHO细胞作为靶细胞。效应细胞与靶细胞的比(E∶T比)是10∶1。根据剂量响应曲线计算半数-最大靶细胞裂解所需的CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL浓度(EC50)，值为2.7ng/ml。

图26

(A)如实施例14所述，CD33阳性单核细胞通过静脉连续输注CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL从食蟹猴外周血的剂量和时间依赖性去除。显示柱上所示治疗期后两只食蟹猴各自在每个剂量水平的循环CD33阳性单核细胞绝对计数相对于基线(即100％)的百分比。剂量水平(即输注流速)在柱下显示。在以30μg/m²/24h的剂量处理7天的动物1和2中没有观察到循环的CD33阳性单核细胞的去除。在以60μg/m²/24h的剂量处理7天的动物3和4中，循环的CD33阳性单核细胞计数分别减少至基线的68％和40％。以240μg/m²/24h处理3天后几乎完全去除了外周血中的循环CD33阳性单核细胞(动物5和6)。以1000μg/m²/24h处理1天后已经完成了外周血内循环CD33阳性单核细胞的去除(动物7和8)。

(B)以120μg/m²/24h连续输注CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL 14天期间，两只食蟹猴外周血中T细胞和CD33单核细胞计数的过程。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。在开始输注的最初12小时期间的CD33单核细胞初始动员后，在进一步输注期间外周血中CD33单核细胞(实心三角)相对于相应的基线计数被去除了三分之二(动物10)和50％(动物9)。循环T细胞计数(空心方块)显示有限的初始下降，随后在仍存在循环CD33阳性单核靶细胞期间恢复。

图27

在实施例15所述的食蟹猴体内研究中使用的MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL试验材料的细胞毒活性。在MCSP-G4VH-VL x I2C VH-VL浓度增加的标准⁵¹铬释放试验中测定MCSP阳性靶细胞的特异性裂解。试验持续时间是18小时。使用猕猴T细胞系4119 LnPx作为效应细胞源。用食蟹猴MCSP转染的CHO细胞作为靶细胞。效应细胞与靶细胞的比(E∶T比)是10∶1。根据剂量响应曲线计算半数-最大靶细胞裂解所需的MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL浓度(EC50)，值为1.9ng/ml。

图28

在静脉内输注识别基本背景独立的CD3表位的CD3结合分子MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL的初始阶段期间，食蟹猴外周血中不存在绝对T细胞计数下降并随后恢复(即再分布)的初始事件。绝对细胞计数以1000个细胞/μl血液表示。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL剂量表示于动物号旁边的括号内。在已知食蟹猴循环血液中不存在MCSP阳性靶细胞时，不经由靶细胞介导的CD3交联来诱导T细胞再分布(即绝对T细胞计数下降并随后恢复的初始事件)。而且，可通过使用识别基本背景独立的CD3表位的CD3结合分子如MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL而避免经由信号(其中T细胞可通过仅与CD3结合位点的排它的相互作用而接受该信号)的T细胞再分布(即绝对T细胞计数下降并随后恢复的初始事件)的诱导。

图29

所指种间特异性双特异性构建体分别与用人CD33转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴CD33转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。按照实施例16.4的描述进行FACS染色。粗线代表用5μg/ml纯化的双特异性单链构建体或表达所述种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用未转染的CHO细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示构建体对人和猕猴CD33以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图30

该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性CD33特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例16.5的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应细胞分别针对转染有人和猕猴CD33的CHO细胞有效地募集细胞毒活性。

图31

监测被命名为E292F3 HL×I2C HL的种间特异性双特异性单链分子的纯化的SDS PAGE凝胶和蛋白质印迹。如所示，分析了来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流过液(FT)的样品。采用蛋白标准物(M)作为大小参照。SDS PAGE凝胶中分子量为50kDa-60kDa的强蛋白条带证明，利用实施例17.2所述的一步纯化方法将种间特异性双特异性单链分子高效地纯化至程度非常高的纯度。检测组氨酸₆标签的蛋白质印迹证实了洗脱物中的蛋白条带为种间特异性双特异性单链分子的身份。在该敏感检测方法中，流过液样品的微弱信号进一步证明该纯化方法几乎完全捕获双特异性单链分子。

图32

监测被命名为V207C12 HL x H2C HL的种间特异性双特异性单链分子的纯化的SDS PAGE凝胶和蛋白质印迹。如所示，分析了来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流过液(FT)的样品。采用蛋白标准物(M)作为大小参照。SDS PAGE凝胶中分子量为50kDa-60kDa的强蛋白条带证明，利用实施例17.2所述的一步纯化方法将种间特异性双特异性单链分子高效地纯化至程度非常高的纯度。检测组氨酸₆标签的蛋白质印迹证实了洗脱物中的蛋白条带为种间特异性双特异性单链分子的身份。在该敏感检测方法中，流过液样品的微弱信号进一步证明该纯化方法几乎完全捕获双特异性单链分子。

图33

监测被命名为AF5HLxF12QHL的种间特异性双特异性单链分子的纯化的SDS PAGE凝胶和蛋白质印迹。如所示，分析了来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流过液(FT)的样品。采用蛋白标准物(M)作为大小参照。SDS PAGE凝胶中分子量为50kDa-60kDa的强蛋白条带证明，利用实施例17.2所述的一步纯化方法将种间特异性双特异性单链分子高效地纯化至程度非常高的纯度。检测组氨酸₆标签的蛋白质印迹证实了洗脱物中的蛋白条带为种间特异性双特异性单链分子的身份。在该敏感检测方法中，流过液样品中的信号由因上清液中的高浓度双特异性单链分子使亲和柱饱和所解释。

图34

50％猕猴血清中AF5HL×I2CHL的标准曲线。上图显示了实施例18.2所述的试验产生的标准曲线。

下图显示50％猕猴血清中AF5HL×I2CHL的质量控制样品的结果。对于高和中QC样品，回收率高于90％，而对于低QC样品，回收率高于80％。

因此，该试验可以检测血清样品中10ng/ml-200ng/ml(稀释前)的范围的AF5HL×I2CHL。

图35

50％猕猴血清中MCSP-G4 HL x I2C HL的标准曲线。上图显示了实施例18.2所述的试验产生的标准曲线。

下图显示50％猕猴血清中MCSP-G4 HL x I2C HL的质量控制样品的结果。对于高和中QC样品，回收率高于98％，而对于低QC样品，回收率高于85％。

因此，该试验可以检测血清样品中10ng/ml-200ng/ml(稀释前)的范围的MCSP-G4 HL x I2C HL。

图36

抗Flag抗体与因融合于食蟹猴EpCAM的所示物种CD3ε的N-末端1-27个氨基酸转染的CHO细胞的FACS结合分析。按照实施例19.1的描述进行FACS染色。粗线代表用抗Flag抗体温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用含有2％FCS的PBS作为阴性对照。直方图显示抗Flag抗体对所有转染子都具有强且相当的结合，这表明所转染的构建体的表达强且相等。

图37

I2C IgG1构建体与表达融合于食蟹猴EpCAM的所示物种CD3ε的N-末端1-27个氨基酸的CHO细胞的FACS结合分析。按照实施例19.3的描述进行FACS染色。粗线代表用50μl表达I2C IgG1构建体的细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用表达融合于食蟹猴EpCAM的猪CD3ε的N-末端1-27个氨基酸的细胞作为阴性对照。与阴性对照比较，直方图清楚地证明I2C IgG1构建体与人、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε的N-末端1-27个氨基酸的结合。

图38

实施例19.2所述的I2C IgG1构建体与分别描述于实施例6.1和5.1中的具有和不具有N-末端His6标签的人CD3的FACS结合分析。粗线代表分别用所示抗人CD3抗体UCHT-1、5-His抗体(Qiagen)和表达I2C IgG1构建体的细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示用作为阴性对照的无关鼠IgG1抗体温育的细胞。

上方两个直方重叠图显示与同种型对照相比，UCHT-1抗体对两种转染子的结合相当，这证实了两种重组构建体的表达。中间的直方重叠图显示5-his抗体与表达His6-人CD3ε链的细胞(His6-CD3)结合但不与表达野生型CD3ε链的细胞(WT-CD3)结合。下方的直方重叠图显示I2C IgG1构建体与野生型人CD3ε链结合但不与His6-人CD3ε链结合。这些结果证明，自由的N-末端对于种间特异性抗CD3结合分子I2C与CD3ε链的结合是必需的。

图39

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人MCSP D3转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119 LnPx的FACS结合分析。按照实施例10的描述进行FACS染色。粗线代表分别用2μg/ml纯化的双特异性单链构建体或包含双特异性单链构建体的细胞上清液温育的细胞。实心直方图代表阴性对照。使用未转染的CHO细胞的上清液作为T细胞系结合的阴性对照。使用具有无关靶特异性的单链构建体作为与转染有MCSP D3的CHO细胞结合的阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人和猕猴MCSP D3以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图40

由所指再针对所示靶细胞系的种间特异性MCSP D3特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。使用的效应细胞以及效应细胞与靶细胞的比也如所示。按照实施例11的描述进行试验。该图清楚地证明了各构建体对细胞毒活性的有效的种间特异性募集。

图41

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人CD33转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴CD33转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。按照实施例21.2的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用未转染的CHO细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴CD33以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图42

该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性CD33特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例21.3的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应细胞分别针对转染有人和猕猴CD33的CHO细胞有效地募集细胞毒活性。

图43

在每周静脉内推注PBS/5％HSA和PBS/5％HAS加剂量为1.6、2.0、3.0和4.5μg/kg的单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体的黑猩猩体内的T细胞再分布。每次推注施用的输注时间是2小时。垂直箭头表示开始推注。每次推注施用开始时的数据点表示开始推注之前即刻的T细胞计数。每次推注识别常规的背景依赖性CD3表位的单链EpCAM/CD3-双特异性抗体构建体触发了T细胞再分布事件，随后在下次推注之前T细胞恢复至基线值。

图44

包含来自所选克隆的加Flag标签的scFv蛋白片段的周质制品的CD3特异性ELISA分析。将可溶性scFv蛋白片段的周质制品加至ELISA板的孔内，其中这些板已经用可溶性人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白包被并已另外用PBS 3％BSA封闭。利用抗Flag-生物素标记的单克隆抗体随后是结合有过氧化物酶的链霉亲和素进行检测。ELISA由ABTS底物溶液显影。由ELISA读数器测定在405nm的OD值(y轴)。克隆名称示于x轴。

图45

包含来自所选克隆的加Flag标签的scFv蛋白片段的周质制品的ELISA分析。将与图44相同的可溶性scFv蛋白片段的周质制品加至ELISA板的孔中，其中这些板没有用人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白包被而是用huIgG1(Sigma)包被，并且用含3％BSA的PBS封闭。

利用抗Flag-生物素标记的单克隆抗体随后是结合有过氧化物酶的链霉亲和素进行检测。ELISA由ABTS底物溶液显影。由ELISA读数器测定405nm的OD值(y轴)。克隆名称示于x轴。

图46

图46A-G：所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人PSCA转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴PSCA转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例24.5的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用未转染细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴PSCA以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图47

图47A-C：该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性双特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例24.6的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应细胞分别针对人和猕猴PSCA阳性的细胞有效地募集细胞毒活性。

图48

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人PSCA转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴PSCA转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例45.5的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用未转染细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴PSCA以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图49

该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性双特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例24.6的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应T细胞分别针对人和猕猴PSCA阳性的靶细胞有效地募集细胞毒活性。

图50

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人CD19转染的CHO细胞、人CD3阳性T细胞系HPB-ALL和猕猴CD3阳性T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例25.4的描述进行FACS染色。粗线代表用细胞培养物上清液并随后用鼠抗His标签抗体温育然后用PE-标记的抗鼠Ig检测抗体温育的细胞。细线直方图表示阴性对照，即仅用抗His标签抗体和抗鼠Ig检测抗体温育的细胞。

图51

由针对所示靶细胞系的所指种间特异性双特异性单链构建体再针对的细胞毒性T细胞活性。A)使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC作为效应T细胞，使用利用人CD19转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞源，使用利用人CD19转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例25.5的描述进行所述试验。

图52

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与C-MET阳性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人CD3+ T细胞系HPB-ALL和猕猴CD3+ T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例26.5的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用未转染细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对C-MET以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图53

该图显示测定由再针对所指靶细胞系的所示种间特异性双特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例26.6的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人效应细胞针对C-MET阳性细胞有效地募集细胞毒活性。

图54

所示种间特异性双特异性单链构建体分别与实施例27.1中所述的表达人C-MET的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、实施例27.1所述的表达猕猴C-MET的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例27.2的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用未转染CHO细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴C-MET以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图55

该图显示测定由再针对按照实施例27.1的描述产生的所示靶细胞系的所指种间特异性cMET特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例27.4的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，猕猴效应T细胞针对猕猴cMET阳性靶细胞有效地募集细胞毒活性。

图56

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与实施例27.1中所述的表达人cMET的CHO细胞和实施例27.1中所述的表达猕猴cMET的CHO细胞的FACS结合分析。按照实施例27.3的描述进行FACS染色。粗线代表用包含种间特异性scFv抗体的周质制品温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用用于周质制品的缓冲液作为阴性对照。对于每种种间特异性scFv抗体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴C-MET的特异性结合。

图57

种间特异性scFv抗体片段与用人内皮唾液酸蛋白转染的CHO细胞和用猕猴皮唾液酸蛋白转染的CHO细胞的FACS结合分析。按照实施例28.3的描述进行FACS染色。粗线代表用包含所述scFv抗体片段的周质制品温育的细胞。细线表示阴性对照。使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。直方重叠图显示了scFv抗体片段对人和猕猴内皮唾液酸蛋白的特异性结合。

图58

所示种间特异性双特异性单链构建体分别与用人CD248转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴CD248转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例29.1的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。细线表示阴性对照。使用未转染CHO细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴CD248以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图59

该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性CD248特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例29.1的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应T细胞分别针对人和猕猴CD248阳性靶细胞有效地募集细胞毒活性。

图60

所示种间特异性双特异性单链构建体分别与用人EpCAM转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例30.4的描述进行FACS染色。粗线代表用细胞培养物上清液并随后用抗His抗体温育，然后用PE-标记的检测抗体温育的细胞。细线直方图表示阴性对照，即仅用抗His抗体和检测抗体温育的细胞。

图61

由再针对所示的靶细胞系的所指种间特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例30.5中的描述进行所述试验。

图62

由再针对所示的靶细胞系的所指种间特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例30.5中的描述进行所述试验。

图63

由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)和B)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例30.5中的描述进行所述试验。

图64和65

由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)和B)使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例30.5中的描述进行所述试验。

图66

由再针对所指的靶细胞系的所示种间特异性单链构建体诱导的细胞毒活性。A)使用受刺激的CD4-/CD56-人PBMC作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。B)使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，用人EpCAM转染的CHO细胞作为靶细胞。按照实施例30.5中的描述进行所述试验。

图67

所指种间特异性双特异性单链构建体与用人、小鼠或人-小鼠杂交EpCAM转染的CHO细胞的FACS结合分析。按照实施例30.7的描述进行FACS染色。柱形表示所指构建体与所示EpCAM抗原结合的中值荧光强度。

图68

在FACS分析中，与阴性对照相比，所示构建体显示与CD3和FAPα的结合。证明了双特异性抗体分别与人和猕猴CD3和FAPα抗原的种间特异性。按照实施例31的描述进行所述试验。

图69

所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体证明了由受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC引发的针对人FAPα阳性靶细胞的和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴FAPα阳性靶细胞的细胞毒活性。按照实施例31的描述进行所述试验。

图70

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人FAPα转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴FAPα转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例32.1的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。细线表示阴性对照。使用未转染CHO细胞的上清液作为阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴FAPα以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图71

该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性FAPα特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例32.1的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应T细胞分别针对人和猕猴FAPα阳性靶细胞有效地募集细胞毒活性。

图72

所指种间特异性scFv抗体分别与用人FAPα转染的CHO细胞和用猕猴FAPα转染的CHO细胞的FACS结合分析。按照实施例32.2的描述进行FACS染色。粗线代表用包含种间特异性scFv抗体的周质制品温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。使用用于周质制品的缓冲液作为阴性对照。对于每种种间特异性scFv抗体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴FAPα的特异性结合。

图73

所指种间特异性双特异性单链构建体分别与用人IGF-1R转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPB-ALL、用猕猴IGF-1R转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。按照实施例33.3的描述进行FACS染色。粗线代表用表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液温育的细胞。实心直方图表示阴性对照。对于每种种间特异性双特异性单链构建体，直方重叠图显示了构建体对人和猕猴IGF-1R以及人和猕猴CD3的特异性结合。

图74

该图显示测定由再针对所示靶细胞系的所指种间特异性双特异性单链构建体诱导的细胞毒活性的铬释放试验的结果。所使用的效应细胞也如所示。根据实施例33.3的描述进行所述试验。该图清楚地证明，对于每种构建体，人和猕猴效应T细胞分别针对人和猕猴IGF-1R阳性靶细胞有效地募集细胞毒活性。

通过以下例示性非限制实施例进一步描述本发明，所述实施例提供对本发明和其许多优点的更好理解。

实施例

1.来自非人灵长类血液样品的CD3ε序列的鉴定

使用下列非人灵长类的血液样品用于CD3ε鉴定：普通狨猴(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)和松鼠猴(Saimiris ciureus)。制备新鲜的经肝素处理的全血样品，以按照制造商的方法分离细胞总RNA(QIAamp RNA Blood Mini Kit，Qiagen)。根据已发表的方法，将所提取的mRNA转录成cDNA。简言之，将10μl沉淀RNA和1.2μl 10×六核苷酸混合物(Roche)在70℃温育10分钟并储存在冰上。加入由4μl 5×SuperScript II缓冲液、0.2μl 0.1M二硫苏糖醇、0.8μl SuperScript II(Invitrogen)、1.2μl脱氧核糖核苷三磷酸(25μM)、0.8μl RNA酶抑制剂(Roche)和1.8μl无DNA酶和RNA酶的水(Roth)组成的反应混合物。将所述反应混合物在室温下温育10分钟，接着在42℃下温育50分钟并在90℃下温育5分钟。将反应物在冰上冷却，然后加入0.8μl RNA酶H(1U/μl，Roche)并在37℃下温育20分钟。

使用Taq DNA聚合酶(Sigma)和根据数据库研究而设计的如下引物组合使来自各物种的第一链cDNA进行独立的35个循环的聚合酶链式反应：正向引物5’-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3’(SEQ ID NO：253)；反向引物5’-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3’(SEQ ID NO：254)。凝胶纯化(凝胶提取试剂盒，Qiagen)所扩增的550bp条带并测序(Sequiserve，Vaterstetten/德国，见序列表)。

CD3ε普通狨猴

核苷酸

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG

AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATA

GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAA

AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA

CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

氨基酸(SEQ ID NO：3)

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ

SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD

CD3ε绒顶柽柳猴

核苷酸

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG

AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATA

GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAA

AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA

CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

氨基酸(SEQ ID NO：5)

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ

SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD

CD3ε松鼠猴

核苷酸

CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG

AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATG

ATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAA

AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA

CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

氨基酸(SEQ ID NO：7)

QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ

SGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD

2.与人和不同非黑猩猩灵长类CD3ε的N-末端氨基酸1-27结合的种间特异性单链抗体片段(scFv)的产生

2.1.使用融合于异源可溶性蛋白从其天然CD3背景分离的CD3εN-末端对小鼠进行的免疫

利用荷载有人和/或松鼠猴成熟CD3ε链最N-末端的氨基酸1-27的CD3ε-Fc融合蛋白(1-27CD3-Fc)免疫来自balb/c×C57黑鼠杂交的十周龄F1小鼠。为此目的，向每只小鼠的腹膜内注射含有40μg 1-27 CD3-Fc融合蛋白和10nmol硫代酸酯(thioate)修饰的CpG-寡核苷酸(5’-tccatgacgttcctgatgct-3’)(SEQ ID No.343)的300μl PBS。小鼠在21天、42天和任选63天后以相同方式接受加强免疫。第一次加强免疫后十天，取血液样品并通过ELISA测定针对1-27 CD3-Fc融合蛋白的抗体血清滴度。另外，按照标准方法使用流式细胞术测定针对CD3阳性人T细胞系HPBall的滴度。免疫动物的血清滴度显著高于未免疫的动物。

2.2.免疫鼠抗体scFv文库的产生：组合抗体文库和噬菌体展示的构建

最后一次注射后三天，收集鼠脾细胞用于根据标准方法制备总RNA。

使用VK和VH特异性引物通过基于鼠脾RNA的RT-PCR构建鼠免疫球蛋白(Ig)轻链(κ)可变区(VK)和Ig重链可变区(VH)的DNA片段文库。根据标准方法合成cDNA。

按照能够产生用于所扩增的重链V片段的5′-XhoI和3′-BstEII识别位点和用于所扩增的VK DNA片段的5′-SacI和3′-SpeI识别位点的方式设计引物。

为了PCR扩增VH DNA-片段，八个不同的5′-VH家族特异性引物(MVH1(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT(SEQ ID No.344)；MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT(SEQ ID No.345)；MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT(SEQ ID No.346)；MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA(SEQ ID No.347)；MVH5 GA(AG)GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA(SEQ ID No.348)；MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT(SEQ ID No.349)；MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA(SEQ ID No.350)；MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT(SEQ ID No.351))各与一个3′-VH引物(3’MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g(SEQ ID No.352))组合；为了对VK-链片段进行PCR扩增，七个不同的5′-VK-家族特异性引物(MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT(SEQ ID No.353)；MUVK2CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC(SEQ ID No.354)；MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA(SEQ ID No.355)；MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA(SEQ ID No.356)；MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA(SEQ ID No.357)；MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA(SEQ ID No.358)；MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA(SEQ ID No.359))各与一个3′-VK引物(3′MuVkHindIII/BsiW1tgg tgc act agt cgt acg ttt gat ctc aag ctt ggt ccc(SEQ ID No.360))组合。

使用下述PCR程序进行扩增：在94℃变性20秒、在52℃引物退火50秒和在72℃引物延伸60秒，并进行40个循环，之后在72℃最后延伸10分钟。

将450ng κ轻链片段(用SacI-SpeI消化)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(用SacI-SpeI消化；大片段)连接。随后将所得的组合抗体文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm，Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞，得到大于10⁷独立克隆的文库大小。一小时的表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化体。随后离心收集细胞并使用商购的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。

2800ng包含VK文库的该质粒-DNA(用XhoI-BstEII消化；大片段)与900ng重链V片段(用XhoI-BstEII消化)连接并再次通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)转化到两份各300ul的电感受态大肠杆菌XL1 Blue细胞试样中，获得大于10⁷独立克隆的VH-VK scFv(单链可变片段)的总文库大小。

表型表达和缓慢适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50ug/mL)选择培养基中。随后以感染剂量的10¹²个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含所述抗体文库的大肠杆菌细胞，引起丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中噬菌体粒子包含编码鼠scFv-片段的单链pComb3H5BHis-DNA并以翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的方式展示相应的scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体库随后用于抗原结合分子的选择。

2.3.基于噬菌体展示的CD3特异性结合子的选择

通过PEG8000/NaCl沉淀和离心，从各培养物上清液收集荷载所克隆的scFv库的噬菌体文库。将大约10¹¹-10¹²个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml PBS/0.1％BSA并与10⁵-10⁷个Jurkat细胞(CD3阳性人T细胞系)在冰上缓慢搅动下温育1小时。这些Jurkat细胞预先生长在富含胎牛血清(10％)、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基中，通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)中。通过使用PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)共达五次的洗涤步骤来除去不与Jurkat细胞特异结合的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在PH 2.2的HCl-甘氨酸中(温育10分钟，随后涡旋)而从细胞洗脱结合分子，并且在用pH 12的2M Tris中和后，利用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1 Blue培养物(OD600＞0.5)。含有成功转导有编码人scFv片段的噬菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再一次进行羧苄青霉素抗性选择，并接着用VCMS 13辅助噬菌体感染而开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4-5轮选择。

2.4.CD3特异性结合子的筛选

在选择后，从大肠杆菌培养物中分离4-5轮淘洗后的质粒DNA。为了产生可溶性scFv蛋白，从所述质粒切除VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI)。通过相同的限制性位点将这些片段克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(例如scFv)在scFv和His6标签之间包含Flag-标签(TGD YKDDDDK)且其它的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，将各质粒DNA库(不同淘洗轮次)转化到100μl热休克感受态(heat shock competent)大肠杆菌TG1或XL1 blue中并铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(50μg/ml)中。

在切除基因III片段并使用1mM IPTG诱导后，转化有含有VL和VH区段的pComb3H5BHis的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于合适的信号序列，所述scFv-链被输出到周质中并在此折叠成功能构象。

从转化板挑取单个大肠杆菌TG1细菌菌落用于周质小量制备，并在补充了20mM的MgCl₂和50μg/ml羧苄青霉素的SB培养基(例如10ml)中培养，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解冻，细菌的外层膜被温度休克(shock)而毁坏，包含scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。通过离心去除完整细胞和细胞碎屑后，收集含有人抗人CD3-scFv的上清液并用于进一步的试验。

2.5.CD3特异性结合子的鉴定

通过流式细胞术测定分离的scFv在真核细胞上的结合，其中所述真核细胞在其表面上表达异源性的蛋白，所述蛋白在其N-末端呈现CD3ε的N-末端前27个氨基酸。

如实施例4所述，人T细胞受体复合体的成熟CD3ε链的N-末端序列的前1-27个氨基酸(氨基酸序列：QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT SEQ ID NO：2)与跨膜蛋白EpCAM的N-末端融合，从而使所述N-末端位于细胞外表面。另外，FLAG表位被插入到CD3ε N-末端1-27序列和EpCAM序列之间。在人胚肾(HEK)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达该融合产物。

使用相同的方式制备呈现其他灵长类物种的成熟CD3ε的最N-末端27个氨基酸的真核细胞：松鼠猴(Saimiri ciureus，Squirrel monkey)(CD3ε的N-末端氨基酸序列：QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO：8)、普通狨猴(CD3ε的N-末端氨基酸序列：QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO：4)和绒顶柽柳猴(CD3ε的N-末端氨基酸序列：QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO：6)。

对于流式细胞术，将2.5×10⁵个细胞与50ul上清液或与含有5μg/ml所纯化的构建体和2％FCS的50μl PBS一起温育。利用含2μg/ml抗His抗体(5His抗体且无BSA，Qiagen GmbH，Hilden，FRG)和2％FCS的50μl PBS检测构建体的结合。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异的)(Dianova，Hamburg，FRG)作为第二步试剂。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。

始终通过前面关于人和不同灵长类(如松鼠猴、普通狨猴、绒顶柽柳猴)原代T细胞的段落所述的流式细胞术证实结合。

2.6.非人CD3ε特异性scFv的人/人源化等价物的产生

对鼠抗CD3 scFv的VH区与人抗体种系氨基酸序列进行比对。选择与非人VH具有最近同源性的人抗体种系VH序列并进行两个氨基酸序列的直接比对。不同于人VH骨架区的非人VH的骨架残基(“不同骨架位置”)有许多。这些残基中的一些可有助于抗体与其靶的结合与活性。

为了构建含有鼠CDR并在不同于所选人VH序列的每个骨架位置具有二种可能性(人和母鼠氨基酸残基)的文库，合成简并的寡核苷酸。这些寡核苷酸在不同的位置以75％的几率引入人残基并以25％的几率引入鼠残基。例如，对于一个人VH，必须合成六个在末段约有20个核苷酸的重叠的这种寡核苷酸。为此目的，每种第二引物都是反义引物。删除所述寡核苷酸内稍后的克隆所需的限制性位点。

这些引物的长度可以为60-90个核苷酸，这取决于跨越整个V序列所需要的引物数量。

将这些引物(例如六种引物)等量混合(例如每种引物1μl(20-100μM的引物储液)加到20μl的PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟，在65℃温育1分钟，在62℃温育1分钟，59℃1分钟，56℃1分钟，52℃1分钟，50℃1分钟和72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用该PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法使用琼脂糖凝胶电泳分离具有正确大小的DNA片段(VH大约为350个核苷酸)。用这种方法扩增足量的VH DNA片段。该VH片段是其中的每一个片段均在相应的不同骨架位置具有不同量的人和鼠残基的VH片段库(人源化的VH库)。对于鼠抗CD3 scFv的VL区进行相同操作(人源化的VL库)。

然后将所述人源化VH库与所述人源化VL库合并在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中以形成功能性的scFv文库，在呈现于丝状噬菌体后按照以上关于亲本的非人(鼠)抗CD3 scFv的描述从所述scFv文库中选择、筛选、鉴定和验证抗CD3结合子。然后分析单个克隆的有利性质和氨基酸序列。那些与人种系V区段的氨基酸序列同源性最近的scFv是优选的，尤其是在VH的CDR I和CDR II以及VLκ的CDR I和CDR II或者VLλ的CDR I和CDR II中的至少一个CDR显示与所有人种系V区段的关系最近的相应CDR具有高于80％氨基酸序列同一性的scFv。按照以下实施例9、16和24的描述，将抗CD3 scFv转换成重组的双特异性单链抗体。

3.人CD3ε链的N-末端氨基酸1-27融合于IgG1的Fc-部分的重组融合蛋白(1-27 CD3-Fc)的产生。

3.1.1-27 CD3-Fc的克隆和表达

根据标准方法由基因合成获得与人免疫球蛋白IgG1的铰链和Fc γ区以及6个组氨酸标签融合的人CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列表示为SEQ ID NO.230和229)。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人CD3ε链胞外部分的前27个氨基酸的编码序列，框中随后是人IgG1的铰链区和Fcγ部分的编码序列，框中随后是6-组氨酸标签的编码序列和终止密码子(图1)。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA的开始和末尾引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025；以及Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据制造商的说明利用序列经验证的质粒在FreeStyle 293表达系统(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)中转染。3天后，收集转染子的细胞培养物上清液并在ELISA试验中检测重组构建体的存在。将山羊抗人IgG(Fc-γ片段特异性的抗体)(从Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK获得)在PBS中稀释到5μg/ml并以每孔100μl包被到MaxiSorp 96孔ELISA板(Nunc GmbH & Co.KG，Wiesbaden，德国)上，4℃过夜。用含有0.05％吐温20的PBS(PBS/吐温)洗涤孔并在含3％BSA(牛白蛋白，级分V，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)的PBS中室温(RT)封闭60分钟。随后，再次用PBS/吐温洗涤孔并随后在RT下用细胞培养物上清液温育60分钟。洗涤后，使用以1∶500稀释在含1％BSA的PBS中的结合有过氧化物酶的抗His6抗体(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德国)在RT下温育孔60分钟。随后，用200μl PBS/吐温洗涤孔并根据制造商的说明加入100μl SIGMAFAST OPD(SIGMAFAST OPD[邻苯二胺二盐酸盐]底物溶液(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)。通过加入100μl 1M H₂SO₄终止反应。在PowerWaveX微板分光光度计(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，Vermont，USA)上在490nm测定显色反应并减去在620nm的背景吸收。如图2所示，与用作阴性对照的模拟转染的HEK 293细胞的无关上清液相比，可清楚地检测构建体的存在。

3.2.种间特异性单链抗体与1-27 CD3-Fc的结合测定

在ELISA试验中检测周质表达的CD3ε特异性的种间特异性单链抗体粗制品与1-27 CD3-Fc的结合。将山羊抗人IgG(Fc-γ片段特异性的抗体)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)在PBS中稀释到5μg/ml并以每孔100μl包被到MaxiSorp 96孔ELISA板(Nunc GmbH & Co.KG，Wiesbaden，德国)上，4℃过夜。使用含有0.05％吐温20的PBS(PBS/吐温)洗涤孔并用含3％BSA(牛白蛋白，级分V，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)的PBS在RT下封闭60分钟。随后用PBS/吐温洗涤孔，并用表达1-27 CD3-Fc构建体的细胞上清液在RT温育60分钟。用PBS/吐温洗涤孔并与上述周质表达的种间特异性单链抗体粗制品在室温温育60分钟。用PBS/吐温洗涤后，孔与以1∶10000稀释在含有1％BSA的PBS中的结合有过氧化物酶的抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)在RT下温育60分钟。用PBS/吐温洗涤孔并根据制造商的说明用100μl SIGMAFAST OPD(OPD[邻苯二胺二盐酸盐]底物溶液(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)孵育。利用100μl 1M H₂SO₄终止显色反应并在PowerWaveX微板分光光度计(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，Vermont，USA)上测定在490nm的吸收，减去在620nm的背景吸收。与鼠抗CD3单链抗体相比，观察到CD3 ε特异性的种间特异性人单链抗体对1-27 CD3-Fc构建体的强结合(图3)。

4.来自不同的非黑猩猩灵长类CD3ε的N-末端氨基酸1-27与来自食蟹猴EpCAM融合的重组跨膜融合蛋白(1-27 CD3-EpCAM)的产生

4.1.1-27 CD3-EpCAM的克隆和表达

从不同的非黑猩猩灵长类(狨猴(marmoset)、绢毛猴(tamarin)、松鼠猴)和猪分离CD3ε。根据标准方法由基因合成获得与加Flag标签的食蟹猴EpCAM的N-末端融合的成熟人、普通狨猴、绒顶柽柳猴、普通松鼠猴和家猪(Sus scrofa；用作阴性对照)CD3ε链N-末端1-27个氨基酸的编码序列。重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列于SEQ ID NO.231-240。基因合成片段设计为包含开始的BsrGI位点以允许正确读框地与靶表达载体中已经存在的19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列融合，框中随后是成熟CD3ε链胞外部分N-末端1-27个氨基酸的编码序列，框中随后是Flag标签的编码序列，框中随后是成熟的食蟹猴EpCAM跨膜蛋白的编码序列(图4)。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA末端引入限制性位点。利用在5′末端引入的限制性位点BsrGI和在3′末端引入的限制性位点SalI进行如下克隆过程。随后按照标准方法，通过BsrGI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF DHFR质粒(pEF-DHFR描述于Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)的衍生物中，该衍生物已经包含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列。根据制造商的操作说明利用序列经过证明的质粒瞬时转染293-HEK细胞，其中，针对175ml细胞培养瓶中附着的293-HEK细胞使用MATra-A试剂(IBA GmbH，德国)和12μg质粒DNA。细胞培养3天后，根据标准方法通过FACS试验检测转染子的重组跨膜蛋白的细胞表面表达。为此目的，利用含有5μg/ml抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)和2％FCS的PBS温育2.5×10⁵量的细胞。用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化F(ab′)2片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测结合的抗体。在FACScalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定样品。可清楚地检测由食蟹猴EpCAM分别与人、狨猴、绢毛猴、松鼠猴以及猪CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸组成的加Flag标签的重组跨膜融合蛋白在转染细胞上的表达(图5)。

4.2.种间特异性抗CD3单链抗体与1-27 CD3-EpCAM的结合

根据标准方法，在FACS试验中检测周质表达的种间特异性抗CD3单链抗体粗制品分别与融合有食蟹猴Ep-CAM的人、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链N-末端1-27个氨基酸融合的结合。为此目的，将2.5×10⁵量的细胞与周质表达的种间特异性抗CD3单链抗体粗制品(如上述并根据标准方法进行制备)温育并用单链鼠抗人CD3抗体作为阴性对照。使用以5μg/ml包含在含有2％FCS的50μl PBS中的5His抗体(Qiagen GmbH，Hildesheim，德国)作为二抗。检测抗体与以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化F(ab′)2片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)的结合。在FACScalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定样品。如图6(A-E)所示，观察到单链抗体与表达由与食蟹猴Ep-CAM融合的人、狨猴、绢毛猴或松鼠猴CD3εN-末端1-27个氨基酸组成的重组跨膜融合蛋白的转染子的结合。没有观察到种间特异性单链抗体与由用作阴性对照的与食蟹猴EpCAM融合的猪CD3εN-末端1-27个氨基酸组成的融合蛋白的结合。这证明了抗CD3单链抗体的多灵长类种间特异性。用抗Flag M2抗体和种间特异性单链抗体获得的信号是相当的，这表明种间特异性单链抗体对CD3ε的N-末端氨基酸1-27的强结合活性。

5.通过用人CD3ε链及其丙氨酸突变体转染的小鼠细胞的丙氨酸扫描的种间特异性抗CD3单链抗体的结合分析

5.1.人野生型CD3ε的克隆和表达

根据标准方法由基因合成获得人CD3ε链的编码序列(人CD3ε链的cDNA序列和氨基酸序列表示为SEQ ID NO.242和241)。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和位于编码人CD3ε的cDNA的始端和末端的限制性位点。利用在5′末端引入的限制性位点EcoRI和在3′末端引入的限制性位点SalI进行如下克隆过程。随后按照标准方法通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆至命名为pEF NEO的质粒中。通过常规分子克隆将DHFR的cDNA用新霉素抗性的cDNA替代而从pEF DHFR衍生出pEFNEO(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)。利用序列经证实的质粒转染在37℃、95％湿度和7％CO₂下培养在RPMI中的鼠T细胞系EL4(ATCC编号：TIB-39)，其中所述RPMI含有稳定的L-谷氨酰胺并补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素、1％HEPES、1％丙酮酸盐、1％非必需氨基酸(均来自Biochrom AG Berlin，德国)。根据制造商的说明利用SuperFect转染试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国)和2μg质粒DNA进行转染。24小时后，利用PBS洗涤细胞并再次培养在含有用于选择的600μg/ml G418的上述细胞培养基中(PAA Laboratories GmbH，Pasching，Austria)。转染后16-20天观察到抗性细胞的生长。再过7-14天后，根据标准方法利用FACS分析检测细胞对人CD3ε的表达。将2.5×10⁵个细胞与含有5μg/ml的抗人CD3抗体UCHT-1(BD biosciences，Heidelberg，德国)和2％FCS的PBS温育。利用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化F(ab′)2片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测抗体的结合。在FACSCalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定样品。人野生型CD3在所转染的EL4细胞上的表达显示在图7。

5.2.作为IgG1抗体的种间特异性抗CD3单链抗体的克隆和表达

为了提供检测种间特异性单链抗CD3抗体结合的改进手段，将H2C HLP、A2J HLP和E2M HLP转变为具有鼠IgG1和人λ恒定区的IgG1抗体。根据标准方法通过基因合成获得编码相应IgG抗体重链和轻链的cDNA序列。将各种特异性的基因合成片段设计为包含允许构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽(SEQ ID NO.244和243)，框中随后是相应重链可变区或相应轻链可变区的编码序列，框中随后分别是鼠IgG1重链恒定区的编码序列(SEQ ID NO.246和245)或人λ轻链恒定区的编码序列(SEQ ID NO.248和247)。在编码融合蛋白的cDNA始端和末端引入限制性位点。利用在5′末端的限制性位点EcoRI和在3′末端的限制性位点SalI进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将重链构建的基因合成片段克隆到命名为pEF DHFR的质粒中(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)，将轻链构建体的基因合成片段克隆到pEF ADA中(pEF ADA描述于Raum等，Cancer Immunol Immunother.，50(3)，(2001)，141-50))。根据制造商的说明利用序列经证明的质粒在FreeStyle 293表达系统(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)中共转染相应的轻链和重链构建体。3天后，收集转染子的细胞培养上清液并用于丙氨酸扫描实验。

5.3.用于丙氨酸扫描的人CD3ε丙氨酸突变体的克隆和表达

通过基因合成分别获得编码人CD3ε链的27个cDNA片段，其中在所述cDNA片段中所述人CD3ε野生型序列的一个密码子(成熟人CD3ε链细胞外结构域的氨基酸1-27中的每个氨基酸)被替换为编码丙氨酸的密码子(GCC)。除了所替换的密码子外，cDNA片段与上述人野生型CD3cDNA片段相同。与上述人野生型CD3cDNA片段相比，各构建体中只有一个密码子被取代。将限制性位点EcoRI和SalI引入到cDNA片段中的与野生型构建体相比相同的位置。将所有丙氨酸扫描构建体克隆到pEF NEO并将序列经过证明的质粒转染到EL4细胞中。根据上述进行转染子的转染和选择。结果获得了一组有表达的构建体，其中人CD3ε链的第一个氨基酸，即位置1的谷氨酰胺(Q，Gln)被丙氨酸代替。最后一个被丙氨酸代替的氨基酸是成熟人野生型CD3ε位置27的苏氨酸(T，Thr)。针对谷氨酰胺1和苏氨酸27之间的各个氨基酸产生了具有将野生型氨基酸替换为丙氨酸的相应转染子。

5.4.丙氨酸扫描实验

在丙氨酸扫描实验中检测5.2)中描述的嵌合IgG抗体和特异于CD3ε的种间特异性单链抗体。根据标准方法，通过FACS试验检测抗体与用如5.3)描述的人CD3ε丙氨酸突变体构建体转染的EL4细胞系的结合。将2.5×10⁵个细胞的相应转染子与50μl包含嵌合IgG抗体的细胞培养物上清液或与50μl周质表达的单链抗体粗制品温育。对于用周质表达的单链抗体粗制品温育的样品，将含有2％FCS的50μl PBS中的5μg/ml抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)用作二抗。对于用嵌合IgG抗体温育的样品，二抗不是必需的。对于所有样品，用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab’)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测抗体分子的结合。在FACSCalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定样品。检测到嵌合IgG分子或种间特异性单链抗体与用人CD3ε丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的差异结合。分别使用同种型对照或无关特异性的周质表达的单链抗体粗制品作为阴性对照。使用UCHT-1抗体作为人CD3ε丙氨酸突变体表达水平的阳性对照。因为表达水平非常低(数据未显示)，没有评价用成熟CD3ε链在位置15的酪氨酸、在位置17的缬氨酸、在位置19的异亮氨酸、在位置24的缬氨酸或在位置26的亮氨酸的氨基酸的丙氨酸突变体转染的EL4细胞系。种间特异性单链抗体和嵌合IgG形式的单链抗体与转染有人CD3ε丙氨酸突变体的EL4细胞系的结合在图8(A-D)中显示为以任意单位表示的从所有样品相应的几何平均荧光值减去相应的阴性对照的几何平均荧光值而得到的相对结合。为了补偿不同的表达水平，特定转染子的所有样品值然后除以相应转染子的UCHT-1抗体的几何平均荧光值。为了与特异性的野生型样品值比较，相应特异性的所有样品值最后除以野生型样品值，从而将野生型样品值设置为1的任意单位的结合。

使用的计算详细示于下式：

在这个方程式中，“样品值”指的是描述特定抗CD3抗体与如图8(A-D)所示的特定丙氨酸突变体的结合程度的任意单位的结合值，“样品”指的是在特定丙氨酸扫描转染子上测定的特异性抗CD3抗体获得的几何平均荧光值，“阴性对照”指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照获得的几何平均荧光值，UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体获得的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定的特异性的抗CD3抗体获得的几何平均荧光值，x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体，wt表示相应的转染子是野生型。

从图8(A-D)可以看出，IgG抗体A2J HLP显示显著丧失对成熟CD3链在位置4的天冬酰胺、在位置23的苏氨酸和在位置25的异亮氨酸的氨基酸的结合。观察到IgG抗体A2J HLP完全丧失对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸的氨基酸的结合。IgG抗体E2M HLP显示显著丧失对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺、在位置23的苏氨酸和在位置25的异亮氨酸的氨基酸的结合。IgG抗体E2M HLP显示完全丧失对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸的氨基酸的结合。IgG抗体H2C HLP显示中度丧失对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺的氨基酸的结合，且显示完全丧失对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸的氨基酸的结合。单链抗体F12Q HLP显示基本完全丧失对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和成熟CD3ε链在位置5的谷氨酸的氨基酸的结合。

6.种间特异性抗CD3结合分子H2C HLP对转染到鼠T细胞系EL4中的具有和不具有N-末端His6标签的人CD3ε链的结合分析

6.1.具有N-末端6-组氨酸标签(His6标签)的人CD3ε链的克隆和表达

通过基因合成获得编码具有N-末端His6标签的人CD3ε链的cDNA片段。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，框中随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是His6标签的编码序列，框中随后是成熟人CD3ε链的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.256和255)。基因合成片段还设计为在cDNA的始端和末端包含限制性位点。利用在5′末端引入的限制性位点EcoRI和在3′末端引入的限制性位点SalI用于如下克隆过程。随后根据标准方法通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-NEO的质粒(如上的)中。利用序列经证明的质粒转染鼠T细胞系EL4。根据上述进行转染子的转染和选择。细胞培养34天后，转染子用于下述测定。

6.2.种间特异性抗CD3结合分子H2C HLP与具有和不具有N-末端His6标签的人CD3ε链的结合

检测了特异于CD3ε的具有所述结合特异性的嵌合IgG抗体H2C HLP对具有和不具有N-末端His6标签的人CD3ε的结合。根据标准方法，通过FACS试验检测抗体与分别用His6-人CD3ε和野生型人CD3ε转染的EL4细胞系的结合。2.5×10⁵个转染子细胞与50μl包含嵌合IgG抗体的细胞培养物上清液或含有5μg/ml相应对照抗体和2％FCS的50μl PBS温育。分别使用合适的同种型对照作为阴性对照，使用CD3特异性抗体UCHT-1作为构建体表达的阳性对照。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab’)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测抗体结合。样品在FACSCalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定。与野生型人CD3ε转染的EL4细胞系相比，检测到具有结合特异性的嵌合IgG(H2CHLP)明显丧失了与具有N-末端His6标签的人CD3ε的结合。这些结果表明，CD3ε的自由N-末端对于种间特异性抗CD3的结合特异性H2C HLP与人CD3ε链的结合是必需的(图9)。

7.人MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域的克隆和表达

根据标准方法通过基因合成获得人MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域(氨基酸1538-2322)的编码序列(用于表达人MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域(命名为人D3)的重组构建体的cDNA序列和氨基酸序列列于SEQ ID NO.250和249)。该基因合成片段设计为包含允许构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是FLAG标签，框中随后是包含几个为了克隆目的的限制性位点并编码9个氨基酸的人工连接子(SRTRSGSQL)的序列，框中随后是人MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域的编码序列以及终止密码子。在DNA片段的始端和末端引入限制性位点。使用5′末端的限制性位点EcoRI和3′末端的限制性位点SalI进行如下克隆过程。根据标准方法，利用EcoRI和SalI消化所述片段并将其克隆到pEF-DHFR(pEF-DHFR描述于Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)。利用序列经过证明的质粒转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL 9096)。在37℃、95％湿度和7％CO₂的培养箱中，细胞在含有稳定的谷氨酰胺并补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素(都从Biochrom AG Berlin，德国获得)和来自细胞培养级试剂储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)的RPMI 1640中培养，其中所述核苷的终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的说明，使用PolyFect转染试剂(QiagenGmbH，Hilden，德国)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后用PBS洗涤细胞一次并再次在含有稳定的谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养。因此，细胞培养基不含核苷并由此对经转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到抗性细胞的生长。再过7-14天后通过FACS试验检测转染子的构建体表达。2.5×10⁵个细胞与在含2％FCS的PBS中稀释至5μg/ml的50μl抗Flag-M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)温育。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测抗体的结合。样品在FACScalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定。

8.猕猴MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域的克隆和表达

通过对猕猴皮肤cDNA(产品目录号C1534218-Cy-BC；BioCat GmbH，Heidelberg，德国)的一组三个PCR获得猕猴MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域(命名为猕猴D3)的cDNA序列，其中使用的反应条件如下：94℃3分钟的1个循环，94℃0.5分钟、52℃0.5分钟和72℃1.75分钟的40个循环，72℃3分钟的最后循环。使用如下引物：

正向引物：5’-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3’(SEQ ID No.361)

反向引物：5’-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3’(SEQ ID No.362)

正向引物：5’-TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3’(SEQ ID No.363)

反向引物：5’-CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3’(SEQ ID No.364)

正向引物：5’-GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3’(SEQ ID No.365)

反向引物：5’-GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3’(SEQ ID No.366)

这些PCR产生三个重叠片段(A：1-1329，B：1229-2428，C：1782-2547)，根据标准方法将其分离并使用PCR引物测序，从而产生猕猴MCSP的cDNA序列的2547bp的部分(猕猴MCSP该部分的cDNA序列和氨基酸序列列于SEQ ID NO.252和251)，其中所述2547bp的部分是从C-末端结构域的编码序列上游74bp到终止密码子下游121bp。使用另一个PCR来融合前面提到的反应A和B的PCR产物，所述另一个PCR所使用的反应条件如下：在94℃3分钟的1个循环，94℃1分钟，52℃1分钟和72℃2.5分钟的10个循环，72℃3分钟的最后循环。使用如下引物：

正向引物：5’-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3’(SEQ ID No.367)

反向引物：5’-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3’(SEQ ID No.368)。

将该PCR使用的引物设计为在编码猕猴MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域的cDNA片段的始端和末端引入限制性位点。使用在5′末端引入的限制性位点MfeI和在3′末端引入的限制性位点SalI进行如下克隆过程。随后通过代替人MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域，经由MfeI和SalI将PCR片段克隆到包含上述质粒pEF-DHFR的EcoRI/MfeI片段的Bluescript质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)。基因合成片段包含免疫球蛋白前导肽和Flag标签以及人工连接子(SRTRSGSQL)的编码序列，其中所述人工连接子在框中连接到编码猕猴MCSP的C-末端的跨膜且截短的细胞外结构域的cDNA片段的5′末端。利用该载体转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL 9096)。在37℃、95％湿度和7％CO₂的培养箱中，细胞在含有稳定的谷氨酰胺且补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素(都从Biochrom AG Berlin，德国获得)和来自细胞培养级试剂的储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)的RPMI 1640中培养，其中所述核苷的终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的说明，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后，用PBS洗涤细胞一次并再次培养在含有稳定的谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中。因此，细胞培养基不包含核苷并由此对转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到抗性细胞的生长。再过7-14天后通过FACS检测转染子的重组构建体表达。2.5×10⁵个细胞与在含有2％FCS的PBS中稀释到5μg/ml的50μl抗Flag-M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)温育。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab’)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测结合的抗体。样品在FACScalibur(BD biosciences，Heidelberg，德国)上测定。

9.MCSP和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生和表征

设计了包含对人和非黑猩猩灵长类CD3ε具有种间特异性的结合结构域以及对人和非黑猩猩灵长类MCSP具有种间特异性的结合结构域的双特异性单链抗体分子，列于下表1中：

表1：MCSP和CD3种间特异性双特异性单链抗体的形式

通过基因合成获得包含人和猕猴MCSP D3种间特异性的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域以及人和猕猴CD3种间特异性的VH结构域和VL结构域的上述构建体。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是组氨酸₆-标签的编码序列和终止密码子。还将基因合成片段设计为在N-末端和C-末端引入合适的限制性位点。根据标准方法(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)。根据标准方法，通过电穿孔将构建体稳定地或瞬时转染到DHFR-缺陷型CHO细胞(ATCC编号：CRL 9096)中或可选地以瞬时方式转染到HEK 293(人胚肾细胞，ATCC编号：CRL-1573)中。

按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566所述在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过添加浓度增加的氨甲蝶呤(MTX，终浓度达20nM MTX)来诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1％Pluronic F-68；HyClone)的滚瓶中生长7天，随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达蛋白的上清液储存在-20℃。

使用Explorer系统(GE Health Systems)和Unicorn软件用于色谱。根据制造商提供的说明，使用荷载有ZnCl₂的Fractogel EMD chelate(Merck)进行固定化金属亲和色谱(“IMAC”)。利用缓冲液A(pH 7.2的20mM磷酸钠缓冲液，0.1M NaCl)平衡柱并以3ml/分钟的流速将细胞培养物上清液(500ml)施加到柱(10ml)上。用缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步梯度的缓冲液B(pH 7.2的20mM磷酸钠缓冲液，0.1M NaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：

步骤1：6柱体积的20％缓冲液B

步骤2：6柱体积的100％缓冲液B

收集步骤2的洗脱的蛋白级分用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。

在用平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐，200mM赖氨酸，5％甘油，pH 7.2)平衡的HiLoad 16/60 Superdex 200制备级柱(GE/Amersham)上进行凝胶过滤色谱。洗脱(流速1ml/分钟)的蛋白样品经过标准SDS-PAGE和蛋白质印迹以进行检测。在纯化前，对柱进行校准以确定分子量(分子量标准物试剂盒，Sigma MW GF-200)。利用OD280nm测定蛋白浓度。

在还原条件下通过使用预制4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行的SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白。根据制造商提供的方法进行样品制备和施加。用MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。用胶态考马斯(Invitrogen方法)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定所分离的蛋白的纯度为＞95％。

根据磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的凝胶过滤测定，双特异性单链抗体在天然条件下的分子量为约52kDa。通过该方法纯化所有构建体。

根据制造商提供的方法，使用Optitran BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行蛋白质印迹。为了检测双特异性单链抗体蛋白抗体，使用抗His标签抗体(5His，Qiagen)。使用碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体作为二抗，BCIP/NBT(Sigma)作为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。

或者，在DHFR缺陷型CHO细胞中瞬时表达构建体。简言之，转染前一天，在37℃、95％湿度和7％CO₂的培养箱中，将各构建体的4×10⁵个细胞在含有稳定的谷氨酰胺且补充有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素和来自细胞培养级试剂的储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)的3ml RPMI 1640完全培养基中培养，其中所述核苷的终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的方法利用Fugene 6转染试剂(Roche，# 11815091001)进行转染。将94μl OptiMEM培养基(Invitrogen)和6μl Fugene 6混合并在室温温育5分钟。随后，加入各构建体的1.5μg DNA，混合并在室温下温育15分钟。同时，用1×PBS洗涤DHFR缺陷型CHO细胞并将其重悬于1.5ml RPMI 1640完全培养基中。利用600μl RPMI 1640完全培养基稀释转染混合物，将其加入到细胞中并在37℃、95％湿度和7％CO₂温育过夜。转染后次日，将各方法的温育体积扩展为5ml RPMI 1640完全培养基。温育3天后，收集上清液。

10.MCSP和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体关于分别对人和猕猴MCSP D3和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，使用转染有人MCSP D3的CHO细胞(如实施例7所述)和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)检测与人抗原的结合。通过使用所产生的猕猴MCSP D3转染子(实施例8中描述)和猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Erlangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；发表于Knappe A，等，和Fickenscher H.，Blood 2000，95，3256-61)检测与猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200000个细胞与50μl种间特异性双特异性抗体构建体的纯化蛋白(2μg/ml)或表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。使用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并利用鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fc γ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作T细胞系结合的阴性对照。使用具有无关靶特异性的单链构建体作为转染有MCSP-D3的CHO细胞结合的阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图10、11、12和39所示，可清楚地检测到对MCSP D3具有种间特异性且对人和猕猴CD3具有种间特异性的上述单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与对应的阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和MCSP D3的结合。证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及MCSP D3抗原的种间特异性。

11.MCSP和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例7和8所述的MCSP D3阳性细胞系通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC、受刺激的人PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。

按照以下产生受刺激的去除CD4/CD56的PBMC：

利用终浓度为1μg/ml的可商购抗CD3特异性抗体(如，OKT3，Othoclone)在37℃持续1小时进行培养皿(直径为145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)的包被。通过使用PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方法通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人血液)分离新鲜的PBMC。将3×10⁷-5×10⁷个PBMC加入到含稳定谷氨酰胺/10％FCS/IL-2 20U/ml(阿地白介素，Chiron)的120ml RPMI 1640的预包被培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并用RPMI 1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。根据标准方法，通过去除CD4+ T细胞和CD56+ NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

靶细胞用PBS洗涤两次并用含有11.1MBq⁵¹Cr和50％FCS的终体积为100μl的RPMI在37℃标记45分钟。随后用5ml RPMI洗涤标记的靶细胞3次并随后用于细胞毒性试验。在含总体积为250μl的补充RPMI(如上)的96孔板中进行实验，E∶T比为10∶1。采用1μg/ml的种间特异性双特异性单链抗体分子及其20个三倍稀释物。如果使用包含种间特异性双特异性单链抗体分子的上清液，使用其21个两倍稀释物和20个三倍稀释物分别用于猕猴和人细胞毒性实验。测定时间是18小时，且以上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入曲拉通-X)和自发裂解(没有效应细胞)的差异的相对值计算细胞毒性。所有计算均一式四份。利用Wizard 3″γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH，德国)进行上清液中的铬活性的计算。利用Windows的Prism 4(版本4.02，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行试验数据的分析。如软件所测定的，S形剂量响应曲线通常的R²值＞0.90。利用通过分析程序计算的EC₅₀值用于生物活性比较。

如图13-17和40所示，所产生的所有种间特异性双特异性单链抗体构建体证明了由受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC或受刺激的PBMC引起的针对人MCSP D3阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴MCSP D3阳性靶细胞的细胞毒活性。

12.MCSP和CD3种间特异性双特异性单链抗体的血浆稳定性

通过将双特异性单链抗体在37℃和4℃在50％人血浆中温育24小时随后测试生物活性而分析所产生的双特异性单链抗体在人血浆中的稳定性。使用MCSP阳性CHO细胞系(表达如根据实施例14或15的克隆MCSP)作为靶并使用受刺激的人CD8阳性T细胞作为效应细胞，在铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性实验中研究生物活性。

利用上述分析程序计算的EC₅₀值用于用50％人血浆分别在37℃和4℃温育24小时的双特异性单链抗体的生物活性和没有加入血浆或在测定之前即刻与相同量血浆混合的双特异性单链抗体的生物活性进行比较。

如图18和表2所示，与没有加入血浆或在测试生物活性之前即刻加入血浆的对照相比，G4H-L×I2C H-L、G4H-L×H2C H-L和G4H-L×F12Q H-L双特异性抗体的生物活性没有显著减少。

表2：无血浆或加入血浆的双特异性抗体的生物活性

13.在循环靶细胞不存在下通过首先暴露于针对常规即背景依赖性CD3表位的CD3结合分子的循环T细胞的再分布是与开始治疗相关的不良事件的主要风险因素

用常规CD3结合分子开始治疗后B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)患者中的T细胞再分布

常规CD19×CD3结合分子是双特异性串联scFv形式的CD3结合分子(Loffler(2000，Blood，Volume 95，Number 6)或WO 99/54440)。它由针对(i)正常和恶性人B细胞表面上的CD19和(ii)人T细胞上的CD3的两个不同结合部分组成。通过将T细胞上的CD3与B细胞上的CD19交联，该构建体通过T细胞的细胞毒活性触发了正常和恶性B细胞的重定向裂解。这种常规CD3结合分子识别的CD3表位位于CD3ε链，在此处仅当其被埋入ε链其余部分并通过ε链与CD3γ或δ链异二聚化而保持在正确位置时才会具有正确构象。这种高度背景依赖性表位与常规CD3结合分子的相互作用(参见如，Loffler(2000，Blood，Volume 95，Number 6)或WO 99/54440)可诱导CD3构象的变构改变(甚至当其以纯单价方式发生而无任何交联时也如此)，从而引起CD3ε胞质结构域内本来隐藏的脯氨酸-富集区的暴露。暴露后，脯氨酸-富集区可募集信号转导分子Nck2，其能够触发进一步的细胞内信号。尽管这对于完全T细胞活化并不足够，原因是完全T细胞活化绝对需要T细胞表面上的若干个CD3分子的交联，例如通过利用B细胞表面上的若干个CD19分子与T细胞上的若干个CD3分子结合的若干个抗CD3分子的交联，但是常规CD3结合分子对CD3ε上其背景依赖性表位的纯单价相互作用在信号传导方面对于T细胞来说仍不是无活性的。不受限于理论，单价的常规CD3结合分子(本领域已知的)在输注到人体时可诱导一些T细胞反应，甚至在没有循环靶细胞可用于CD3交联的情况下。向基本上没有循环CD19阳性B细胞的B-NHL患者静脉输注单价常规CD19×CD3结合分子的重要T细胞反应是开始治疗后T细胞的再分布。已在I期临床试验中发现，该T细胞反应发生在向无循环CD19阳性靶B细胞的所有个体中静脉输注CD19×CD3结合分子的初始阶段期间，基本上与CD19×CD3结合分子的剂量无关(图19)。然而，已发现CD19×CD3结合分子暴露的突然增加在这些患者中触发了与治疗开始时的最初暴露T细胞于CD19×CD3结合分子几乎相同的T细胞再分布反应(图20A)，甚至逐渐增加的CD19×CD3结合分子暴露仍可对循环T细胞具有再分布效应(图21)。而且，已发现在100％的所有治疗个体中不存在循环靶细胞的情况下由常规CD3结合分子如CD19×CD3结合分子(如，WO 99/54440公开的)触发的这种基本上剂量-独立的T细胞再分布反应是与开始治疗有关的不良事件的主要风险因素。

根据研究方法，在开放标记的、多中心I期患者间剂量升高试验中，招募了患有包括外套细胞淋巴瘤的经组织学证实的无痛B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)复发患者。研究方案由所有参与中心的独立伦理学委员会批准并通知负责的管理当局。要求将CT扫描证明的可测量的疾病(至少一个损害≥1.5cm)纳入到研究中。患者通过便携式微型泵系统以恒定流速(即剂量水平)在四周内连续静脉输注来接受常规的CD19×CD3结合分子。在治疗前两周患者住院，之后从医院解散并继续在家治疗。对四周后无疾病进展迹象的患者提供继续另外四周的治疗。迄今检测了未达到最大耐受剂量(MTD)的六个不同的剂量水平：0.5、1.5、5、15、30和60μg/m²/24h。观察各由三名患者组成的组是否没有研究方案定义为DLT的不良事件(剂量限制性毒性)。在前三名患者中出现一例DLT的情况下，将所述组扩大到六名患者，其在没有第二例DLT时允许进一步的剂量升高。因此，在3名患者的组中无DLT或6名患者的组中有一例DLT的剂量水平认为是安全的。在所有发展为DLT的患者中终止研究治疗。在15μg/m²/24h和30μg/m²/24h时，在几个另外的组中检测了前24h期间不同的治疗开始模式：(i)5μg/m²/24h持续前24h后逐步增加到15μg/m²/24h的维持剂量(患者组15-逐步)，(ii)平稳连续增加流速，从几乎零到15μg/m²/24h或30μg/m²/24h(患者组15-坡度和30-坡度)和(iii)最开始以维持剂量开始(患者组15-平坦、30-平坦和60-平坦)。剂量水平0.5、1.5和5μg/m²/24h的患者组都从最开始以维持剂量开始(即平坦开始)。

由如下四色FACS分析确定外周血中绝对B细胞计数和T细胞计数的时程：

收集血液样品和常规分析

使用包含EDTA的Vacutainer^TM管(Becton Dickinson)，在患者组15-坡度、15-平坦、30-坡度、30-平坦和60-平坦中，于开始输注前和开始输注CD19×CD3结合分子(如WO 99/54440公开的)0.75、2、6、12、24、30、48小时后以及在治疗第8、15、17、22、24、29、36、43、50、57天和结束常规CD19×CD3结合分子输注4周后获得血液样品(6ml)，其在4℃贮存用于分析。在患者组15-逐步中，开始输注前和开始输注CD19×CD3结合分子6、24、30、48小时后以及在治疗第8、15、22、29、36、43、50、57天和结束CD19×CD3结合分子输注4周后获得血液样品(6ml)。在剂量水平0.5、1.5和5μg/m²/24h时，开始输注前和开始输注CD19×CD3结合分子6、24、48小时后以及在治疗第8、15、22、29、36、43、50、57天和结束CD19×CD3结合分子输注4周后获得血液样品(6ml)。在一些情况下由于操作原因，这些时间点发生轻微变动。淋巴细胞亚群的FACS分析在血液样品收集后24-48h内进行。通过在Coulter计数器^TM(Coulter)上的差异血液分析确定血液样品中白细胞亚群的绝对数。

从血液样品分离PBMC

通过修改的Ficoll^TM梯度分离方法进行PBMC(外周血单核细胞)分离。在室温下将血液转移到预装有3ml Biocoll^TM溶液(Biochrom)的10ml Leucosep^TM管(Greiner)中。在摆动式转子(swing-out rotor)中以1700×g在22℃进行离心15分钟不减速。分离Biocoll^TM层上方的PBMC，用FACS缓冲液(PBS/2％FBS[胎牛血清；Biochrom])洗涤一次，离心并重悬于FACS缓冲液中。所有洗涤步骤期间的离心均在摆动式转子中以800×g、4℃进行4分钟。如果需要，通过在3ml红细胞裂解缓冲液(8.29g NH₄Cl，1.00g KHCO₃，0.037g EDTA，加1.0l H₂O双蒸水，pH 7.5)中室温温育分离的PBMC 5分钟进行红细胞裂解，随后是利用FACS缓冲液的洗涤步骤。

用针对细胞表面分子的荧光标记抗体对PBMC的染色

单克隆抗体从Invitrogen(¹产品目录号：MHCD1301，²产品目录号：MHCD1401)、Dako(⁵产品目录号：C7224)或Becton Dickinson(³产品目录号：555516，⁴产品目录号：345766)获得，根据制造商的建议使用。用如下抗体组合对5×10⁵-1×10⁶个细胞染色：抗CD13¹/抗CD14²(FITC)×抗CD56³(PE)×抗CD3⁴(PerCP)×抗CD19⁵(APC)。使细胞在V形96孔多滴定板(Greiner)中沉淀，并除去上清液。将细胞沉淀重悬于包含稀释的特异性抗体的100μl总体积的FACS缓冲液稀释中。4℃避光温育30分钟。随后，用FACS缓冲液洗涤样品两次并将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液用于流式细胞术分析。

由FACS流式细胞术检测染色的淋巴细胞

利用4色BD FACSCalibur^TM(Becton Dickinson)进行数据收集。对于每次测量，获取确定的淋巴细胞亚群的1×10⁴个细胞。利用程序CellQuest Pro^TM(Becton Dickinson)进行统计分析以获得淋巴细胞亚群百分比并对细胞表面分子表达强度进行分类。随后，将FACS确定的单淋巴细胞亚群相对于总淋巴细胞(即B加T加NK细胞，由CD13/14染色排除任何骨髓细胞)的百分比与来自差异血液分析的淋巴细胞计数关联以计算T细胞(CD3⁺、CD56^-、CD13/14^-)和B细胞(CD19⁺、CD13/14^-)的绝对细胞数。

在治疗开始时基本上没有循环CD19阳性B细胞的所有患者中，用常规CD19×CD3结合分子(如，WO 99/54440公开的)治疗初始阶段的T细胞再分布显示在(图19)中。为了比较，将在具有显著数目循环CD19阳性B细胞的患者中CD19×CD3结合分子治疗初始阶段的T细胞再分布的代表性实例显示于图22中。

在两种情况(即基本上没有循环B细胞或有许多循环B细胞)中，治疗开始后循环T细胞计数快速减少。然而，在不存在循环B细胞时，T细胞倾向于很早地返回到循环血液中，而T细胞返回到在治疗开始时具有显著数目循环B细胞的患者循环血液中通常被延迟，直到这些循环B细胞被去除。因此，T细胞再分布模式的主要区别在于循环血液中T细胞重现的动力学。

在治疗4周后和在接受另外4周治疗的患者治疗8周后，以及在所有的情况治疗结束后四周，通过中心参照放射进行基于CT扫描的效力评估。将所有已知损害(包括脾肿大)的消失和/或大小正常化加上在骨髓浸润的情况中清除骨髓中的淋巴瘤细胞，计为完全响应(CR)。将各预先确定的靶损害的两个最大直径的值之和(SPD)从基线减少至少50％定义为部分响应(PR)；减少至少25％认为是最小响应(MR)。将进行性疾病(PD)定义为SPD从基线增加≥50％。将SPD从基线偏差+50％到-25％认为是稳定的疾病(SD)。

34名患者中患者的统计数据、接受的剂量和临床结果总结于表3中。CD19×CD3结合分子的临床抗肿瘤活性明显为剂量依赖性的：从5μg/m²/24h开始一致性观察到外周血循环中CD19阳性B(淋巴瘤)细胞的去除。在15μg/m²/24h和30μg/m²/24h记录到第一次客观的临床响应(PR和CR)以及浸润的骨髓中部分和完全去除B淋巴瘤细胞的病例。最终，在60μg/m²/24h时响应率增加到100％(PR和CR)，并且对于所有可评价的病例，B淋巴瘤细胞从骨髓的清除都是完全的。

CD19×CD3结合分子被大多数患者良好耐受。不论因果，34名患者中1-4级的最频繁的不良事件总结于表4。CD19×CD3结合分子相关的不良事件通常是暂时和完全可逆的。尤其是，由于在CD19×CD3结合分子输注初始阶段期间与重复的T细胞再分布相关的CNS不良事件(主要症状：精神混乱和定向障碍)，有2名基本上没有循环CD19阳性B细胞的患者(表3中的患者#19和#24)的治疗在早期终止。

这些患者中的一个(#19)在组15-逐步中。他在前24h接受5μg/m²/24h CD19×CD3结合分子，随后突然增加到15μg/m²/24h的维持剂量。相应的T细胞再分布模式表明，以5μg/m²/24h开始输注时循环T细胞计数快速降低，随后是在基本上没有循环CD19阳性B细胞的循环血液中T细胞的早的重现。结果是，当CD19×CD3结合分子剂量在24h后从5μg/m²/24h增加到15μg/m²/24h时外周T细胞计数已经完全恢复。因此，剂量步骤可能触发T细胞再分布的第二事件，如显示于图20A。这种重复的T细胞再分布与该患者中的CNS副作用(主要症状：精神混乱和定向障碍)相关，这导致输注终止。重复的T细胞再分布和这种CNS不良事件之间的关联也在此前各以重复的推注2-4小时接受CD19×CD3结合分子(如，WO 99/54440公开的)且通常随后是2天无治疗间隔的B-NHL患者的I期临床试验中观察到(图20B)。每单次推注触发一次T细胞再分布事件，该再分布事件由循环T细胞计数快速减少和下次推注之前T细胞恢复组成。总之，在21名患者中，有5名观察到与重复的T细胞再分布有关的CNS不良事件。图20B显示推注试验的一名患者的代表性实例，其在第三次T细胞再分布事件后发展CNS症状。一般，在推注试验中具有CNS不良事件的患者还具有低的循环B细胞计数。

连续输注试验的第二名患者(#24)在组15-平坦中，其治疗由于在CD19×CD3结合分子输注初始阶段与重复的T细胞再分布相关的CNS不良事件(主要症状：精神混乱和定向障碍)而在早期终止。该患者错误地接受CD19×CD3结合分子输注而没有添加稳定药物所需的额外的HSA。所造成的不平稳的药物流触发了T细胞再分布的重复事件而不是仅仅一次(图23A)，结果是因为发展为CNS症状而不得不终止输注。然而，当同一患者以包含用于药物稳定的额外HSA的CD19×CD3结合分子溶液(如，WO 99/54440公开的)正确地重新开始时，未观察到重复的T细胞再分布，且患者不再发展为任何CNS症状(图23B)。因为该患者基本上也没有循环B细胞，所以循环T细胞可随快速再分布动力学，甚至是如所观察到的，对药物暴露中的微小变化发生反应。可通过T细胞粘着于内皮细胞的短暂增加、随后是循环T细胞大量同时粘着到血管壁，造成如观察到的循环血液中T细胞数连续下降来解释基本上没有循环靶细胞的患者中与T细胞再分布有关的CNS不良事件。T细胞大量同时粘着到血管壁可导致内皮渗透性和内皮细胞活化增加。内皮渗透性增加的结果是体液从血管内隔室转移到包括CNS间质组织的间质组织隔室。粘着的T细胞对内皮细胞活化可具有促凝血作用(Monaco等，J Leukoc Biol 71(2002)659-668)，可能扰乱血流(包括大脑血流)，尤其是对于毛细血管微循环。因此，在基本上没有循环靶细胞的患者中与T细胞再分布相关的CNS不良事件可以是由T细胞粘着于内皮细胞而导致的毛细血管泄漏和/或毛细血管微循环扰乱的结果。由T细胞再分布的一次事件导致的内皮应激被大多数患者耐受，而由重复的T细胞再分布导致的增强的内皮应激常常导致CNS不良事件。仅在具有低基线计数的循环T细胞的患者中，多于一次的T细胞再分布事件才可能是较低风险的。然而，在对这种事件易感性增加的罕见情况中，由一次T细胞再分布事件导致的有限的内皮应激也可导致CNS不良事件，如在以CD19×CD3结合分子推注试验的21名患者中，在1名患者中观察到该事件。

不受限于理论，可通过对常规CD3结合分子如CD19×CD3结合分子(如，WO 99/54440)与CD3ε上其背景依赖性表位的单价相互作用从而导致CD3构象的变构改变随后是如上述的募集Nck2于CD3ε胞质结构域的T细胞反应来解释在基本上没有循环靶细胞的患者中T细胞粘着于内皮细胞的短暂增加。由于Nck2通过PINCH和ILK与整合蛋白直接连接(图28)，故在经由常规CD3结合分子如CD19×CD3结合分子与CD3ε上其背景依赖性表位结合而使得CD3构象变构改变之后，Nck2向CD3ε胞质结构域的募集可通过经由内外信号传导将T细胞表面上的整合蛋白瞬时转换为其更粘着的同工型来增加T细胞对内皮细胞的粘着。

表3.患者统计数据和临床结果

^*通过Cheson标准，中心证实的完全响应(CR)和部分响应(PR)是粗体；MR，最小响应(≥25％至＜50％)；SD，稳定的疾病；PD，进行性疾病；括号内是距初次记录响应的持续时间；+表示正在响应

^a组4扩大为研究三种不同的初始治疗的疗程

^b在7周的无治疗间隔后以相同剂量另外治疗4周的周期后，PR在治疗8周后转为CR

n.e.：不可评价，因为治疗期＜7d

n.d.：不确定(浸润、但治疗结束时未进行第二次活检)

n.i.：治疗开始时未浸润

表4.治疗期间观察到的不良事件发生率

使用的缩写是：AE，不良事件；AP，碱性磷酸酶；LDH，乳酸脱氢酶；CRP，C-反应性蛋白；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；GGT，γ-谷氨酰转移酶；AE不包括患者34的额外治疗周期的数据。

如上所解释的，能够结合于背景依赖性表位的常规CD3结合分子(如，WO 99/54440公开的)尽管为功能性的但在患者中导致不期望的T细胞再分布效应，产生CNS不良事件。相反，本发明的结合分子通过与CD3ε链的背景独立的N-末端1-27个氨基酸结合而不导致这种T细胞再分布效应。因此，与常规CD3结合分子相比，本发明的CD3结合分子与更好的安全性概况有关。

14.通过识别表面靶抗原诱导T细胞介导的靶细胞裂解的本发明双特异性CD3结合分子在体内去除靶抗原阳性细胞

将CD33识别为靶抗原的本发明双特异性CD3结合分子去除食蟹猴外周血的CD33阳性的循环单核细胞

通过使用编码核苷酸序列SEQ ID NO.268在CHO细胞中表达产生CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL(氨基酸序列：SEQ ID NO.267)。(i)包含嵌入(embed)Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)终止密码子前的C-末端His₆标签的编码序列两者都符合读框地连接于核苷酸序列SEQ ID NO 268，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。根据描述(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，向培养物上清液中分泌CD3结合分子CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL的DHFR阳性转染子的选择，以及使用甲氨蝶呤(methotrexat)的基因扩增以提高表达水平。用于食蟹猴的CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL的分析SEC概况表明，测试材料几乎完全由单体组成。使用转染有食蟹猴CD33的CHO细胞作为靶细胞、猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞源，在如实施例16.5所述的细胞毒性试验中测定测试材料的效能(图25)。通过效应T细胞达到半数-最大靶细胞裂解所需的CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL浓度(EC50)测定为2.7ng/ml。

通过以不同流速(即剂量水平)连续静脉输注CD3结合分子CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL处理年轻(大约3岁)的成年食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))，以研究外周血中循环CD33阳性单核细胞的去除。这种情况等价于用常规CD3结合分子CD19×CD3(特异于B细胞上的CD19和T细胞上的CD3)治疗具有循环CD19阳性靶B细胞的B-NHL患者(参见如，WO99/54440)。已经证明去除外周血的循环CD19阳性靶B细胞是常规CD3结合分子(如WO99/54440提供的CD19×CD3)在CD19阳性B细胞恶性肿瘤(如B-NHL)患者的一般临床效力的有效替代物。类似地，认为去除外周血的循环CD33阳性单核细胞是本发明针对CD33的双特异性CD3结合分子(如CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL)在CD33阳性骨髓恶性肿瘤(如AML，急性髓细胞性白血病)患者中的一般临床效力的有效替代物。

根据Swivel方法按照以下进行连续输注：使用静脉导管对猴经股静脉插导管到尾大静脉中。该导管经皮下通到肩背区并外置在近尾部的肩胛骨。随后将管穿过套和保护弹簧。把套围绕动物固定，并且所述导管经由管连接于输注泵。

开始治疗前以48ml/24h连续输注7天无测试材料的施用溶液(1.25M赖氨酸，0.1％吐温80，pH 7)以使动物适应输注条件。通过以待检测的各单剂量水平所需的量(即CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL的流速)将CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL测试材料加入到施用溶液而开始治疗。在整个适应和治疗期每天更换输注储器。计划的治疗持续时间是7天，而不是120μg/m²/24h剂量水平的动物接受14天的治疗。

分别通过4-或3-色FACS分析测定循环T细胞和CD33阳性单核细胞的绝对计数的时程：

收集血液样品和常规分析

使用包含EDTA的Vacutainer^TM管(Becton Dickinson)，在开始输注前和开始连续输注MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL的0.75、2、6、12、24、30、48、72小时后以及在治疗7和14天后(以及120μg/m²/24h的剂量水平9天后)获得血液样品(1ml)，其在4℃贮存用于分析。在一些情况下由于操作原因，这些时间点发生轻微变动。在收集血液样品后24-48h内进行淋巴细胞亚群的FACS分析。在常规兽医实验室通过差异血液分析测定血液样品中白细胞亚群的绝对数。

从血液样品分离PBMC

利用类似于以上实施例13中描述的方法(对所使用的体积进行调整)分离PBMC(外周血单核细胞)。

以针对细胞表面分子的荧光标记抗体对PBMC染色

与食蟹猴抗原反应的单克隆抗体从Becton Dickinson(¹产品目录号：345784，²产品目录号：556647，³产品目录号：552851，⁶产品目录号：557710)、Beckman Coulter(⁴产品目录号：IM2470)和Miltenyi(⁵产品目录号：130-091-732)获得，并根据制造商的建议使用。使用如下抗体组合对5×10⁵-1×10⁶个细胞染色：抗CD14¹(FITC)×抗CD56²(PE)×抗CD3³(PerCP)×抗CD19⁴(APC)和抗CD14¹(FITC)×抗CD33⁵(PE)×抗CD16⁶(Alexa Fluor 647^TM)。其它步骤参见以上实施例13的描述进行。

通过FACS流式细胞术检测染色的淋巴细胞

利用4色BD FACSCalibur^TM(Becton Dickinson)进行数据收集。对于每次测量，获取确定的淋巴细胞亚群的1×10⁴个细胞。利用程序CellQuest Pro^TM(Becton Dickinson)进行统计分析以获得淋巴细胞亚群百分比并对细胞表面分子表达强度进行分类。随后，将FACS测定的单淋巴细胞亚群相对于总淋巴细胞(即B加T加NK细胞，由CD14染色排除骨髓细胞)的百分比与来自差异血液分析的淋巴细胞计数关联以计算T细胞(CD3⁺、CD56^-、CD14^-)的绝对细胞数。通过将来自差异血液分析的单核细胞计数乘以FACS测定的CD33阳性单核细胞(CD33⁺、CD14⁺)对所有单核细胞(CD14⁺)的相应的比而计算CD33阳性单核细胞的绝对数。

用CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL治疗结束时，在具有从30μg/m²/24h经60μg/m²/24h和240μg/m²/24h至1000μg/m²/24h的组间剂量升高的含2只食蟹猴的4个组中，绝对循环CD33阳性单核细胞计数与基线(即100％)相比的百分比显示在图26A。

如图26A所示，连续静脉输注CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL以剂量依赖性方式诱导循环CD33阳性单核细胞的去除。虽然在30μg/m²/24h仍然没有可检测的循环CD33阳性单核细胞的去除，但是在60μg/m²/24h治疗7天后CD33阳性单核细胞计数减少的第一个趋势变得可见。在240μg/m²/24h治疗3天后循环CD33阳性单核细胞几乎完全从外周血去除。在1000μg/m²/24h甚至更快达到这种去除，其中在治疗1天后已经完全去除外周血循环CD33阳性单核细胞。这一发现得到图26B所示结果的证实，证明在用CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL以120μg/m²/24h连续输注治疗14天的两只食蟹猴中，与相应的基线相比，循环CD33阳性单核细胞去除了三分之二和50％。

概括地说，该结果是本发明CD3结合分子临床效力的清楚预兆，具体而言是本发明的双特异性针对CD33的CD3结合分子用于治疗CD33阳性恶性肿瘤如AML的临床效力的清楚预兆。此外，如图22所示，在循环靶细胞(即CD33阳性单核细胞)存在下用CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL治疗的初始阶段期间的T细胞再分布看起来比用常规CD19×CD3构建体治疗的初始阶段期间T细胞再分布较不显著，如WO99/54440中对具有显著数的循环靶细胞(即CD19阳性B细胞)的B-NHL患者所描述的。尽管在开始CD19×CD3输注时T细胞完全从循环消失并直到循环CD19阳性靶B细胞从外周血去除才重新出现(图22)，但是在用CD33-AF5 VH-VL×I2C VH-VL开始的输注时循环T细胞最初的消失并不完全并且在存在循环CD33阳性靶细胞期间T细胞计数仍然恢复(图26B)。这证实了通过识别背景独立的CD3表位的本发明的CD3结合分子(针对人和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链表位并针对其产生，是如SEQ ID NO.2、4、6或8提供的氨基酸序列的部分或片段或全长)显示比识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子(如WO99/54440提供的结合分子)具有更有利的T细胞再分布特征。

15.针对基本上背景独立的CD3表位的本发明CD3结合分子通过在不存在循环靶细胞下诱导循环T细胞的较少再分布而减少与开始治疗有关的不良事件的风险

在使用本发明的代表性种间特异性CD3结合分子开始治疗后食蟹猴中T细胞的再分布减少

通过使编码核苷酸序列SEQ ID NO.194在CHO细胞中表达而产生MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL(氨基酸序列：SEQ ID NO.193)。将(i)包含嵌入Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)终止密码子前的C-末端His6的编码序列两者都符合读框地连接于核苷酸序列SEQ ID NO.194，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。根据描述(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，向培养物上清液中分泌CD3结合分子MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL的DHFR阳性转染子的选择，以及使用甲氨蝶呤的基因扩增以提高表达水平。处理食蟹猴的实验材料在200升发酵罐中产生。从收获物纯化蛋白是基于针对MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL C-末端His6标签的IMAC亲和色谱，随后是制备型尺寸排阻色谱(SEC)。最终无内毒素的测试材料的总产量是40mg。测试材料由70％单体、30％二聚体和少量污染性的更高多聚体组成。使用用食蟹猴MCSP转染的CHO细胞作为靶细胞，猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞源，在如实施例11所述的细胞毒性试验中测定测试材料的效能(图27)。通过效应T细胞达到半数-最大靶细胞裂解所需的MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL浓度(EC50)测定为1.9ng/ml。

通过在不同流速(即剂量水平)连续静脉输注CD3结合分子MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL处理年轻(大约3岁)的成年食蟹猴(cynomolgus monkeys，Macaca fascicularis)以研究在不存在循环靶细胞下开始治疗后循环T细胞的再分布。尽管CD3结合分子MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL可识别食蟹猴MCSP和食蟹猴CD3两者，但没有表达MCSP的循环血液细胞。因此，循环血液中可能的唯一相互作用是MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL的CD3特异性臂与T细胞上的CD3的结合。如实施例13所述，这种情况等价于用常规CD3结合分子(特异于B细胞上的CD19和T细胞上的CD3的CD19×CD3结合分子)治疗没有循环CD19阳性靶B细胞的B-NHL患者。

根据Swivel方法按照以下进行连续输注：使用静脉导管对猴经股静脉插导管到尾大静脉。该导管皮下通到肩背区并外置在近尾部的肩胛骨。随后将管穿过套和保护弹簧。把套围绕动物固定，并且所述导管经由管连接于输注泵。

开始治疗前以48ml/24h连续输注7天无测试材料的施用溶液(1.25M赖氨酸，0.1％吐温80，pH 7)以使动物适应输注条件。通过以待检测的各单剂量水平所需的量(即MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL的流速)将MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL测试材料加入到施用溶液而开始治疗。在整个适应和治疗期每天更换输注储器。治疗持续时间是7天。

由如下四色FACS分析测定外周血中绝对T细胞计数的时程：

收集血液样品和常规分析

使用包含EDTA的Vacutainer^TM管(Becton Dickinson)，在开始输注前和开始连续输注MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL的0.75、2、6、12、24、30、48、72小时后以及在治疗7天后获得血液样品(1ml)，其在4℃贮存用于分析。在一些情况下由于操作原因，这些时间点发生轻微变动。在血液样品收集后24-48h内进行淋巴细胞亚群的FACS分析。在常规兽医实验室通过差异血液分析测定血液样品中白细胞亚群的绝对数。

从血液样品分离PBMC

利用类似于以上实施例13中描述的方法(对所使用的体积进行调整)分离PBMC(外周血单核细胞)。

用针对细胞表面分子的荧光标记的抗体对PBMC染色

与食蟹猴抗原反应的单克隆抗体从Becton Dickinson(¹产品目录号：345784，²产品目录号：556647，³产品目录号：552851)和Beckman Coulter(⁴产品目录号：IM2470)获得，并根据制造商的建议使用。使用如下抗体组合对5×10⁵-1×10⁶个细胞染色：抗CD14¹(FITC)×抗CD56²(PE)×抗CD3³(PerCP)×抗CD19⁴(APC)。其它步骤参见以上实施例13的描述进行。

由FACS流式细胞术检测染色的淋巴细胞

利用4色BD FACSCalibur^TM(Becton Dickinson)进行数据收集。对于每次测量，获取确定的淋巴细胞亚群的1×10⁴个细胞。利用程序CellQuest Pro^TM(Becton Dickinson)进行统计分析以获得淋巴细胞亚群百分比并对细胞表面分子表达强度进行分类。随后，将FACS测定的单淋巴细胞亚群相对于总淋巴细胞(即B加T加NK细胞，由CD14染色排除骨髓细胞)的百分比与来自差异血液分析的淋巴细胞计数关联以计算T细胞(CD3⁺、CD56^-、CD14^-)的绝对细胞数。

图28显示用MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL在60、240和1000μg/m²/24h的剂量水平的治疗初始阶段期间，食蟹猴中的T细胞再分布。这些动物在治疗初始阶段期间根本不显示任何T细胞再分布的迹象，即在治疗开始时T细胞计数增加而不是减少。考虑到用针对背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子(如WO 99/54440描述的CD19×CD3构建体)开始治疗时，在没有循环靶细胞的所有(100％)患者中一致观察到了T细胞再分布，这证明在循环靶细胞不存在下用针对人和非黑猩猩灵长类CD3ε链表位并针对其产生的本发明CD3结合分子开始治疗时可观察到基本较少的T细胞再分布，其中本发明的CD3结合分子如SEQ ID NO：2、4、6或8任一氨基酸序列或其片段限定的序列。这与针对背景依赖性CD3表位的CD3结合分子(如WO 99/54440描述的构建体)明显不同。如(特别是)SEQ ID NO：2、4、6或8任一(或这些序列的片段)提供的针对背景独立的CD3表位的结合分子提供了这种基本较少的(有害和不期望的)T细胞再分布。因为用CD3结合分子治疗初始阶段期间T细胞再分布是CNS不良事件的主要风险因素，所以本文提供的能够识别背景独立的CD3表位的CD3结合分子具有优于本领域已知的针对背景依赖性CD3表位的CD3结合分子的显著优势。事实上，用MCSP-G4 VH-VL×I2C VH-VL治疗的食蟹猴均没有显示CNS症状的任何迹象。

CD3表位的背景独立性在本发明中提供并且对应于CD3ε的N-末端前27个氨基酸或该27个氨基酸段的片段。该背景独立的表位脱离其在CD3复合体中的天然环境并与异源氨基酸序列融合而不丧失其结构完整性。本文提供的针对背景独立的CD3表位产生(和针对)的抗CD3结合分子提供了关于T细胞再分布的令人惊奇的临床改善，并因此提供了更有利的安全性概况。不受限于理论，由于其CD3表位是背景独立的，其形成自主的自给自足的亚结构域而不太影响CD3复合体的其余部分，因此本文提供的CD3结合分子比识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子(如WO 99/54440中提供的分子)诱导较少的CD3构象的变构改变。结果是(再次不受限于理论)，还降低了本文提供的CD3结合分子对细胞内NcK2募集的诱导，导致T细胞整合蛋白的同工型转换较少和T细胞与内皮细胞的粘着较少。优选基本上由单体分子组成的本发明CD3结合分子(针对本文定义的背景独立的表位并针对本文定义的背景独立的表位产生)的制品。这些单体分子(比二聚体或多聚体分子)在避免T细胞再分布和由此在治疗初始阶段期间CNS不良事件的风险方面甚至更有效。

16.CD33和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生和表征

16.1.表达人CD33的CHO细胞的产生

根据标准方法由基因合成获得了GenBank公开的人CD33的编码序列(登录号NM_001772)。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人CD33蛋白的编码序列，框中随后是丝氨酸甘氨酸二肽、组氨酸₆-标签的编码序列和终止密码子(构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.305和306)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即在5′末端的EcoRI和在3′末端的SalI进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等，Cancer Immunol.Immunother 50(2001)141-150)。根据标准方法进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中，以真核表达构建体。根据Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的模式在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

16.2.表达猕猴CD33细胞外结构域的CHO细胞的产生

由根据标准方法制备的猕猴骨髓cDNA的一组3个PCR获得猕猴CD33的cDNA序列。使用如下反应条件：在94℃3分钟的1个循环，随后是94℃1分钟、53℃1分钟和72℃2分钟的35个循环，随后是72℃3分钟的最后循环，并使用如下引物：

1.正向引物：

5’-gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg-3’(SEQ ID No.369)

反向引物：5’-gatttgtaactgtatttggtacttcc-3’(SEQ ID No.370)

2.正向引物：5’-attccgcctccttggggatcc-3’(SEQ ID No.371)

反向引物：5’-gcataggagacattgagctggatgg-3’(SEQ ID No.372)

3.正向引物：5’-gcaccaacctgacctgtcagg-3’(SEQ ID No.373)

反向引物：5’-agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg-3’(SEQ ID No.374)

这些PCR产生三个重叠片段，根据标准方法将其分离并使用PCR引物测序，从而产生猕猴CD33从成熟蛋白密码子+2的第二核苷酸到密码子+340的第三核苷酸的部分cDNA序列。为了产生表达猕猴CD33的构建体，根据标准方法通过基因合成获得了cDNA片段(构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.307和308)。在该构建体中，从成熟CD33蛋白的氨基酸+3到+340的猕猴CD33的编码序列与人CD33的编码序列融合，从而代替人的氨基酸+3到+340的编码序列。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在包含基本编码猕猴CD33的全细胞外结构域、猕猴CD33跨膜结构域和猕猴-人嵌合细胞内CD33结构域的cDNA的片段始端和末端的限制性位点。利用在5′末端引入的限制性位点XbaI和在3′末端引入的限制性位点SalI进行如下克隆过程。随后通过XbaI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等，Cancer Immunol.Immunother 50(2001)141-150)。如上所述，利用该质粒的序列经过证明的克隆转染CHO/dhfr-细胞。

16.3.CD33和CD3种间特异性双特异性抗体分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表5中所列，设计均包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε种间特异性的结合特异性的结构域以及具有对人和非黑猩猩灵长类CD33种间特异性的结合特异性的结构域的各个双特异性抗体分子：

表5：抗CD3和抗CD33种间特异性双特异性分子的形式

通过基因合成获得包含人和猕猴CD33的种间特异性可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和人和猕猴CD3的种间特异性CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSP和CD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段并进行真核蛋白表达。

同样，进行CD33和CD3种间特异性单链分子的表达和纯化。

在蛋白质印迹中检测到的52kD的单个条带即对应于所纯化的双特异性抗体。

16.4.CD33和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体的分别对人和猕猴CD33和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析，所述FACS分析类似于在实施例10中描述的利用表达人或猕猴CD33的细胞外结构域的CHO细胞对MCSP和CD3种间特异性双特异性抗体进行的分析(参见实施例16.1和16.2)。

如图29所示，本发明CD3结合分子对人和非黑猩猩灵长类CD3的特异性结合是可清楚检测到的。在FACS分析中，与对应的阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和CD33的结合。这证明了双特异性抗体对人和猕猴CD3和CD33抗原的种间特异性。

16.5.CD33和CD3种间特异性双特异性抗体的生物活性

使用实施例16.1和16.2所述的CD33阳性细胞系通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性抗体的生物活性。如各图所示，使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。使用表达人或猕猴CD33细胞外结构域的CHO细胞(参见实施例16.1和16.2)作为靶细胞，按照实施例11中描述的对MCSP和CD3种间特异性双特异性抗体进行的生物活性分析类似的方式进行细胞毒性试验。

如图30所示，所有产生的种间特异性双特异性构建体都证明了由受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC引发的针对人CD33阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴CD33阳性靶细胞的细胞毒活性。

17.基于对应于N-末端氨基酸1-27的背景独立的CD3ε表位由亲和方法纯化种间特异性双特异性单链分子

17.1展示分离的对应于N-末端氨基酸1-27的背景独立的人CD3ε表位的亲和柱的产生

将用于表达上述构建体1-27 CD3-Fc(实施例3；重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO.230和229中)的质粒转染到DHFR缺陷型CHO细胞用于真核表达构建体，其中所述构建体1-27 CD3-Fc由与人免疫球蛋白IgG1的铰链和Fc γ区融合的人CD3ε链的1-27N-末端氨基酸组成。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度到达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在包含无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1％Pluronic F-68；HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含所表达的蛋白的上清液储存在-20℃。为了分离融合蛋白，根据标准方法使用商购的对牛、马和小鼠血清蛋白具有最小交叉反应的亲和纯化的山羊抗人IgG(Fc片段特异性抗体)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)来制备山羊抗人Fc亲和柱。使用该亲和柱在 Explorer系统(GE Amersham)上将融合蛋白从细胞培养物上清液中分离出来并利用柠檬酸洗脱。中和洗脱物并浓缩。对不含胺偶联缓冲液(coupling buffer)透析后，将纯化的融合蛋白偶联于N-羟基-琥珀酰亚胺NHS活化的1ml HiTrap柱(GE Amersham)上。

偶联后，封闭剩余的NHS基团并洗涤柱，并在5℃储存在包含0.1％叠氮化钠的储存缓冲液中。

17.2使用人CD3肽亲和柱纯化种间特异性双特异性单链分子

将200ml表达种间特异性双特异性单链分子的细胞的细胞培养物上清液进行0.2μm无菌过滤并使用Explorer系统(GE Amersham)加到CD3肽亲和柱上。

随后用磷酸盐缓冲盐水PBS(pH 7.4)洗涤柱以洗去未结合的样品。利用包含20mM柠檬酸和1M氯化钠的酸性缓冲液pH 3.0进行洗脱。立即用级分收集器的收集管中含有的1M三羟基甲基胺TRIS(pH 8.3)中和所洗脱的蛋白。

通过SDS PAGE和蛋白质印迹进行蛋白分析。

对于SDS PAGE，使用4-12％的BisTris凝胶(Invitrogen)。电泳缓冲液是1×MES-SDS-Puffer(Invitrogen)。施加15μl预染色Sharp蛋白标准品(Invitrogen)作为蛋白标准。在200伏120mA max电泳60分钟。凝胶在软化水中洗涤，并用考马斯染色一小时。在软化水中对凝胶脱色3小时。采用Syngene凝胶记录系统采集图像。

对于蛋白质印迹，制备两份SDS PAGE凝胶并将蛋白电印迹到硝酸纤维素膜上。用含2％牛血清白蛋白的PBS封闭膜并用生物素化的鼠5His抗体(Qiagen)温育。使用链霉亲和素碱性磷酸酶共轭物(DAKO)作为第二试剂。利用BCIP/NBT底物溶液(Pierce)使印迹显影。

如图31、32和33证明的，使用上述人CD3肽亲和柱可以从细胞培养物上清液高效纯化所述双特异性单链分子。因此，双特异性单链分子中包含的种间特异性抗CD3单链抗体能够通过其特异性结合特性利用有效且通用的一步方法纯化种间特异性双特异性单链分子，而不需要仅为了纯化目而连接任何标签。

18.种间特异性双特异性单链分子的一般药物代谢动力学测定

18.1 用于药物代谢动力学试验的1-27 CD3-Fc的生产

根据标准方法，由基因合成获得了与人免疫球蛋白IgG1的铰链和Fcγ区融合的人CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO.309和310中)。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人CD3ε链细胞外部分的前27个氨基酸的编码序列，框中随后是人IgG1的铰链区和Fcγ部分的编码序列和终止密码子。还按照实施例3.1(参见上文)的描述设计并克隆基因合成片段。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照实施例9的描述(见上文)在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。为了分离融合蛋白，根据标准方法使用商购的对牛、马和小鼠血清蛋白具有最小交叉反应的亲和纯化的山羊抗人IgG(Fc片段特异性抗体)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)来制备山羊抗人Fc亲和柱。使用该亲和柱，在 Explorer系统(GE Amersham)上将融合蛋白从细胞培养物上清液分离出来并用柠檬酸洗脱。中和洗脱物并浓缩。

18.2种间特异性双特异性单链分子的药物代谢动力学试验

该试验基于ECL-ELISA技术，其使用钌标记的检测在Sektor成像器(MSD)上测定碳板。第一步，以5μl/孔用50ng/ml的实施例18.1描述的纯化的1-27CD3-Fc包被碳板(MSD高结合96孔板产品目录：L15×B-3)。该板随后在25℃干燥过夜。然后在培养箱中摇动(700rpm)的同时使用含5％BSA(Paesel & Lorei #100568)的PBS以150μl/孔在25℃封闭1h。下一步，用含0.05％吐温的PBS洗涤板三次。通过对该实验中待测的相应种间特异性双特异性单链分子以100ng/ml起始的浓度进行1∶4的连续稀释，产生其在含50％猕猴血清的PBS中的标准曲线。根据预期的样品血清浓度，在含50％猕猴血清的PBS中制备质量控制(QC)样品，范围从1ng/ml到50ng/ml的相应种间特异性双特异性单链分子。将标准品、QC或未知样品以10μl/孔转移到碳板并在培养箱中摇动(700rpm)的同时在25℃温育90分钟。随后利用含0.05％吐温的PBS洗涤板三次。为了检测，以25μl/孔加入5His-生物素抗体(Qiagen，200μg/ml，含0.05％吐温的PBS中)并在培养箱中摇动(700rpm)的同时在25℃温育1小时。在第二检测步骤，以25μl/孔加入链霉亲和素-SulfoTag溶液(MSD；产品目录：R32AD-1；批号：WO010903)并在培养箱中摇动(700rpm)的同时在25℃温育1小时。随后板用含0.05％吐温的PBS洗涤板三次。最后以150μl/孔加入MSD读数缓冲液(MSD，产品目录：R9ZC-1)并在Sektor成像器中对板读数。

图34和35证明了对于种间特异性双特异性单链分子而言，在猕猴血清样品中检测种间特异性双特异性单链分子的可行性。因此，双特异性单链分子中包含的种间特异性抗CD3单链抗体经由其特异性结合性质能够通过高敏感性的通用试验检测种间特异性双特异性单链分子。上述试验可用于药物开发所需的正式的毒理学研究范畴，并易于修改以便用来测定与种间特异性双特异性单链分子的临床应用有关的患者样品。

19.与食蟹猴的EpCAM融合的不同非黑猩猩灵长类CD3ε的N-末端氨基酸1-27的重组跨膜融合蛋白(1-27 CD3-EpCAM)的产生。

19.11-27 CD3-EpCAM的克隆和表达

从不同的非黑猩猩灵长类(狨猴、绢毛猴、松鼠猴)和猪分离CD3ε。根据标准方法，通过基因合成获得与加Flag标签的食蟹猴EpCAM N-末端融合的成熟人、普通狨猴、绒顶柽柳猴、普通松鼠猴和家猪(domestic swine，Sus scrofa，用作阴性对照)CD3ε链1-27N-末端氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO.231-240)。基因合成片段设计为包含开始的BsrGI位点以允许正确读框地与靶表达载体中已经存在的19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列融合，框中随后是成熟CD3ε链细胞外部分N-末端1-27个氨基酸的编码序列，框中随后是Flag标签的编码序列，框中随后是成熟食蟹猴EpCAM跨膜蛋白的编码序列。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA的末端引入限制性位点。利用在5′末端引入的限制性位点BsrGI和在3′末端引入的限制性位点SalI进行如下克隆过程。随后根据标准方法，通过BsrGI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒的衍生物中(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)，该衍生物已经包含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列。利用序列经过证明的质粒转染DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566中的描述在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

根据标准方法，通过FACS试验检测转染子的重组跨膜蛋白在细胞表面的表达。为此目的，将2.5×10⁵个细胞在50μl含有5μg/ml抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)和2％FCS的PBS中温育。利用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测结合的抗体。在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

可清楚地检测到由食蟹猴EpCAM分别和人、狨猴、绢毛猴、松鼠猴以及猪CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸组成的加Flag标签的重组跨膜融合蛋白在转染细胞上的表达(图36)。

19.2 IgG1抗体形式的种间特异性抗CD3单链抗体I2C HL的克隆和表达

为了提供检测种间特异性单链抗CD3抗体结合的改进方法，将I2C VHVL特异性转变为具有鼠IgG1和鼠κ恒定区的IgG1抗体。根据标准方法，通过基因合成获得编码IgG抗体重链的cDNA序列。基因合成片段设计为首先允许构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是重链可变区或轻链可变区的编码序列，框中随后分别是GenBank公开的鼠IgG1重链恒定区的编码序列(登录号AB097849)或GenBank公开的鼠κ轻链恒定区的编码序列(登录号D14630)。

在编码融合蛋白的cDNA始端和末端引入限制性位点。利用在5′末端的限制性位点EcoRI和在3′末端的限制性位点SalI进行如下克隆过程。根据标准方法，对于重链构建体，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)中并对于轻链构建体克隆到pEFADA中(pEFADA描述于Raum等人的文献，上述引文)。使用序列经过证明的质粒将相应的轻链构建体和重链构建体共转染到DHFR缺陷型CHO细胞中，以用于真核表达构建体。根据Kaufmann R.J.(1990，上述引文)的描述在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨喋呤(MTX)的浓度到达20nM MTX的终浓度和脱氧柯福霉素(dCF)到达300nM dCF的终浓度来诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，收集细胞培养物上清液并用于随后的实验。

19.3 IgG1抗体形式的种间特异性抗CD3单链抗体I2C HL对1-27 CD3-EpCAM的结合

根据标准方法，在FACS试验中检测所产生的I2C IgG1构建体对实施例19.1描述的分别与食蟹猴Ep-CAM融合的人、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链的N-末端1-27个氨基酸的结合。为此目的，将2.5×10⁵个细胞与50μl的包含如实施例19.2所述的I2C IgG1构建体的细胞培养物上清液温育。用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测抗体的结合。在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并使用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图37所示，与由与食蟹猴EpCAM融合的猪CD3ε的N-末端1-27个氨基酸组成的阴性对照相比，观察到I2C IgG1构建体对表达与食蟹猴EpCAM融合的人、狨猴、绢毛猴或松鼠猴CD3ε的N-末端1-27个氨基酸组成的重组跨膜融合蛋白的转染子的结合。因此，证明了I2C的多灵长类种间特异性。用抗Flag M2抗体和I2C IgG1构建体获得的信号相当，这表明种间特异的特异性I2C对CD3ε的N-末端氨基酸1-27的强结合活性。

20.种间特异性抗CD3结合分子I2C对具有和不具有N-末端His6标签的人CD3ε链的结合

检测如实施例19.2所述的对CD3ε特异的结合特异性嵌合IgG1抗体I2C对具有和不具有N-末端His6标签的人CD3ε的结合。根据标准方法由FACS试验检测抗体对分别转染有实施例6.1描述的His6-人CD3ε和实施例5.1描述的野生型人CD3ε的EL4细胞系的结合。用50μl包含I2C IgG1构建体的细胞培养物上清液或50μl含有5μg/ml相应对照抗体和2％FCS的PBS温育转染子的2.5×10⁵个细胞。分别使用合适的同种型对照作为阴性对照，并且对于构建体的表达使用CD3特异性抗体UCHT-1作为阳性对照。利用5His抗体(Qiagen)进行His6标签的检测。利用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab’)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Newmarket，Suffolk，UK)检测抗体的结合。在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

抗人CD3抗体UCHT-1与两种转染子的相当的结合证明了构建体的表达水平大约相等。5His抗体的结合证实His6-人GD3构建体上存在His6标签而野生型构建体上不存在。

与用野生型人CD3ε转染的EL4细胞系相比，检测到I2C IgG1构建体明显丧失了对具有N-末端His6标签的人CD3ε的结合。这些结果表明，CD3ε的自由N-末端对于种间特异性抗CD3结合特异性I2C与人CD3ε链的结合是必需的(图28)。

21.CD33和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

21.1CD33和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

通常，如下表6中所列，设计均包含具有对人和猕猴CD3ε种间特异性的结合特异性的结构域以及具有对人和猕猴CD33种间特异性的结合特异性的结构域的各双特异性单链抗体分子：

表6：抗CD3和抗CD33种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

通过基因合成获得包含人和猕猴CD33种间特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域以及人和猕猴CD3种间特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSP和CD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段。将序列经证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中，以真核表达构建体。同样按照实施例9中关于MCSP和CD3种间特异性单链分子的描述在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达并用在随后的试验中。

21.2 CD33和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体关于分别对人和猕猴CD33和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析，所述FACS分析类似于在实施例10中描述的利用表达人或猕猴CD33的细胞外结构域的CHO细胞对MCSP和CD3种间特异性双特异性抗体进行的分析(实施例16.1和16.2)。

如图41所示，可清楚地检测到对CD33种间特异性的且为人和非黑猩猩灵长类CD3种间特异性的上述单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与相应的阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和CD33的结合。这证明了所述双特异性抗体对人和猕猴CD3和CD33抗原的种间特异性。

21.3.CD33和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例16.1和16.2所述的CD33阳性细胞系通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。使用表达人或猕猴CD33细胞外结构域的CHO细胞(参见实施例16.1和16.2)作为靶细胞，按照实施例11中描述的对MCSP和CD3种间特异性双特异性抗体进行的生物活性分析类似的方式进行细胞毒性试验。

如图42所示，所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC引发的针对人CD33阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴CD33阳性靶细胞的细胞毒活性。

22.循环黑猩猩T细胞在暴露于针对循环血液细胞中不存在的靶分子的常规双特异性CD3结合分子后的再分布

以静脉内单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体对单只雄性黑猩猩进行剂量升高(Schlereth(2005)Cancer Res 65：2882)。与在常规单链CD19/CD3双特异性抗体构建体(Loffler(2000，Blood，Volume 95，Number 6)或WO 99/54440)中的一样，所述EpCAM/CD3构建体的CD3臂也是针对人和黑猩猩CD3的常规背景依赖性表位的。在第0天，动物接受无测试材料的50ml PBS/5％HSA，随后分别在第7、14、21和28天接受含1.6、2.0、3.0和4.5μg/kg单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体的50ml PBS/5％HSA。每次施用的输注时间期间是2小时。对于每次每周的输注，肌内使用2-3mg/kg舒泰(Telazol)使黑猩猩镇静，插管并置于异氟烷/O₂麻醉，使平均血压稳定。将第二静脉内导管放置在相对肢以在图43所示的时间点收集(肝素化)全血样品用于循环血液细胞的FACS分析。在标准红细胞裂解后，用与黑猩猩CD2反应的FITC标记的抗体(Becton Dickinson)对T细胞染色，并由流式细胞术测定各总淋巴细胞中T细胞的百分比。如图43所示，和单链CD19/CD3双特异性抗体构建体在基本没有循环靶B(淋巴瘤)细胞的B-NHL患者中观察到的一样，每次施用单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体都引起循环T细胞的快速下降。由于在人和黑猩猩的循环血液中没有EpCAM阳性靶细胞，因此循环T细胞在暴露于单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体时的下降可仅仅归因于信号，其中T细胞经由构建体的CD3臂与常规背景依赖性CD3表位的单纯相互作用接收该信号而不存在任何靶细胞介导的交联。与在基本上没有循环靶B(淋巴瘤)细胞的B-NHL患者中暴露于单链CD19/CD3双特异性抗体构建体而诱导的T细胞再分布一样，黑猩猩中暴露于单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体时的T细胞再分布可通过对背景依赖性CD3表位的结合事件后CD3的构象变化进一步导致与血管内皮粘着的T细胞的短暂增加来解释(参见实施例13)。这一发现证实，仅经由该相互作用，针对背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子可导致外周血T细胞的再分布模式，这与如实施例13所述的人CNS不良事件的风险有关。

23.scFv克隆对人CD3ε的N-末端的特异性结合

23.1 scFv构建体在大肠杆菌XL1Blue中的细菌表达

如前所述，转化有含有VL和VH区段的pComb3H5BHis/Flag的大肠杆菌XL1 Blue在切除基因III片段且使用1mM的IPTG诱导后产生足够量的可溶性scFv。所述scFv-链被输出到周质并在此折叠成功能构象。

选择如下scFv克隆用于所述实验：

i)如WO 2004/106380所述的ScFv 4-10、3-106、3-114、3-148、4-48、3-190和3-271。

ii)来自本文所述的人抗CD3ε结合克隆H2C、F12Q和I2C的ScFv。

对于周质制品，将转化有相应scFv且包含允许周质表达的质粒的细菌细胞在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基中培养并在收集后重新溶解在PBS中。通过在-70℃下冷冻和在37℃下解冻的四个循环，细菌的外层膜被渗透冲击而毁坏，而包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含人抗人CD3-scFv的上清液并用于进一步的测定。这些包含scFv的粗制上清液还将被称为周质制品(PPP)。

23.2 scFv与人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白的结合

一般通过在4℃过夜而将人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白包被到96孔塑料板(Nunc，maxisorb)的孔中，从而进行ELISA实验。随后除去抗原包被溶液，用PBS/0.05％吐温20洗涤孔一次，随后用PBS/3％BSA封闭至少一小时。除去封闭溶液后，向孔中加入PPP和对照溶液并且一般在室温温育一小时。随后用PBS/0.05％吐温20洗涤孔三次。使用生物素标记的抗FLAG标签抗体(M2抗Flag-Bio，Sigma，以一般为1μg/ml的终浓度包含在PBS中)测定与固定抗原结合的scFv，并用过氧化物酶标记的链霉亲和素(Dianova，1μg/ml PBS)检测。通过加入ABTS底物溶液使信号显影并测定在405nm的波长。通过利用相同试剂和对ELISA板的相同时间安排进行相同测定来测定测试样品与封闭剂和/或人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白的人IgG1部分的非特异性结合，其中所述ELISA板用人IgG1(Sigma)包被。使用PBS作为阴性对照。

如图44所示，scFv H2C、F12Q和I2C显示对人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白的强结合信号。人scFv 3-106、3-114、3-148、3-190、3-271、4-10和4-48(如WO 2004/106380所述)不显示高于阴性对照水平的任何显著结合。

为了排除scFv H2C、F12Q和I2C与用人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白包被的孔的阳性结合可能是因为与BSA(用作封闭剂)和/或人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白结合的人IgG1 Fc-γ部分的可能性，平行地进行第二ELISA实验。除了在第二ELISA实验中用人IgG1(Sigma)而不是人CD3ε(aa 1-27)-Fc融合蛋白包被外，在第二ELISA实验中的所有参数都与第一ELISA实验中的参数相同。如图45所示，检测的scFv都不显示与BSA和/或人IgG1的高于背景水平任何显著结合。

总之，这些结果可以得出结论：识别CD3ε的背景依赖性表位的常规CD3结合分子(如，WO 2004/106380公开的)不与人CD3ε(aa 1-27)区特异结合，而与CD3ε的背景独立的表位结合的scFv H2C、F12Q和I2C清楚地显示与人CD3ε的N-末端27个氨基酸的特异结合。

24.PSCA和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生和表征

24.1 表达人PSCA的CHO细胞的产生

根据标准方法通过基因合成获得如GenBank(登录号NM_005672)公开的人PSCA的编码序列。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是FLAG标签的编码序列，框中随后是成熟人PSCA蛋白的编码序列和终止密码子(构建体的相应序列列于SEQ ID NO.443和444)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

24.2 表达猕猴PSCA的CHO细胞的产生

通过根据标准方法由猕猴(食蟹猴)前列腺制备的cDNA的PCR获得猕猴PSCA的cDNA序列。使用如下反应条件：94℃2分钟的1个循环，然后是94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着是72℃3分钟的最后循环，并使用以下引物：

正向引物：5’-CACCACAGCCCACCAGTGACC-3’(SEQ ID NO.447)

反向引物：5’-GAGGCCTGGGGCACCACACCC-3’(SEQ ID NO.448)

在加入终浓度为1M的PCR级甜菜碱的条件下进行PCR反应。该PCR产生DNA片段，对其进行分离并使用PCR引物根据标准方法进行测序，由此产生了编码猕猴PSCA的cDNA序列。为了产生用于表达猕猴PSCA的构建体，根据标准方法通过基因合成获得cDNA片段(相应的序列列于SEQ ID NO：445和446中)。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是FLAG标签的编码序列，框中随后是成熟人PSCA蛋白的编码序列和终止密码子。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

24.3 PSCA和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生

种间特异性PSCAxCD3双特异性单链抗体分子的克隆

通常，如下表7中所列，设计均包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性的结构域以及具有对人和非黑猩猩灵长类PSCA的种间特异性的结合特异性的结构域的各个双特异性抗体分子：

表7：抗-CD3和抗-PSCA种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

通过基因合成获得包含人和猕猴PSCA的种间特异性可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和人和猕猴CD3的种间特异性CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSP和CD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段并进行真核蛋白表达。

24.4 PSCAxCD3双特异性单链抗体分子的表达和纯化

按照本文以上关于MCSPxCD3双特异性单链抗体的描述，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞中表达所述双特异性单链抗体分子。

所表达的双特异性单链抗体的分离和分析也在上文实施例9中有描述。

24.5 PSCA和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体的分别对人和猕猴PSCA和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。出于此目的，使用如实施例24.1所述的转染有人PSCA的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)测定与人抗原的结合。通过使用所产生的在实施例24.2中描述的猕猴PSCA转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Erlangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；发表于Knappe A，等，和Fickenscher H.，Blood 2000，95，3256-61)测定与猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200000个细胞与50μl表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。使用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并利用鼠抗5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的细胞的上清液用作阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图46和48所示，可清楚地检测到对PSCA和CD3具有种间特异性的单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和PSCA的结合。证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及PSCA抗原的种间特异性。

24.6 PSCA和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例24.1所述的转染有人PSCA的CHO细胞和实施例24.2所述的转染有猕猴PSCA的CHO细胞通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。分别使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。

受刺激的人PBMC的产生描述在上文实施例11中。

制备靶细胞，并进行类似于实施例11中描述的MCSPxCD3双特异性单链抗体的过程的试验。

如图47和49所示，所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC引发的针对人PSCA阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴PSCA阳性靶细胞的细胞毒活性。

24.7 针对人和非黑猩猩灵长类CD3和PSCA的双特异性单链抗体构建体

选择人抗体种系VH序列VH11-f(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID NO.414)、CDRH2(SEQ ID NO.415)和CDRH3(SEQ ID NO.416)的骨架背景。类似地，选择相同的人抗体种系VH序列作为CDRH1(SEQ ID NO.400)、CDRH2(SEQ ID NO.401)和CDRH3(SEQ ID NO.402)的骨架背景。对于每种人VH，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物均是反义引物。对于VH1 1-f，使用如下寡核苷酸：

5’P3-VH-A-XhoI

CCT GAT CTC GAG AGC GGC SCA GAS STG RAA AAG CCA GGC GCC ACG GTG AAG ATT(SEQ ID NO.449)

5’P3-VH-B

GGC GCC ACG GTG AAG ATT TCC TGC AAG SYC AGC GGC WAC ACG TTC ACC GGC TAC TAC ATC CAC TGG GTG(SEQ ID NO.450)

3’P3-VH-C

GTA GGA GGT GAA GCC GTT GTT GGG GTC CAC TCT GCC SAT CCA TTC CAG GCY CTT CCC GKG GGM CTG TTK CAC CCA

5’P3-VH-D

AAC GGC TTC ACC TCC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC ARG GYC AYA MTK ACC GYG GAC AMG AGC ACC RRC ACC GCC TAC ATG GAA CTG(SEQ ID NO.452)

3’P3-VH-E

GCT GTC GAA GAA GTT GCC CRC GCA ATA GTA CAC GGC GGT GTC CTC GCT GSK CAG GCT KCT CAG TTC CAT GTA GGC

3’P3-VH-F-BstEII

CAC GTC GGT GAC CGT GGT TCC CTG GCC CCA GCT GTC GAA GAA GTT GCC (SEQ ID NO.454)

作为用于VH1 1-f的另一组寡核苷酸，使用以下引物：

5’-PSCA2VH-A-XHO1

CAG GTG CTCGAG YCA GGC GCC GAA STG RWG AAG CCT GGC GCC MCA GTG AAG MTA TCC TGC AAG GYC AGC GGC TAC A

3’-PSCA2VH-B

GCT GTC GCT GGG GTC GAT CCT GCC YAT CCA TTC CAG GCC CYT GCC GGG CSY CTG TTK CAC CCA GTT CAG CCA GTA GTT GGT GAA GGT GTA GCC(SEQ ID NO.456)

5’-PSCA2VH-C

AGG ATC GAC CCC AGC GAC AGC GAG ATC CAC TAC GAC CAG AAG TTC AAG GAC ARA GYC ACC MTA ACC GYG GAC AMG AGC ACC RRC ACC GCC TAC (SEQ ID NO.457)

3’-PSCA2VH-D

GGC CAG GGC GCA ATA GTA CAC GGC GGT GTC CTC GCT TST CAG GCT GGA CAG CTS SAT GTA GGC GGT GYY GGT GCT C(SEQ ID NO.458)

3’-PSCA2VH-E-BSTE2

AGA CAC GGT GAC CGT GGT GCC CTG GCC CCA GTA GGC CAT GGC GTA GAT GCC GGT CAG GGC GCA ATA GTA CAC(SEQ ID NO.459)

这些引物组中的每一个都跨越了相应的整个VH序列。

在每一组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VH PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VH大约为350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。

选择人抗体种系VL序列VkII A1(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.409)、CDRL2(SEQ ID NO.410)和CDRL3(SEQ ID NO.411)的骨架背景。类似地，选择人抗体种系VL序列VkII A19(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.395)、CDRL2(SEQ ID NO.396)和CDRL3(SEQ ID NO.397)的骨架背景。对于每种人VL，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几个简并的寡核苷酸。为此目的，每个第二引物均是反义引物。删除寡核苷酸中稍后克隆所需的限制性位点。对于VkII A1，使用如下寡核苷酸：

5’P3-VL-A-SacI

CCT GTA GAG CTC GTC ATG ACC CAG TCC CCC CTG TCC CTG MSC GTG ACC MTC GGC CAG CCA GCC AGC ATC(SEQ ID NO.460)

3’P3-VL-B

CCA GTT CAG GTA GGT CTT GCC GTC GCT GTC CAG CAG GGA CTG GCT GGA CTT GCA AGA GAT GCT GGC TGG CTG GCC(SEQ ID NO.461)

5’P3-VL-C

AAG ACC TAC CTG AAC TGG YTS CWG CAG AGG CCA GGC CAG AGC CCC ARG AGG CTG ATC TAC CTG GTG TCC ACC CTG(SEQ ID NO.462)

3’P3-VL-D

GGT GAA GTC GGT GCC GGA GCC GCT GCC GGA GAA TCT GTC TGG CAC GCC GCT GTC CAG GGT GGA CAC CAG GTA(SEQ ID NO.463)

5’P3-VL-E

TCC GGC ACC GAC TTC ACC CTG AAG ATC AGC AGG GTG GAG GCC GAG GAC STG GGC GTG TAC TAC TGC TGG CAG GGC ACC(SEQ ID NO.464)

3’P3-VL-F-BsiWI/SpeI

CCA GAC ACT AGT CGT ACG CTT GAT TTC CAG CTT GGT CCC TCC GCC GAA GGT CCT TGG GAA GTG GGT GCC CTG CCA GCA GTA(SEQ ID NO.465)

对于VkII A19，寡核苷酸如下：

5’-PSCA2VL-a-SAC1

CAG ACA GAG CTC GTG ATG ACC CAG KCA SCT CYA AGC STG CCA GTG ACC CCA GGC GAG YCA GYG TCC ATC AGC TGC AGG TCC AGC (SEQ ID NO.466)

3’-PSCA2VL-b

CTG GGG GCT CTG GCC TGG CYT CTG CAG AWA CCA GTA CAG GTA GGT GTT GCC GTT GCT GTG CAG CAG GCT CTT GCT GGA CCT GCA GCT GAT G(SEQ ID NO.467)

5’-PSCA2VL-c

CCA GGC CAG AGC CCC CAG CTG CTG ATC TAC AGG ATG AGC AAC CTG GCT AGC GGC GTG CCA GAC AGA TTC AGC GGC AGC GGC TCT GGA ACC(SEQ ID NO.468)

3’-PSCA2VL-d

CAG GCA GTA GTA CAC GCC CAC GTC CTC GGC CTC CAC CCT GCT GAT CYT CAG GGT GAA GKC GGT TCC AGA GCC GCT GCC(SEQ ID NO.469)

3’-PSCA2VL-e-BsiW1-Spe1

GTG CTG ACT AGT CGT ACG CTT GAT TTC CAG CTT GGT CCC TTG GCC GAA GGT GTA GGG GTA TTC CAG GTG CTG CAG GCA GTA GTA CAC GCC(SEQ ID NO.470)

这些引物组中的每一个都跨越了相应的整个VL序列。

在每一组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VL PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VL大约为330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。

然后，在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中将最终的基于VH1 1-f(P3)的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkII A1的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合，最终的基于VH1 1-f(PSCA2)的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkII A19的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合以形成功能scFv的两种不同文库，如下所述在丝状噬菌体上展示后从所述文库选择、筛选、鉴定和证实抗PSCA结合子：

将450ng轻链片段(用SacI-SpeI消化)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(用SacI-SpeI消化；大片段)连接。随后将所得的组合抗体文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm，Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，得到多于10⁷独立克隆的文库大小。1小时表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化子。随后离心收集细胞并使用商购的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。

将2800ng包含VL文库(用XhoI-BstEII消化；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(用XhoI-BstEII消化)连接并再次通过电穿孔(2.5kV，0.2间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)转化到两个300ul等分试样的电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，获得多于10⁷独立克隆的VH-VL scFv(单链可变片段)的总文库大小。

表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50ug/mL)选择培养基中。随后用感染剂量的10¹²个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含所述抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中噬菌体粒子包含编码scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体库用于选择抗原结合分子。

出于此目的，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集荷载所克隆的scFv库的噬菌体文库。将大约10¹¹-10¹²个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1％BSA中并在冰上缓慢搅动的同时与10⁵-10⁷个转染有PSCA的CHO细胞(参见实施例24.1)温育1小时。这些转染PSCA的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)中。利用PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)通过共达五次的洗涤步骤除去不特异性地与转染PSCA的CHO细胞结合的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在PH 2.2的HCl-甘氨酸中(温育10min，随后涡旋)而从细胞洗脱结合分子，并且在用pH 12的2M Tris中和后，利用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1 Blue培养物(OD600＞0.5)。包含成功转导有编码人/人源化scFv片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再次选择羧苄青霉素抗性并随后用VCMS 13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4-5轮选择。

为了筛选PSCA特异性结合子，在选择后，从大肠杆菌培养物中分离对应于4和5轮淘洗的质粒DNA。为了产生可溶性scFv蛋白，从所述质粒切除VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI)。通过相同的限制性位点将这些片段克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(例如scFv)在scFv和His6标签之间包含Flag标签(DYKDDDDK)并且额外的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，将每个质粒DNA库(不同淘洗轮次)转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1或XL1 blue中并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(50μg/ml)中。

在切除基因III片段并使用1mM的IPTG诱导后，转化有含有VL和VH区段的pComb3H5BHis的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv链被输出到周质中并在此折叠成功能构象。

挑取来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落用于周质小量制备，并在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中生长，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。通过在-70℃下冷冻和在37℃下解冻的四个循环后，细菌的外层膜被温度休克毁坏，而使包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗PSCA scFv的上清液并按照以下用于PSCA特异性结合子的鉴定：

通过流式细胞术在转染有PSCA的CHO细胞上检测scFv与PSCA的结合；使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

对于流式细胞术，将2.5×10⁵个细胞与50ul的scFv周质制品或与含有5μg/ml纯化的scFv和2％FCS的50μl PBS一起温育。用含2μg/ml抗His抗体(5His抗体，无BSA，Qiagen GmbH，Hilden，FRG)和2％FCS的50μl PBS检测scFv的结合。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Dianova，Hamburg，FRG)作为第二步试剂。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。

随后分析单个克隆的有利特征和氨基酸序列。通过将PSCA特异性scFv经由Gly₄Ser₁-连接子与CD3特异性scFv I2C(SEQ ID NO.185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv连接以产生例如结构域排列为VH_PSCA-(Gly₄Ser₁)₃-VL_PSCA-Gly₄Ser₁-VH_CD3-(Gly₄Ser₁)₃-VL_CD3或VL_PSCA-(Gly₄Ser₁)₃-VH_PSCA-Gly₄Ser₁-VH_CD3-(Gly₄Ser₁)₃-VL_CD3或可选的结构域排列的构建体，从而将PSCA特异性scFv转变为重组双特异性单链抗体。对于在CHO细胞中表达，将(i)包含嵌入Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)终止密码子前的C-末端His₆标签的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性单链抗体的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。按照描述(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，向培养物上清液分泌双特异性单链抗体的DHFR阳性转染子的选择，以及使用甲氨蝶呤的基因扩增以增加表达水平。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方法进行(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。

通过所转染的CHO细胞的培养物上清液的流式细胞术分析进行功能性双特异性单链抗体构建体的鉴定。为此目的，检测人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)上和猕猴T细胞系4119LnPx上的CD3结合。在转染PSCA的CHO细胞上检测与肿瘤特异性PSCA表位的结合(参见实施例24.1)。各细胞系的200000个细胞与50μl细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并用鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μlPBS中)检测结合的双特异性单链抗体构建体。洗涤后，用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。

流式细胞术在FACS-Calibur仪器上进行，并使用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测量。

只选择对人和猕猴CD3以及对人和猕猴PSCA显示双特异性结合的构建体用于进一步应用。

为了产生蛋白，将表达完全功能性双特异性单链抗体并适于无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1％Pluronic F-68；HyClone)的CHO细胞在具有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1％Pluronic F-68；HyClone)的滚瓶中培养7天。通过离心去除培养物上清液的细胞并储存在-20℃直到纯化。使用 Explorer系统(GE Health Systems)和Unicorn软件作为从培养物上清液纯化双特异性单链抗体的色谱设备。根据制造商提供的方案，使用荷载有ZnCl₂的Fractogel EMD chelate(Merck)进行固定化金属亲和色谱(“IMAC”)。用缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2，0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/分钟的流速施加到柱(10ml)上。用缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2，0.1M NaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：

步骤1：6柱体积的20％缓冲液B

步骤2：6柱体积的100％缓冲液B

收集步骤2的洗脱的蛋白级分用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。

在用平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐，200mM赖氨酸，5％甘油，pH 7.2)平衡的HiLoad 16/60Superdex 200制备级柱(GE/Amersham)上进行凝胶过滤色谱。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/分钟)经过标准SDS-PAGE和蛋白质印迹进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标准物试剂盒，Sigma MW GF-200)。使用OD280nm测定蛋白浓度。

在还原性条件下通过使用4-12％的预制Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行的SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白。根据制造商提供的方案，进行样品制备和施加。用MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。用胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定所分离的蛋白的纯度为＞95％。

如PBS中的凝胶过滤所确定的，所述双特异性单链抗体在天然条件下的分子量为约52kDa。根据该方法纯化所有构建体。

根据制造商提供的方案，使用Optitran BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行蛋白质印迹。为了检测所述双特异性单链抗体蛋白抗体，使用了抗His标签抗体(5His，Qiagen)。使用碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体作为二抗，BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于所纯化的双特异性单链抗体的单个条带。

使用转染有PSCA的CHO细胞作为靶细胞并使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，通过基于铬51(⁵¹Cr)释放的细胞毒性试验测定双特异性单链抗体在人和非黑猩猩灵长类系统中与人和猕猴CD3以及与人和猕猴PSCA相互作用的能力。

按照下述产生受刺激的人PBMC：

用终浓度为1μg/ml的商购抗CD3特异性抗体(如，OKT3，Othoclone)在37℃包被培养皿(85mm直径，Nunc)1小时。通过用PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方法，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人血液)分离新鲜的PBMC。将3×10⁷-5×10⁷个PBMC加入到含稳定谷氨酰胺/10％FCS/IL-2 20U/ml(阿地白介素，Chiron)的50ml RPMI 1640的预包被培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并用RPMI 1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。

靶细胞用PBS洗涤两次并用含有11.1MBq ⁵¹Cr和50％FCS的终体积为100μl的RPMI在37℃标记45分钟。随后用5ml RPMI洗涤标记的靶细胞3次并随后用于细胞毒性试验。在含总体积为250μl的补充RPMI(如上)的96孔板中进行实验，E∶T比为10∶1。采用1μg/ml的种间特异性双特异性单链抗体分子及其20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且以上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入曲拉通-X)和自发裂解(没有效应细胞)的差异的相对值计算细胞毒性。所有计算均一式四份。利用Wizard 3″γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH，德国)进行上清液中的铬活性的计算。利用Windows的Prism 4(版本4.02，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行试验数据的分析。如软件所测定的，S形剂量响应曲线通常的R²值＞0.90。通过分析程序计算EC₅₀值作为效能量度。

25.CD19和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生和表征

25.1.人CD19抗原在CHO细胞上的克隆和表达

使用人CD19抗原的序列(NM_001770人CD19分子(CD19)，mRNA，国际生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，根据标准方法通过基因合成获得合成分子。所述基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和DNA始端和末端的限制性位点。在向命名为pEFDHFR的表达质粒中克隆的步骤中使用所引入的5’末端的EcoRI和3’末端的SalI的限制性位点(Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)。在序列验证后，按照下述使用所述质粒转染CHO/dhfr细胞。利用序列经过证明的质粒转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL 9096，细胞在37℃、95％湿度和7％CO₂的培养箱中在含有稳定的谷氨酰胺的RPMI 1640(从Biochrom AG Berlin，德国获得)中培养，其中所述RPMI 1640中补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素(均从Biochrom AG Berlin，德国获得)和来自细胞培养级试剂储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)，且所述核苷的终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷)。根据制造商的说明，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后用PBS洗涤细胞一次并再次培养在除了没有补充核苷和FCS外与上述相同的细胞培养基(从Biochrom AG Berlin，德国获得)中。因此，细胞培养基不含核苷并由此对经转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到抗性细胞的生长。再过7-14天后通过FACS试验检测转染子对构建体的阳性表达。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

25.2.CD19和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生

通常，如下表8中所列，设计均包含具有对人和猕猴CD3抗原的结合特异性的结构域以及具有对人CD19的结合特异性的结构域的各个双特异性抗体分子：

表8：抗CD3和抗CD19种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

通过基因合成获得包含人CD19特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域以及人和猕猴CD3的种间特异性CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSPxCD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段并进行真核蛋白表达。

25.3.所述双特异性单链抗体分子的表达和纯化

按照本文以上关于MCSPxCD3双特异性单链抗体的描述，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞中表达所述双特异性单链抗体分子。

所表达的双特异性单链抗体的分离和分析也在上文实施例9中有描述。

25.4.CD19和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体的分别对人CD19以及对人和猕猴CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。出于此目的，使用如实施例25.1所述的转染有人CD19的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)测定与人抗原的结合。通过使用猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Erlangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；Knappe A等，和Fickenscher H：Herpesvirus saimiri-transformed macaque T cells are tolerated and do not cause lymphoma after autologous reinfusion.Blood 2000；95：3256-61)测定与猕猴CD3的结合反应性。各细胞群的200000个细胞与50μl种间特异性双特异性抗体构建体的纯化蛋白(如，2μg/ml)在冰上温育30分钟。或者，使用瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液。使用PBS洗涤细胞两次，并利用未标记的鼠5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。使用新鲜的培养基作为阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

在图50所示的FACS分析中，所有测定的构建体都显示与人和猕猴CD3以及与CD19的结合。

25.5.CD19和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例25.1所述的CD19阳性细胞系通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析双特异性单链抗体的生物活性。使用受刺激的人CD8阳性T细胞或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。

受刺激的人PBMC的产生描述在上文实施例11中。

制备靶细胞，并进行类似于实施例11中描述的MCSPxCD3双特异性单链抗体的过程的试验。

在图51所示的T细胞细胞毒性试验中，所测定的所有双特异性单链抗体构建体都显示由人CD8+细胞引发的针对人CD19阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对人CD19阳性靶细胞的细胞毒活性。使用无关的双特异性单链抗体作为阴性对照。

25.6.额外的CD19和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

选择人抗体种系VH序列VH1 1-46(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID NO.473)、CDRH2(SEQ ID NO.474)和CDRH3(SEQ ID NO.475)的骨架背景。对于所述人VH，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物均是反义引物。对于VH1 1-46，使用如下寡核苷酸(5’至3’)：

5’-37VH-aXho1

CAG CTG CTC GAG TCT GGG GCT GAG STG RWG ARG CCT GGG KCC TCA GTG AAG RTT TCC TGC AAG GCT TCT GGC(SEQ ID NO 763)

3’-37VH -b

cca ctc aag acc ctg tcc agg GSS ctg cYt cac cca gtt cat cca gta gct aGw gaa tgY ata gcc aga agc ctt gca gga(SEQ ID NO 764)

5’-37VH-c

GGA CAG GGT CTT GAG TGG ATK GGA CAG ATT TGG CCT GGA GAT GGT GAT ACT AAC TAC AAT GGA AAG TTC AAG(SEQ ID NO 765)

3’-37VH -d

cag gct gct gag ttS cat gta gRc tgt gct ggt gga tKY gtc ASS agt caK agt gRc tYt acc ctt gaa ctt tcc att gta g(SEQ ID NO 766)

5’-37VH -e

C ATG SAA CTC AGC AGC CTG SSA TCT GAG GAC ACT GCG GTC TAT TWC TGT GCA AGA CGG GAG ACT ACG ACG G(SEQ ID NO 767)

3’-37VH-fBstE2

gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca gta gtc cat agc ata gta ata acg gcc tac cgt cgt agt ctc ccg tct tgc(SEQ ID NO 768)

该引物组跨越了相应的整介VH序列。

在所述引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VH PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VH大约为350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。

选择人抗体种系VL序列VkI O12(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.478)、CDRL2(SEQ ID NO.479)和CDRL3(SEQ ID NO.480)的骨架背景。对于所述人VL，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。删除寡核苷酸中稍后克隆所需的限制性位点。对于VkI O12，使用如下寡核苷酸(5’至3’)：

5’-37VL-A-SacI

GAG CTG GAG GTC GAG ATG ACC GAG TCT CCA KCT TCT TTG KCT GYG TGT STA GGG SAS AGA GYC ACC ATC WCC TGC AAG GCC AGC(SEQ ID NO 769)

3’-37VL-B

ctg ttg gta cca gtt caa ata aSt SNN acc atc ata atc aac act ttg gct ggc ctt gca ggt gat ggt(SEQ ID NO 770)

5’-37VL-C

TTG AAC TGG TAC CAA CAG AWA CCA GGA MAG SCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GAT GCA TCC AAT CTA GTT TCT(SEQ ID NO 771)

3’-37VL-D

gag ggt gaa gtc tgt ccc aga ccc act gcc act aaa cct ggR tgg gaY ccc aga aac tag att gga tgc(SEQ ID NO 772)

5’-37VL-E

GGG ACA GAC TTC ACC CTC AMC ATC MRT YCT STG SAG MMG GWG GAT KYC GCA ACC TAT YAC TGT CAG CAA AGT ACT GAG(SEQ ID NO 773)

3’-37VL-F-BsiW1Spe1

ACT CAG ACT AGT CGT ACG ttt gat ctc cac ctt ggt ccc ttg acc gaa cgt cca cgg atc ctc agt act ttg ctg aca g(SEQ ID NO 774)

该引物组跨越了相应的整个VL序列。

在所述引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VL PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VL大约为330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。

然后，在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中将最终的基于VH1 1-46的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkI O12的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合，以形成功能scFv的文库，如下所述在丝状噬菌体上展示后从所述文库选择、筛选、鉴定和证实抗CD19结合子。

将450ng轻链片段(用SacI-SpeI消化)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(用SacI-SpeI消化；大片段)连接。随后将所得的组合抗体文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm，Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，得到多于10⁷独立克隆的文库大小。1小时表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化子。随后离心收集细胞并使用商购的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。

将2800ng包含VL文库(用XhoI-BstEII消化；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(用XhoI-BstEII消化)连接并再次通过电穿孔(2.5kV，0.2间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)转化到两个300ul等分试样的电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，获得多于10⁷独立克隆的scFv(单链可变片段)的总文库大小。

表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(含50ug/mL羧苄青霉素的SB)选择培养基中。随后用感染剂量的10¹²个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含所述抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中各噬菌体粒子包含编码scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体库用于选择抗原结合分子。

出于此目的，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集荷载所克隆的scFv库的噬菌体文库。将大约10¹¹-10¹²个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1％BSA中并在冰上缓慢搅动的同时与10⁵-10⁷个转染有CD19的CHO细胞(参见实施例1)温育1小时。这些转染CD19的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)中。利用PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)通过共达五次的洗涤步骤除去不特异性地与转染CD19的CHO细胞结合的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在PH 2.2的HCl-甘氨酸中(温育10分钟，随后涡旋)而从细胞洗脱结合分子，并且在用pH 12的2M Tris中和后，利用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1 Blue培养物(OD600＞0.5)。包含成功转导有编码人/人源化scFv片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再次选择羧苄青霉素抗性并随后用VCMS 13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4-5轮选择。

为了筛选CD19特异性结合子，在选择后，从大肠杆菌培养物中分离对应于4和5轮淘洗的质粒DNA。为了产生可溶性scFv蛋白，从所述质粒切除scFv-DNA片段(XhoI-SpeI)。通过相同的限制性位点将这些片段克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(即scFv)在其C-末端His6标签之前包含Flag标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO 775)并且噬菌体蛋白III/N2结构域和蛋白III/CT结构域被删除。在连接之后，将每个质粒DNA库(不同淘洗轮次)转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1或XL1 blue中并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(含50μg/ml羧苄青霉素的LB)中。

在用1mM IPTG诱导后，转化有含有scFv-DNA片段的pComb3H5BFlag/His的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv蛋白。由于适合的信号序列，所述scFv被输出到周质中并在此折叠成功能构象。挑取来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落用于周质小量制备，并在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中培养，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。施加在-70℃冷冻和在37℃解冻的四个循环的温度休克，借此毁坏细菌的外层膜，并使包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗CD19scFv的上清液并按照以下用于CD19特异性结合子的鉴定。

通过流式细胞术在转染有CD19的CHO细胞上检测scFv与CD19的结合；使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

对于流式细胞术，将2.5×10⁵个细胞与50ul的scFv周质制品或与含有5μg/ml纯化的scFv和2％FCS的50μl PBS一起温育。用含2μg/ml抗His抗体(5His抗体，无BSA，Qiagen GmbH，Hilden，FRG)和2％FCS的50μl PBS检测scFv的结合。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Dianova，Hamburg，FRG)作为第二步试剂。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。

随后分析单个克隆的有利特征和氨基酸序列。通过将CD19特异性scFv经由Gly₄Ser₁-连接子与CD3特异性scFv I2C(SEQ ID NO.185，核酸序列SEQ ID NO.186)或本发明的任何其它CD3特异性scFv连接以产生例如结构域排列为VLCD19-(Gly4Ser1)3-VHCD19-Gly4Ser1-VHCD3-(Gly4Ser1)3-VLCD3的构建体，从而将CD19特异性scFv转变为重组双特异性单链抗体。对于在CHO细胞中表达，将(i)包含嵌入Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)终止密码子前的C-末端His₆标签的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性单链抗体的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。按照实施例25.2和25.3的描述进行所产生的表达质粒的转染，蛋白表达和种间特异性双特异性抗体构建体的纯化。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方法进行(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。

通过表达所述种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的培养物上清液的流式细胞术分析进行功能性双特异性单链抗体构建体的鉴定。按照实施例25.4的描述进行分析。

只选择对人和猕猴CD3以及对CD19显示双特异性结合的构建体用于进一步应用。

按照实施例25.5的描述，对由效应T细胞引发的种间特异性双特异性单链抗体构建体针对CD19阳性靶细胞的细胞毒活性进行分析。使用转染有CD19的CHO细胞作为靶细胞，受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。选择对CD19阳性靶细胞显示有效的再针对T细胞的细胞毒性的构建体用于进一步应用。

26.C-MET和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生和表征

26.1 表达人C-MET的CHO细胞的产生

根据标准方法通过基因合成获得如GenBank(登录号NM_000245)公开的人C-MET的编码序列。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是人C-MET蛋白的编码序列和终止密码子(所述构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.776和777)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。通过所述基因合成片段中编码序列的沉默突变除去内部的限制性位点(SalI：第366位核苷酸，从C至G；EcoRI和XbaI，第2059-2061位核苷酸，从TCT至AGC；EcoRI：第2304位核苷酸，从T至C)。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

26.2 表达猕猴C-MET的CHO细胞的产生

通过一组5个PCR由根据标准方法从猕猴肝脏制备的cDNA获得猕猴C-MET(食蟹猴)的cDNA序列。使用如下反应条件：94℃2分钟的1个循环，然后是94℃1分钟、56℃1分钟和72℃3分钟的40个循环，接着是72℃3分钟的最后循环，并使用以下引物：

4.正向引物：5’-aggaattcaccatgaaggcccccgctgtgcttgcacc-3’(SEQ ID NO：778)

反向引物：5’-ctccagaggcatttccatgtagg-3’(SEQ ID NO：779)

5.正向引物：5’-gtccaaagggaaactctagatgc-3’(SEQ ID NO：780)

反向引物：5’-ggagacactggatgggagtccagg-3’(SEQ ID NO：781)

6.正向引物：5’-catcagagggtcgcttcatgcagg-3’(SEQ ID NO：782)

反向引物：5’-gctttggttttcagggggagttgc-3’(SEQ ID NO：783)

7.正向引物：5’-atccaaccaaatcttttattagtggtgg-3’(SEQ ID NO：784)

反向引物：5’-gacttcattgaaatgcacaatcagg-3’(SEQ ID NO：785)

8.正向引物：5’-tgctctaaatccagagctggtcc-3’(SEQ ID NO：786)

反向引物：5’-gtcagataagaaattccttagaatcc-3’(SEQ ID NO：787)

该PCR产生5个重叠的片段，对其进行分离并使用PCR引物根据标准方法进行测序，由此产生了编码猕猴C-MET(从前导肽的第10位密码子至所述成熟蛋白的最后密码子)的cDNA序列。为了产生用于表达猕猴C-MET的构建体，根据标准方法通过基因合成获得cDNA片段(所述构建体的cDNA序列和氨基酸序列列于SEQ ID NO：788和789)。在该构建体中，终止密码子前的猕猴C-MET编码序列(从前导肽的第10位氨基酸至所述成熟蛋白的最后一个氨基酸)符合读框地与人C-MET蛋白的1-9个氨基酸的引导肽编码序列融合。基因合成片段也设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点和位于含所述cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。通过所述基因合成片段中编码序列的沉默突变除去内部的限制性位点(SalI：第366位核苷酸，从C至G；EcoRI和XbaI，第2059-2061位核苷酸，从TCT至AGC；EcoRI：第2304位核苷酸，从T至C)。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

26.3 C-MET和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表9中所列，设计均包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性的结构域以及具有对C-MET的结合特异性的结构域的各个双特异性抗体分子：

表9：抗C-MET和抗CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

通过基因合成获得包含C-MET特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域以及人和猕猴CD3的种间特异性CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSPxCD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段并进行真核蛋白表达。按照本文以上关于MCSPxCD3双特异性单链抗体的描述，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞中表达所述双特异性单链抗体分子。

所表达的双特异性单链抗体的分离和分析也在上文实施例9中有描述。

如图55中所示，所产生的所有种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由猕猴T细胞系4119LnPx引发的对猕猴cMET阳性靶细胞的细胞毒活性。

26.5 C-MET和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测所述种间特异性双特异性抗体构建体的分别对C-MET以及人和猕猴CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。出于此目的，使用人C-MET阳性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC No.HTB-26)和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)测定与人抗原的结合。通过使用猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Erlangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；Knappe A等，公开于Knappe A，等，和Fickenscher H.，Blood 2000，95，3256-61)测定与猕猴CD3的结合反应性。各细胞系的200000个细胞与50μl表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。使用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并利用鼠抗5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的细胞的上清液用作阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图52所示，可清楚地检测到对C-MET特异性的且对人和非黑猩猩灵长类CD3具有种间特异性以上所列单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和C-MET的结合。这证明了对人和猕猴CD3特异性抗体的种间特异性。

26.6 C-MET和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用MDA-MB-231细胞系通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。使用受刺激的去除CD4/CD56的人PBMC作为效应细胞。

受刺激的人PBMC的产生在上文实施例11中有描述。制备靶细胞，并进行类似于实施例11中描述的MCSPxCD3双特异性单链抗体的过程的测定。

如图53中所示，所产生的所有种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的消除CD4/CD56的人PBMC引发的对cMET阳性靶细胞的细胞毒活性。

26.7 另外的C-MET和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

选择人抗体种系VH序列VH1 1-03(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID NO.821)、CDRH2(SEQ ID NO.822)和CDRH3(SEQ ID NO.823)的骨架背景。同样，选择人抗体种系VH序列VH1 1-46(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID NO.836)、CDRH2(SEQ ID NO.837)和CDRH3(SEQ ID NO.838)的骨架背景。对于各人VH，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。对于VH1 1-03，使用如下寡核苷酸：

5’CM1-VH-A-XhoI(SEQ ID NO：790)

CCA TGT CTC GAG TCT GGG SCT GAA STG RWG ARG CCT GGG GCT TCA GTG AAA RTG TCC TGC ARG GCT TCG GGC TAT ACC TTC

3’CM1-VH-B(SEQ ID NO：791)

AT CCA CTC AAG CCY TTG TCC AGG CSY CTG TYT AAC CCA GTG CAA CCA GTA GCT GGT GAA GGT ATA GCC CGA AGC

5’CM1-VH-C(SEQ ID NO：792)

GG CTT GAG TGG ATK GGC ATG ATT GAT CCT TCC AAT AGT GAC ACT AGG TTT AAT CCG AAC TTC AAG GAC

3’CM1-VH-D(SEQ ID NO：793)

GCT GCT GAG CWS CAT GTA GGC TGT GYT GGM AGA TST GTC TMY AKT SAW TGT GRC CYT GTC CTT GAA GTT CGG ATT

5’CM1-VH-E(SEQ ID NO：794)

GCC TAC ATG SWA CTC AGC AGC CTG ASA TCT GMG GAC ACT GCA GTC TAT TAC TGT GCC ASA TAT GGT AGC TAC GTT

3’CM1-VH-F-BstEII(SEQ ID NO：795)

CAT GTA GGT GAC CGA GGT TCC TTG ACC CCA GTA GTC CAG AGG GGAAAC GTA GCT ACC ATA

对于VH1 1-46，使用以下寡核苷酸：

5’CM3-VH-A-XhoI(SEQ ID NO：796)

CCA TGT CTC GAG TCT GGG RCT GAA STG RWG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG STG TCC TGC AAG GCT TCT

3’CM3-VH-B(SEQ ID NO：797)

CTC AAG GCC TTG TCC AGG CSY CTG CYT CAC CCA GTG TAT CCA GTA ACT GGT GAA GGT GTA GCC AGA AGC CTT GCA GGA

5’CM3-VH-C(SEQ ID NO：798)

CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATK GGA GAG ATT AAT CCT AGC AGC GGT CGT ACTA AC TAC AAC GAG AAA TTC

3’CM3-VH-D(SEQ ID NO：799)

C TGT GGA GGT AGA TKT GTC TMY AGT CAY TGT GAC CYT GTT CTT GAA TTT CTC GTT GTA GTT

5’CM3-VH-E(SEQ ID NO：800)

A TCT ACC TCC ACA GYC TAC ATG SAA CTC AGC ARC CTG ASA TCT GAG GAC ACT GCG GTC TAT TAC TGT GCA

3’CM3-VH-F-BstEII(SEQ ID NO：801)

CAT GTA GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GCC CCT WCT TGC ACA GTA ATA GAC CGC

这些引物组中的每一个都跨越了相应的整个VH序列。

在各引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各VH PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VH大约为350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。

选择人抗体种系VL序列VkII O11(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.816)、CDRL2(SEQ ID NO.817)和CDRL3(SEQ ID NO.818)的骨架背景。同样，选择人抗体种系VL序列VkII A1(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.833)、CDRL2(SEQ ID NO.834)和CDRL3(SEQ ID NO.835)的骨架背景。对于各人VL，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。删除寡核苷酸中稍后克隆所需的限制性位点。对于VkII O11，使用以下寡核苷酸：

5’CM1-VL-A-SacI(SEQ ID NO：802)

CCT GTA GAG CTC GTG ATG ACC CAG ACT CCA YYC TCC CTA MCT GTG ACA SYT GGA GAG MMG GYT TCT RTC AGC TGC AAG TCC AGT

3’CM1-VL-B(SEQ ID NO：803)

GTA CCA GGC CAA GTA GTT CTT CTG ACT GCT AGT ATA TAA AAG GGA CTG ACT GGA CTT GCA GCT GA

5’CM1-VL-C(SEQ ID NO：804)

TAC TTG GCC TGG TAC CWG CAG AAA CCA GGT CAG TCT CCT MAA CTG CTG ATT TAC TGG GCA TCC ACT AGG

3’CM1-VL-D(SEQ ID NO：805)

GAG AGT GAA ATC TGT CCC AGA TCC ACT GCC TGA GAA GCG ATC AGG GAC CCC AGA TTC CC TAGT GGA TGC CCA GTA

5’CM1-VL-E(SEQ ID NO：806)

ACA GAT TTC ACT CTC AMA ATC TCC AGW GTG RAG GCT GAS GAC STG GSA GTT TAT TAC TGT CAG CAA TAT

3’CM1-VL-F-BsiWI/SpeI(SEQ ID NO：807)

CCT CAG ACT AGT CGT ACG TTT GAT CTC CAA CTT TGT GCC TCC ACC GAA CGT CCA CGG ATA GGC ATA ATA TTG CTG ACA GTA ATA

对于VkIIA1，使用以下寡核苷酸：

5’CM3-VL-A-SacI(SEQ ID NO：808)

CCT GTA GAG CTC GTG ATG ACC CAA TCT CCA SYT TCT TTG SCT GTG ACT CTA GGG CAG CSG GCC TCC ATC TCC TGC

3’CM3-VL-Ba(SEQ ID NO：809)

GAA CCA ACT CAT ATA ACT ACC ACC ATC ATAATC AAC ACT TTG GCT GGC CTT GCA GGA GAT GGA GGC

3’CM3-VL-Bb(SEQ ID NO：810)

GAA CCA ACT CAT ATA ACT ACC ACC ATC ATA ATC AAC ACT AGA TTG GCT GGC CTT GCA GGA GAT GGA GGC

5’CM3-VL-C(SEQ ID NO：811)

AGT TAT ATG AGT TGG TTC CAA CAG AGA CCA GGA CAG YCA CCC ARA CKC CTC ATC TMT GCT GCA TCC AAT CTA

3’CM3-VL-D(SEQ ID NO：812)

GGT GAA GTC TGT CCC AGA GCC ACT GCC ACT AAA CCT GKC TGG GAY CCC AGA TTC TAG ATT GGA TGC AGC

5’CM3-VL-E(SEQ ID NO：813)

TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAK ATC YMT CST GTG GAG GMG GAG GAT GTT GSA RYC TAT TACT GT CAG CAA AGT

3’CM3-VL-F-BsiWI/SpeI(SEQ ID NO：814)

CCT CAG ACT AGT CGT ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC CTG ACC GAA CGT GAG CGG ATC CTC ATA ACT TTG CTG ACA GTA ATA

这些引物组中的每一个都跨越了相应的整个VL序列。

在各引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各VL PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VL大约为330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。

然后，在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中将最终的基于VH1 1-03的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkII O11的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合，最终的基于VH1 1-46的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkII A1的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合以形成功能scFv的两种不同文库，如下所述在丝状噬菌体上展示后从所述文库选择、筛选、鉴定和证实抗PSCA结合子。

将450ng轻链片段(用SacI-SpeI消化)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(用SacI-SpeI消化；大片段)连接。随后将所得的组合抗体文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm，Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，得到多于10⁷独立克隆的文库大小。1小时表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化子。随后离心收集细胞并使用商购的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。

将2800ng包含VL文库(用XhoI-BstEII消化；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(用XhoI-BstEII消化)连接并再次通过电穿孔(2.5kV，0.2间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)转化到两个300ul等分试样的电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，获得多于10⁷独立克隆的VH-VL scFv(单链可变片段)的总文库大小。

表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(含50ug/mL羧苄青霉素的SB)选择培养基中。随后用感染剂量的10¹²个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含所述抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中各噬菌体粒子包含编码scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体库用于选择抗原结合分子。

出于此目的，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集荷载所克隆的scFv库的噬菌体文库。将大约10¹¹-10¹²个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1％BSA中并在冰上缓慢搅动的同时与10⁵-10⁷个转染有C-MET的CHO细胞(参见实施例26.1)温育1小时。这些转染C-MET的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)中。利用PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)通过共达五次的洗涤步骤除去不特异性地与转染C-MET的CHO细胞结合的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在PH 2.2的HCl-甘氨酸中(温育10min，随后涡旋)而从细胞洗脱结合分子，并且在用pH 12的2M Tris中和后，利用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1 Blue培养物(OD600＞0.5)。包含成功转导有编码人/人源化scFv片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再次选择羧苄青霉素抗性并随后用VCMS 13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4-5轮选择。

为了筛选C-MET特异性结合子，在选择后，从大肠杆菌培养物中分离对应于4和5轮淘洗的质粒DNA。为了产生可溶性scFv蛋白，从所述质粒切除VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI)。通过相同的限制性位点将这些片段克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(例如scFv)在scFv和His6标签之间包含Flag标签(DYKDDDDK)并且额外的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，将每个质粒DNA库(不同淘洗轮次)转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1或XL1 blue中并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(含50μg/ml羧苄青霉素的LB)中。

在切除基因III片段并使用1mM的IPTG诱导后，转染有含有VL和VH区段的pComb3H5BHis的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv被输出到周质中并在此折叠成功能构象。

挑取来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落用于周质小量制备，并培养在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。施加在-70℃冷冻和在37℃解冻的四个循环的温度休克，借此毁坏细菌的外层膜，并使包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗C-MET scFv的上清液并按照以下用于C-MET特异性结合子的鉴定。

通过流式细胞术在转染有C-MET的CHO细胞上检测scFv与C-MET的结合(参见实施例247.1)；使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

对于流式细胞术，将2.5×10⁵个细胞与50ul的scFv周质制品或与含有5μg/ml纯化的scFv和2％FCS的50μl PBS一起温育。用含2μg/ml抗His抗体(5His抗体，无BSA，Qiagen GmbH，Hilden，FRG)和2％FCS的50μl PBS检测scFv的结合。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Dianova，Hamburg，FRG)作为第二步试剂。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。

随后分析单个克隆的有利特征和氨基酸序列。通过将C-MET特异性scFv经由Gly₄Ser₁-连接子与CD3特异性scFv I2C(SEQ ID NO.185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv连接以产生结构域排列为VH_C-MET-(Gly₄Ser₁)₃-VL_C-MET-Ser₁Gly₄Ser₁-VH_CD3-(Gly₄Ser₁)₃-VL_CD3或可选的结构域排列的构建体，从而将C-MET特异性scFv转变为重组双特异性单链抗体。对于在CHO细胞中表达，将(i)包含嵌入Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)终止密码子前的C-末端His₆标签的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性单链抗体的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。按照实施例26.3和26.4的描述进行所产生的表达质粒的转染，蛋白表达和种间特异性双特异性抗体构建体的纯化。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方法进行(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。

通过表达所述种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的培养物上清液的流式细胞术分析进行功能性双特异性单链抗体构建体的鉴定。除了使用实施例26.1和26.2描述的转染C-MET的CHO细胞外，按照实施例26.5的描述进行分析。

只选择对人和猕猴CD3以及对C-MET显示双特异性结合的构建体用于进一步应用。

按照实施例26.6的描述分析由效应细胞引发的所产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体对C-MET阳性靶细胞的细胞毒活性，只是使用实施例26.1和26.2描述的转染C-MET的CHO细胞作为靶细胞并使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。仅选择显示有效募集效应细胞对C-MET阳性细胞的细胞毒活性的构建体，用于进一步使用。

27.cMET和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生和表征

27.1 产生具有增强的人cMET表达的CHO细胞和具有增强的猕猴cMET细胞外结构域表达的CHO细胞

使用上述人cMET和猕猴cMET的经修饰的编码序列，用于构建编码人cMET和猕猴cMET的细胞外结合域分别与人EpCAM的截短变体的融合蛋白的人工cDNA序列。为了产生用于表达这些cMET融合蛋白的构建体，根据标准方法通过基因合成获得cDNA片段(所述构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.767和777(人cMET)以及SEQ ID NO.788和789(猕猴cMET))。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是人cMET或猕猴cMET蛋白的分别与人cMET和猕猴cMET细胞外结构域对应的成熟蛋白的第1-908位氨基酸，框中随后是人工Ser₁-Gly₄-Ser₁-Gly₁-连接子的编码序列，框中随后是人EpCAM的跨膜结构域和细胞内结构域的编码序列(公布于GenBank，登录号NM_002354；第266-314位氨基酸[从起始密码子]，只是在第279位用异亮氨酸代替缬氨酸的点突变)和终止密码子。所述基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。将序列经过证明的核苷酸序列转染到DHFR缺陷的CHO细胞中，用于构建体的真核表达。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

27.2 cMET和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表10中所列，设计包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性以及具有对人和非黑猩猩灵长类cMET的种间特异性的结合特异性的双特异性抗体分子：

表10：抗CD3和抗cMET的种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

按照以上描述进行这些种间特异性双特异性单链分子的产生、表达和纯化。

按照上述进行cMET和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析。如图54所示，可清楚地检测到对C-MET具有种间特异性的且对人和非黑猩猩灵长类CD3具有种间特异性的以上所列单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和cMET的结合。这证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及cMET抗原的种间特异性。按照以上描述通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验进行生物活性分析。基于所证明的种间特异性双特异性结合和募集的细胞毒性，选择种间特异性结合分子用于进一步使用。

27.3 与cMET结合的种间特异性单链抗体片段(scFv)的产生和流式细胞术结合分析

按照上述产生cMET种间特异性的scFv并如下表11中所列进行命名。

表11：种间特异性单链抗体片段的命名

按照上述，利用以上实施例27.1描述的表达人cMET的CHO细胞和实施例27.1描述的表达猕猴cMET的CHO进行包含具有cMET种间特异性的scFv的周质制品的流式细胞术结合分析。如图56所示，可清楚地检测到对cMET具有种间特异性的以上所列scFv的结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与cMET的结合。这证明了scFv抗体对人和猕猴cMET抗原的种间特异性。

按照以上描述进行基于所述scFv的种间特异性结合分子的克隆以及这些种间特异性双特异性单链分子的表达和纯化。按照以上描述进行种间特异性双特异性结合的流式细胞术分析和通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验进行生物活性分析。基于所证明的种间特异性双特异性结合和募集的细胞毒性，选择种间特异性结合分子用于进一步使用。

按照本文的描述，产生对包含在所选择的种间特异性双特异性单链分子中的cMET种间特异性的非人scFv的人/人源化等价物。按照以上描述进行基于这些人/人源化scFv的种间特异性结合分子的克隆以及这些种间特异性双特异性单链分子的表达和纯化。按照以上描述进行种间特异性双特异性结合的流式细胞术分析和通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验进行生物活性分析。基于所证明的种间特异性双特异性结合和募集的细胞毒性，选择种间特异性结合分子用于进一步使用。

28.内皮唾液酸蛋白和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生和表征

28.1表达人内皮唾液酸蛋白的CHO细胞的产生

根据标准方法通过基因合成获得如GenBank(登录号NM_020404)公开的人内皮唾液酸蛋白的编码序列。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是人皮唾液酸蛋白的编码序列和，框中随后是FLAG标签的编码序列和终止密码子(所述构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.913和914)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的XbaI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和XbaI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

28.2 表达人内皮唾液酸蛋白的CHO细胞的产生

通过一组2个PCR由根据标准方法从猕猴(食蟹猴)结肠制备的cDNA获得猕猴内皮唾液酸蛋白的cDNA序列。使用如下反应条件进行第一PCR：在95℃5分钟的1个循环，随后是95℃45秒、50℃45秒和72℃2分钟的40个循环，随后是72℃5分钟的最后循环，并使用如下引物：

正向引物：5’-atatgaattcgccaccatgctgctgcgcctgttgctggcc-3’SEQ ID NO.917

反向引物：5’-gtcttcatcttcctcatcctcccc-3’SEQ ID NO.918。

使用如下反应条件进行第二PCR在95℃5分钟的1个循环，随后是95℃45秒、58℃45秒和72℃2分钟的40个循环，随后是72℃5分钟的最后循环，并使用如下引物：

正向引物：5’-gtcaactacgttggtggcttcgagtg-3’SEQ ID NO.919

反向引物：5’-ggtctagatcacttatcgtcatcatctttgtagtccacgctggttctgcaggtctgc-3’SEQ ID NO.920。

在加入终浓度为1M的PCR级甜菜碱的条件下进行PCR反应。该PCR产生2个重叠的片段，对其进行分离并使用PCR引物根据标准方法进行测序，由此产生了编码猕猴内皮唾液酸蛋白(从前导肽的第9位密码子至所述成熟蛋白的第733位密码子)的部分cDNA序列。为了产生用于表达猕猴内皮唾液酸蛋白的构建体，根据标准方法通过基因合成获得cDNA片段(所述构建体的cDNA序列和氨基酸序列列于SEQ ID NO：915和916)。在该构建体中，猕猴内皮唾液酸蛋白从前导肽的第9位氨基酸至成熟内皮唾液酸蛋白的第733位氨基酸的编码序列，框中随后的成熟人内皮唾液酸蛋白第734位氨基酸至最后一位氨基酸的编码序列，框中随后的FLAG标签的编码序列和终止密码子符合读框地与人内皮唾液酸蛋白前导肽的第1-8位氨基酸的编码序列融合。基因合成片段也设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点和位于含所述cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的XbaI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和XbaI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

28.3 scFv抗体片段与内皮唾液酸蛋白的种间特异性结合

根据标准方法通过基因合成获得scFv抗体片段的cDNA。通过合适的限制性位点将cDNA片段克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5Bhis(下述)的区别在于所述表达构建体(例如scFv)在scFv和His6标签之间包含Flag标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO.933)并且额外的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，将序列经过证明的质粒DNA的克隆转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1或XL1 blue中并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(含50μg/ml羧苄青霉素的LB)中。

利用1mM IPTG诱导后，转化有含有种间特异性单链抗体的编码序列的pComb3H5BFlag/His的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv链被输出到周质中并在此折叠成功能构象。

挑取来自转化板的单个大肠杆菌细菌菌落用于周质小量制备，并培养在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。通过在-70℃冷冻和在37℃解冻的四个循环施加温度休克，借此毁坏细菌的外层膜，并使包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗scFv抗体片段的上清液并用于随后的与实施例28.1所述的转染有人内皮唾液酸蛋白的CHO细胞和实施例28.2所述的转染有猕猴内皮唾液酸蛋白的CHO细胞的流式细胞术结合分析。

为此目的，各细胞系的200000个细胞与50μl包含种间特异性单链抗体的周质制品在冰上温育30分钟。使用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并利用鼠抗5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图46所示，与阴性对照相比，可以证明scFv抗体片段与人和猕猴内皮唾液酸蛋白两者的特异性结合。

28.4 内皮唾液酸蛋白和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

选择人抗体种系VH序列VH1 1-03(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID NO.910)、CDRH2(SEQ ID NO.911)和CDRH3(SEQ ID NO.912)的骨架背景。对于所述人VH，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。对于VH1 1-03，使用以下寡核苷酸组：

5’ED-VH-A-XhoI

CCA GCT CTC GAG TCA GGA SCT GAG STG RWG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG RTG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT SEQ ID NO 921

3’ED-VH-B

AAT ATA TCC MAT CCA CTC AAG GCK CTK TCC AKK TSY CTG CYT CAY CCA GTG TAT AAC ATA GTC AGT GAA TGT GTA TCC AGA SEQ ID NO 922

5’ED-VH-C

CTT GAG TGG ATK GGA TAT ATT AAT CCT TAT GAT GAT GAT ACTA CC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC SEQ ID NO 923

3’ED-VH-D

T GAG CTS CAT GTA GGC TGT GYT GGM GGA TKT GWC TMS AGT MAW TGT GRC CYG GCC CTT GAA CTT CTG GTT SEQ ID NO 924

5’ED-VH-E

C ACA GCC TAC ATG SAA CTC ARC AGC CTG ASA TCT GAG GAC ACT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA AGG GGG SEQ ID NO 925

3’ED-VH-F-BstEII

CCT GAT GGT GAC CAA GGT TCC TTG ACC CCA GTA GTC CAT AGA ATA GTC GAA GTA ACC ATC ATA GGA GTT CCC CCT TCT TGC ACA GTA SEQ ID NO 926

该引物组跨越了相应的整个VH序列。

在所述引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VH PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VH大约为350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。

选择人抗体种系VL序列VkI L8(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.907)、CDRL2(SEQ ID NO.908)和CDRL3(SEQ ID NO.909)的骨架背景。对于所述人VL，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。删除寡核苷酸中稍后克隆所需的限制性位点。对于VkI L8，使用以下寡核苷酸：

5’ED-VL-A-SacI

CCA GTC GAG CTC CAG CTG ACC CAG TCT CMA ARM TTC MTG TCC RCA TCA GTA GGA GAC AGA GTC NNS ATC ACC TGC AGG GCC AG (SEQ ID NO 927)

3’ED-VL-B

TCC TGG TTT CTG TTG ATA CCA GGC TAC AGC AGT ACC CAC ATT CTG ACT GGC CCT GCA GGT GAT(SEQ ID NO 928)

5’ED-VL-C

TAT CAA CAG AAA CCA GGA MAA KCC CCT AAA TTA CTG ATT TACT CG GCA TCG AAT CGG TAC ACT GGA GTC CCT(SEQ ID NO 929)

3’ED-VL-D

GCT GAT GGT GAG AGT GAA MTC TGT CCC AGA TCC ACT GCC TGA GAA GCG AYY AGG GAC TCC AGT GTA CCG(SEQ ID NO 930)

5’ED-VL-E

TTC ACT CTC ACC ATC AGC ART MTG CAG YCT GAA GAC YTS GCA RMTTAT TWC TGC CAG CAA TAT ACC AAC(SEQ ID NO 931)

3’ED-VL-F-BsiWI/SpeI

CCT GAT ACT AGT CGT ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC CTG TCC AAA CGT ATA CAT GGG ATA GTT GGT ATA TTG CTG GCA(SEQ ID NO 932)

该引物组跨越了相应的整个VL序列。

在所述引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VL PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VL大约为330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。

然后，在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中将最终的基于VH1 1-03的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkI L8的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合，以形成功能scFv的文库，如下所述在丝状噬菌体上展示后从所述文库选择、筛选、鉴定和证实抗内皮唾液酸蛋白结合子：

将450ng轻链片段(用SacI-SpeI消化)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(用SacI-SpeI消化；大片段)连接。随后将所得的组合抗体文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm，Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，得到多于10⁷独立克隆的文库大小。1小时表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化子。随后离心收集细胞并使用商购的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。

将2800ng包含VL文库(用XhoI-BstEII消化；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(用XhoI-BstEII消化)连接并再次通过电穿孔(2.5kV，0.2间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)转化到两个300ul等分试样的电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，获得多于10⁷独立克隆的scFv(单链可变片段)的总文库大小。

表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(含50ug/mL羧苄青霉素的SB)选择培养基中。随后用感染剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含所述抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中各噬菌体粒子包含编码scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体库用于选择抗原结合分子。

出于此目的，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集荷载所克隆的scFv库的噬菌体文库。将大约10¹¹-10¹²个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1％BSA中并在冰上于缓慢搅动的同时与10⁵-10⁷个转染有内皮唾液酸蛋白的CHO细胞(参见实施例28.1)温育1小时。这些转染内皮唾液酸蛋白的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)中。利用PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)通过共达五次的洗涤步骤除去不特异性地与转染内皮唾液酸蛋白的CHO细胞结合的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在PH 2.2的HCl-甘氨酸中(温育10min，随后涡旋)而从细胞洗脱结合分子，并且在用pH 12的2M Tris中和后，利用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1 Blue培养物(OD600＞0.5)。包含成功转导有编码人/人源化scFv片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再次选择羧苄青霉素抗性并随后用VCMS 13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4-5轮选择。

为了筛选内皮唾液酸蛋白特异性结合子，在选择后，从大肠杆菌培养物中分离对应于4和5轮淘洗的质粒DNA。为了产生可溶性scFv蛋白，从所述质粒切除VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI)。将这些片段通过相同的限制性位点克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(例如scFv)在scFv和His6标签之间包含Flag标签(DYKDDDDK)并且额外的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，将每个质粒DNA库(不同淘洗轮次)转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1或XL1 blue中并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(含50μg/ml羧苄青霉素的LB)中。挑取单个菌落至100μl LB-羧苄青霉素(50μg/ml)中。

在用1mM IPTG诱导后，转化有含有VL片段和VH片段的pComb3H5BFlag/His的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv链被输出到周质中并在此折叠成功能构象。

挑取来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落用于周质小量制备，并在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中培养，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。施加在-70℃冷冻和在37℃解冻的四个循环的温度休克，借此毁坏细菌的外层膜，并使包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗内皮唾液酸蛋白scFv的上清液并按照以下用于内皮唾液酸蛋白特异性结合子的鉴定：

通过流式细胞术在转染有内皮唾液酸蛋白的CHO细胞上检测scFv与内皮唾液酸蛋白的结合(参见实施例28.1)；使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

对于流式细胞术，将2.5×10⁵个细胞与50ul的scFv周质制品或与含有5μg/ml纯化的scFv和2％FCS的50μl PBS一起温育。用含2μg/ml抗His抗体(5His抗体，无BSA，Qiagen GmbH，Hilden，FRG)和2％FCS的50μl PBS检测scFv的结合。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Dianova，Hamburg，FRG)作为第二步试剂。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。

随后分析单个克隆的有利特征和氨基酸序列。通过将内皮唾液酸蛋白特异性scFv经由Gly₄Ser₁-连接子与CD3特异性scFv I2C(SEQ ID NO.185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv连接以产生结构域排列为VH内皮唾液酸蛋白-(Gly4Ser1)3-VL内皮唾液酸蛋白-Ser1Gly4Ser1-VHCD3-(Gly4Ser1)3-VLCD3或可选的结构域排列的构建体，从而将内皮唾液酸蛋白特异性scFv转变为重组双特异性单链抗体。对于在CHO细胞中表达，(i)包含嵌入Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)C-末端His₆标签和其后的终止密码子的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性单链抗体的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

28.5 双特异性单链抗体分子的表达和纯化

按照上文关于MCSPxCD3双特异性单链抗体的描述，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞中表达所述双特异性单链抗体分子。

所表达的双特异性单链抗体的分离和分析也在上文实施例9中有描述。

28.6 内皮唾液酸蛋白和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体的分别对人和猕猴内皮唾液酸蛋白和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。出于此目的，使用如实施例28.1所述的转染有人内皮唾液酸蛋白的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)测定与人抗原的结合。通过使用所产生的在实施例28.2中描述的猕猴内皮唾液酸蛋白转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Eflangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；发表于Knappe A等，以及Fickenscher H.，Blood 2000，95，3256-61)测定与猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200000个细胞与50μl表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。使用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并利用鼠抗5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的细胞的上清液用作阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

只选择对人和猕猴CD3以及对内皮唾液酸蛋白显示双特异性结合的构建体用于进一步应用。

28.7 内皮唾液酸蛋白和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例28.1所述的转染有人内皮唾液酸蛋白的CHO细胞和实施例28.2所述的转染有猕猴内皮唾液酸蛋白的CHO细胞通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。分别使用受刺激的消除人CD4/CD56的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。

受刺激的人PBMC的产生描述在上文实施例11中。

制备靶细胞，并进行类似于实施例11中描述的MCSPxCD3双特异性单链抗体的方法的测定。

仅选择显示有效募集效应细胞对内皮唾液酸蛋白阳性细胞的细胞毒活性的构建体，用于进一步使用。

29.CD248(内皮唾液酸蛋白)和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生和表征

29.1 CD248和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表13中所列，设计包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性以及具有对人和非黑猩猩灵长类CD248的种间特异性的结合特异性的双特异性抗体分子：

表13：抗CD3和抗CD248种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

按照上文的描述进行这些种间特异性双特异性单链分子的产生、表达和纯化。

按照上述进行CD248和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞结合分析。如图58所示，可清楚地检测到对CD248具有种间特异性的且对人和非黑猩猩灵长类CD3具有种间特异性的以上所列单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和CD248的结合。这证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及CD248抗原的种间特异性。

按照上文的描述通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如图59所示，所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的去除人CD4/CD56的PBMC引发的针对人CD248阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴CD248阳性靶细胞的细胞毒活性。

30.EpCAM和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生和表征

30.1 人EpCAM抗原在CHO细胞上的克隆和表达

使用人EpCAM抗原的序列(NM_002354，人肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)，mRNA，国际生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，根据标准方法通过基因合成获得合成分子。基因合成片段也设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点和位于含所述cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。在向命名为pEFDHFR的表达质粒中克隆的步骤中使用所引入的5’末端的XbaI和3’末端的SalI的限制性位点(Raum等(上述引文)。在序列验证后，按照下述使用所述质粒转染CHO/dhfr细胞。利用序列经过证明的质粒转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL 9096，细胞在37℃、95％湿度和7％CO₂的培养箱中在含有稳定的谷氨酰胺的RPMI 1640(从BiochromAG Berlin，德国获得)中培养，其中所述RPMI 1640中补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素(均从Biochrom AG Berlin，德国获得)和来自细胞培养级试剂储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)，且所述核苷的终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷)。根据制造商的说明，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后用PBS洗涤细胞一次并再次培养在没有补充核苷和透析FCS的上述细胞培养基(从Biochrom AG Berlin，德国获得)中。因此，细胞培养基不含核苷并由此对经转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到抗性细胞的生长。再过7-14天后通过FACS试验检测转染子对EpCAM的阳性表达。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

30.2 EpCAM和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

通常，如下表14中所列，设计均包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3抗原的结合特异性的结构域以及具有对人EPCAM抗原的结合特异性的结构域的各个双特异性单链抗体分子：

表14：抗CD3和抗EpCAM种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

通过基因合成获得包含人EpCAM特异性可变轻链(L)和可变重链(H)结构域以及人和猕猴CD3的种间特异性CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSPxCD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段并进行真核蛋白表达。

30.3 单结构域双特异性单链抗体分子的表达和纯化

按照本文以上关于MCSPxCD3双特异性单链抗体的描述，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞中表达所述单结构域双特异性单链抗体分子。

所表达的双特异性单链抗体的分离和分析也在上文实施例9中有描述。

30.4 EpCAM和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体的分别对人EpCAM以及对人/猕猴CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。出于此目的，使用如实施例30.1所述的转染有人EpCAM的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)测定与人抗原的结合。通过使用猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Erlangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；Knappe A等，以及Fickenscher H：Herpesvirus saimiri-transformed macaque T cells are tolerated和do not cause lymphoma after autologous reinfusion.Blood 2000；95：3256-61)测定与猕猴CD3的结合反应性。各细胞群的200000个细胞与50μl种间特异性双特异性抗体构建体的纯化蛋白(如2μg/ml)在冰上温育30分钟。或者，使用瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液。使用PBS洗涤细胞两次，并利用未标记的鼠5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。使用新鲜的培养基作为阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图60所示，可以清楚地检测所有针对EpCAM的双特异性单链分子的结合能力。在FACS分析中，与利用培养基以及1.和2.检测抗体的阴性对照相比，所有构建体都显示与人和猕猴CD3以及与人EpCAM的结合。总之，可以清楚地证明所述所述双特异性抗体与人和猕猴CD3以及人EpCAM的种间特异性。

30.5 EpCAM和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例30.1所述的EpCAM阳性细胞系通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。使用受刺激的人CD8阳性T细胞或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。

按照下述获得受刺激的CD8+ T细胞。

受刺激的人PBMC的产生描述在上文实施例11中。

制备靶细胞，并进行类似于实施例11中描述的MCSPxCD3双特异性单链抗体的方法的测定。

如在图61-66中所示，所示的所有种间特异性双特异性单链抗体构建体都显示由人CD8+细胞引发的针对人EpCAM阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对人EpCAM阳性靶细胞的细胞毒活性。使用无关的双特异性单链抗体作为阴性对照。

30.6 鼠EpCAM抗原和人-鼠EpCAM杂合抗原在CHO细胞的克隆和表达

使用鼠EpCAM抗原的序列(NM 008532，家鼠肿瘤相关钙信号转导蛋白1(Tacstd1)，mRNA，国际生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，根据标准方法通过基因合成获得合成分子。基因合成片段也设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点和位于含所述cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。在向命名为pEFDHFR的表达质粒中克隆的步骤中使用所引入的5’末端的XbaI和3’末端的SalI的限制性位点。在序列验证后，按照实施例30.1使用所述质粒转染CHO/dhfr细胞。通过用鼠外显子2(第26-61位氨基酸)交换人外显子2的氨基酸获得人-鼠EpCAM杂合抗原，从而使种间特异性双特异性抗体构建体能够识别表位。使用推定的序列通过基因合成获得合成的分子，并按照上述进行转染。

30.7 EpCAM和CD3种间特异性双特异性抗体与不同EpCAM抗原的流式细胞术结合分析

为了分析种间特异性双特异性抗体构建体关于对人或鼠的不同表位或对人-鼠杂合EpCAM的结合能力的结合能力，进行了FACS分析。出于此目的，使用实施例1描述的转染有人EpCAM的CHO细胞、转染有鼠EpCAM的CHO细胞(实施例30.6)和转染有人-鼠EpCAM杂合体的CHO细胞(实施例30.6)检测不同的结合图谱。相应细胞群的200000个细胞与50μl瞬时产生蛋白的细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。使用PBS洗涤细胞两次，并利用未标记的鼠5His抗体(Qiagen；以1∶20稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。使用新鲜的培养基而非来自转染有相应双特异性单链抗体分子的CHO细胞的细胞培养物上清液作为阴性对照。作为鼠EpCAM表达的阳性对照，使用了利用源自大鼠的特异于鼠EpCAM的未标记抗体(BD Pharmingen，#552370，大鼠IgG2a，k)和随后的PE标记的抗大鼠IgG2a κ特异性抗体(BD Pharmingen，Heidelberg，#553930))的检测。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。出于比较的目的，使用中值荧光强度以产生柱状图。

如图67所示，可清楚地检测到所有转染有针对EpCAM的双特异性单链分子与转染有人EpCAM的CHO细胞的结合能力。在分析与鼠EpCAM的结合时，人EpCAM特异性分子没有引发显著高于阴性对照的中值荧光强度。人EpCAM特异性单链双特异性抗体分子与人-小鼠EpCAM杂合抗原的结合性质揭示了两个亚组的分子：与人-小鼠EpCAM杂合抗原没有可测的结合的分子(HD69 HL x I2C HL)，和具有几乎在与人EpCAM抗原结合强度的水平的中值荧光强度的分子(hEp 14-A1 LH x I2C HL；hEp 14-H8 LH x I2C HL；hEp 14-A6 LH x I2C HL；hEp 14-D1 LH x I2C HL；hEp 14-H4 LH x I2C HL；hEp 17-A6 LH x I2C HL；hEp 17-E9 LH x I2C HL；hEp 18-E3 LH x I2C HL；hEp 18-F11 LH x I2C HL；hEp 18-F12 LH x I2C HL；hEp 18-G1 LH x I2C HL；hEp 18-G9 LH x I2C HL；所述构建体的SEQ ID NO参见表14)。这两个亚组的人EpCAM特异性单链双特异性抗体分子的不同结合图谱证明了人EpCAM抗原上的不同表位。将人EpCAM外显子2结构域移入鼠EpCAM的骨架导致获得通过本发明的针对EpCAM的双特异性单链分子而不是通过HD69 HL x I2C HL分子的结合。

因此，本发明的EpCAM-CD3双特异性单链抗体的第二结合域与位于由EpCAM基因的第2外显子编码的EpCAM的EGF样结构域1中的第26-61位氨基酸残基中的表位结合。所述由EpCAM基因的第2外显子编码的人EpCAM的EGF样结构域1中的第26-61位氨基酸残基示于SEQ ID NO.1130。

因此，本发明的针对EpCAM的双特异性单链分子的所述表位被绘制在人EpCAM的第2外显子区，而EpCAM的其它表位参与形成HD69 HL x I2C HL分子的表位。因此，本发明的针对EpCAM的双特异性单链分子本身形成EpCAM结合分子的独特类型，其明显不同于之前的基于EpCAM结合子HD69的EpCAM结合分子。

31.FAPα和CD3种间特异性双特异性单链抗体分子的产生和表征

31.1 表达人FAPα的CHO细胞的产生

根据标准方法通过基因合成获得如GenBank(登录号NM_004460)公开的人FAPα的编码序列。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是人FAPα蛋白的编码序列和终止密码子(所述构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.1149和1150)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的XmaI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过XmaI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

31.2 表达人FAPα的CHO细胞的产生

通过一组4个PCR由根据标准方法从猕猴皮肤制备的cDNA获得猕猴FAPα(食蟹猴)的cDNA序列。使用如下反应条件进行第二PCR在94℃3分钟的1个循环后，在94℃0.5分钟、在56℃0.5分钟和在72℃3分钟的40个循环，之后为72℃3分钟的最后循环，并使用以下引物：

正向引物：5’-cagcttccaactacaaagacagac-3’(SEQ ID NO.1153)

反向引物：5’-tttcctcttcataaacccagtctgg-3’(SEQ ID NO.1154)

正向引物：5’-ttgaaacaaagaccaggagatccacc-3’(SEQ ID NO.1155)

反向引物：5’-agatggcaagtaacacacttcttgc-3’(SEQ ID NO.1156)

正向引物：5’-gaagaaacatctacagaattagcattgg-3’(SEQ ID NO.1157)

反向引物：5’-cacatttgaaaagaccagttccagatgc-3’(SEQ ID NO.1158)

正向引物：5’-agattacagctgtcagaaaattcatagaaatgg-3’(SEQ ID NO.1159)

反向引物：5’-atataaggttttcagattctgatacaggc-3’(SEQ ID NO.1160)

这些PCR产生四个重叠片段，对其进行分离并利用PCR引物通过标准方法测序，由此产生编码猕猴FAPα的cDNA序列。为了产生用于表达猕猴FAPα的构建体，根据标准方法通过基因合成获得cDNA片段(所述构建体的cDNA序列和氨基酸序列列于SEQ ID NO：1151和1152)。该构建体包含猕猴FAPα的完整编码序列，随后为终止密码子。基因合成片段也设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点和位于含所述cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

31.3 FAPα和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表15中所列，设计均包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性的结构域以及具有对人和非黑猩猩灵长类FAPα的种间特异性的结合特异性的结构域的各个双特异性抗体分子：

表15：和抗CD3和抗FAPα种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

通过基因合成获得包含具有人和猕猴FAPα种间特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)以及人和猕猴CD3种间特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体。按照类似于实施例9中关于MCSPxCD3种间特异性单链分子描述的方法，设计基因合成片段并进行真核蛋白表达。

31.4 所述双特异性单链抗体分子的表达和纯化

按照上文关于MCSPxCD3双特异性单链抗体的描述，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞中表达所述双特异性单链抗体分子。

所表达的双特异性单链抗体的分离和分析也在上文实施例9中有描述。

31.5 FAPα和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞术结合分析

为了检测种间特异性双特异性抗体构建体的分别对人和猕猴FAPα和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。出于此目的，使用如实施例31.1所述的转染有人FAPα的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)测定与人抗原的结合。通过使用所产生的在实施例31.2中描述的猕猴FAPα转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Hygiene Institute，Virology，Erlangen-Nuernberg的Fickenscher教授惠赠；发表于Knappe A等，以及Fickenscher H.，Blood 2000，95，3256-61)测定与猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200000个细胞与50μl表达种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上温育30分钟。使用含有2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并利用鼠5His抗体(Qiagen；以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中)检测构建体的结合。洗涤后，使用以1∶100稀释在含有2％FCS的PBS中的结合有藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的细胞的上清液用作阴性对照。

在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞术，并利用CellQuest软件获取并分析数据(Becton Dickinson biosciences，Heidelberg)。根据免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中的描述进行FACS染色和荧光强度的测定。

如图68所示，可清楚地检测到对FAPα具有种间特异性的且对人和非黑猩猩灵长类CD3具有种间特异性的以上所列单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和FAPα的结合。这证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及FAPα抗原的种间特异性。

31.6 FAPα和CD3种间特异性双特异性单链抗体的生物活性

使用实施例31.1所述的转染有人FAPα的CHO细胞和实施例31.2所述的转染有猕猴FAPα的CHO细胞通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。分别使用受刺激的消除人CD4/CD56的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。

受刺激的人PBMC的产生描述在上文实施例11中。

制备靶细胞，并进行类似于实施例11中描述的MCSPxCD3双特异性单链抗体的方法的测定。

如图69所示，所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的去除人CD4/CD56的PBMC引发的针对人FAPα阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴FAPα阳性靶细胞的细胞毒活性。

31.7 额外的FAPα和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

选择人抗体种系VH序列VH11-03(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID NO.1137)、CDRH2(SEQ ID NO.1138)和CDRH3(SEQ ID NO.1139)的骨架背景。对于所述人VH，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。对于VH11-03，使用以下寡核苷酸：

5’FAP-VH-A-XhoI

CCG CTA CTC GAG TCT GGA SCT GAG STG RWG AAG CCT GGG GCT TCA GTA AAG(SEQ ID NO.1161)

3’FAP-VH-B

CTG TCT CAC CCA GTG TAT GGT GTA TTC AGT GAA TGT GTA TCY AGA AGY CTT GCA GGA CAY CTT TAC TGA AGC CCC(SEQ ID NO.1162)

5’FAP-VH-C

CAC TGG GTG AGA CAG KCC CMT GGA MAG AGM CTT GAG TGG ATK GGAGGT ATT AAT CCT AAC AAT GGT ATT CCT AAC TAC(SEQ ID NO.1163)

3’FAP-VH-D

CAT GTA GGC GGT GCT GGM GGA CKT GYC TMY AGT TAW TGT GRC CCT GCC CTT GAA CTT CTG ATT GTA GTT AGG AAT ACC(SEQ ID NO.1164)

5’FAP-VH-E

AGC ACC GCC TAC ATG GAG CTC MGC AGC CTG ASA TCT GAG GAT ACT GCG GTC TAT TWC TGT GCA AGA AGA AGA ATC GCC(SEQ ID NO.1165)

3’FAP-VH-F-BstEII

CCA GTA GGT GAC CAG GGT TCC TTG ACC CCA GTA GTC CAT AGC ATG GCC CTC GTC GTA ACC ATA GGC GAT TCT TCT TCT TGC ACA(SEQ ID NO.1166)

该引物组跨越了相应的整个VH序列。

在所述引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VH PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VH大约为350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。

选择人抗体种系VL序列VkII O11(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID NO.1132)、CDRL2(SEQ ID NO.1133)和CDRL3(SEQ ID NO.1134)的骨架背景。对于该人VL，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物都是反义引物。删除寡核苷酸中稍后克隆所需的限制性位点。对于VkII O11，使用以下寡核苷酸：

5’FAP-VL-A-SacI

CGA CCT GAG CTC GTG ATG ACA CAG ACT CCA YYC TCC CTA SCT GTG ACA SYT GGA GAG MMG GYT TCT ATS AGC TGC AAG TCC AGT CAG(SEQ ID NO.1167)

3’FAP-VL-B

AGA CTG CCC TGG CTT CTG CWG GWA CCA GGC CAA GTA GTT CTT TTG ATT ACG ACT ATA TAA AAG GCT CTG ACT GGA CTT GCA GCT(SEQ ID NO.1168)

5’FAP-VL-C

CAG AAG CCA GGG CAG TCT CCT MAA CTG CTG ATT TWC TGG GCA TCC ACTA GG GAA TCT GGG GTC CCT GAT CGC TTC TCA GGC AGT GGA(SEQ ID NO.1169)

3’FAP-VL-D

ATA TTG CTG ACA GTM ATA AAC TSC CAS GTC CTC AGC CTS CAC WCT GCT GAT CKT GAG AKT GAA ATC CGT CCC ARA TCC ACT GCC TGA GAA(SEQ ID NO.1170)

3’FAP-VL-E-BsiWI/SpeI

CCA GTA ACT AGT CGT ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC ACC ACC GAA CGT GAG CGG ATA GCT AAA ATA TTG CTG ACA GT(SEQ ID NO.1171)

该引物组跨越了相应的整个VL序列。

在所述引物组中，引物以等量混合(如，每种引物1μl(20μM-100μM的引物储备溶液)加到20μl PCR反应中)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物中。该混合物在PCR循环仪中在94℃温育3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳并根据标准方法从凝胶中分离200-400大小的产物。

随后，使用在N-末端和C-末端引入合适的克隆限制性位点的引物，并利用各种VL PCR产物作为模板用于标准PCR反应。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(VL大约为330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。

然后，在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中将最终的基于VH1 1-03的VH PCR产物(即人/人源化VH库)与最终的基于VkII O11的VL PCR产物(即人/人源化VL库)组合，以形成功能scFv的文库，如下所述在丝状噬菌体上展示后从所述文库选择、筛选、鉴定和证实抗FAPα结合子。

将450ng轻链片段(用SacI-SpeI消化)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(用SacI-SpeI消化；大片段)连接。随后将所得的组合抗体文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm，Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，得到多于10⁷独立克隆的文库大小。1小时表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化子。随后离心收集细胞并使用商购的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。

将2800ng包含VL文库(用XhoI-BstEII消化；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(用XhoI-BstEII消化)连接并再次通过电穿孔(2.5kV，0.2间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)转化到两个300ul等分试样的电感受态的大肠杆菌XL1 Blue细胞中，获得多于10⁷独立克隆的scFv(单链可变片段)的总文库大小。

表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(含50ug/mL羧苄青霉素的SB)选择培养基中。随后用感染剂量的10¹²个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含所述抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中各噬菌体粒子包含编码scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体库用于选择抗原结合分子。

出于此目的，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集荷载所克隆的scFv库的噬菌体文库。将大约10¹¹-10¹²个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1％BSA中并在冰上于缓慢搅动的同时与10⁵-10⁷个转染有FAPα的CHO细胞(参见实施例31.1)温育1小时。这些转染FAPα的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)中。利用PBS/1％FCS(包含0.05％叠氮化钠)通过共达五次的洗涤步骤除去不特异性地与转染FAPα的CHO细胞结合的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在PH 2.2的HCl-甘氨酸中(温育10min，随后涡旋)而从细胞洗脱结合分子，并且在用pH 12的2M Tris中和后，利用洗脱物感染新鲜的未感染的大肠杆菌XL1 Blue培养物(OD600＞0.5)。包含成功转导有编码人/人源化scFv片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再次选择羧苄青霉素抗性并随后用VCMS 13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4-5轮选择。

为了筛选FAPα特异性结合子，在选择后，从大肠杆菌培养物中分离对应于4和5轮淘洗的质粒DNA。为了产生可溶性scFv蛋白，从所述质粒切除VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI)。将这些片段通过相同的限制性位点克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(例如scFv)在scFv和His6标签之间包含Flag标签(DYKDDDDK)并且额外的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，将每个质粒DNA库(不同淘洗轮次)转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1或XL1 blue中并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。挑取单个菌落放入100μl LB羧苄青霉素(含50μg/ml羧苄青霉素的LB)中。挑取单个菌落至100μl LB-羧苄青霉素(含50μg/ml羧苄青霉素的LB)中。

在用1mM IPTG诱导后，转化有含有VL片段和VH片段的pComb3H5BFlag/His的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv被输出到周质中并在此折叠成功能构象。

挑取来自转化板的单个大肠杆菌细菌菌落用于周质小量制备，并培养在补充有20mM MgCl₂和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中，并且在收集后重新溶解在PBS(例如1ml)中。施加在-70℃冷冻和在37℃解冻的四个循环的温度休克，借此毁坏细菌的外层膜，并使包括scFv在内的可溶性周质蛋白释放到上清液中。在通过离心除去完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗FAPα scFv的上清液并按照以下用于FAPα特异性结合子的鉴定。

通过流式细胞术在转染有FAPα的CHO细胞上检测scFv与FAPα的结合(参见实施例31.1)；使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

对于流式细胞术，将2.5×10⁵个细胞与50ul的scFv周质制品或与含有5μg/ml纯化的scFv和2％FCS的50μl PBS一起温育。用含2μg/ml抗His抗体(5His抗体，无BSA，Qiagen GmbH，Hilden，FRG)和2％FCS的50μl PBS检测scFv的结合。使用以1∶100稀释在含有2％FCS的50μl PBS中的结合有R-藻红蛋白的亲和纯化的F(ab′)₂片段(山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异性的)(Dianova，Hamburg，FRG)作为第二步试剂。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。

随后分析单个克隆的有利特征和氨基酸序列。通过将FAPα特异性scFv经由Gly₄Ser₁-连接子与CD3特异性scFv I2C(SEQ ID NO.185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv连接以产生例如结构域排列为VL_FAPa1pha-(Gly₄Ser₁)₃-VH_FAPalpha-Ser₁Gly₄Ser₁-VH_CD3-(Gly₄Ser₁)₃-VL_CD3或可选的结构域排列的构建体，从而将FAPα特异性scFv转变为重组双特异性单链抗体。对于在CHO细胞中表达，将(i)包含嵌入Kozak共有序列的起始密码子的N-末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)终止密码子前的C-末端His₆标签的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性单链抗体的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)的多个克隆位点中。按照实施例31.3和31.4的描述进行所产生的表达质粒的转染，蛋白表达和种间特异性双特异性抗体构建体的纯化。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方法进行(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。

通过表达所述种间特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的培养物上清液的流式细胞术分析进行功能性双特异性单链抗体构建体的鉴定。按照实施例31.5的描述进行分析。只选择对人和猕猴CD3以及对FAPα显示双特异性结合的构建体用于进一步应用。

按照实施例31.6的描述，对由效应T细胞引发的种间特异性双特异性单链抗体构建体针对FAPα阳性靶细胞的细胞毒活性进行分析。仅选择显示有效募集效应细胞对FAPα阳性细胞的细胞毒活性的构建体，用于进一步使用。

32.额外的FAPα和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生和表征

32.1 FAPα和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表16中所列，设计包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性以及具有对人和非黑猩猩灵长类FAPα的种间特异性的结合特异性的双特异性抗体分子：

表16：抗CD3和抗FAPα种间特异性双特异性单链抗体分子的形式

按照上文描述进行这些种间特异性双特异性单链分子的产生、表达和纯化。

按照上述进行FAPα和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞结合分析。如图70所示，可清楚地检测到对FAPα具有种间特异性的且对人和非黑猩猩灵长类CD3具有种间特异性的以上所列单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和FAPα的结合。这证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及FAPα抗原的种间特异性。

按照上文的描述通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如图71所示，所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的去除人CD4/CD56的PBMC引发的针对人FAPα阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴FAPα阳性靶细胞的细胞毒活性。

32.2 与FAPα结合的种间特异性单链抗体片段(scFv)的产生和流式细胞术结合分析

按照上述产生FAPα种间特异性的scFv并如下表17中所列进行命名。

表17：种间特异性单链抗体片段的命名

按照上述，利用转染有人FAPα的CHO细胞和转染有猕猴FAPα的CHO进行包含具有FAPα种间特异性的scFv的周质制品的流式细胞术结合分析。如图72所示，可清楚地检测到对FAPα具有种间特异性的以上所列scFv的结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与FAPα的结合。这证明了scFv抗体对人和猕猴FAPα抗原的种间特异性。

按照以上描述进行基于所述scFv的种间特异性结合分子的克隆以及这些种间特异性双特异性单链分子的表达和纯化。按照以上描述进行种间特异性双特异性结合的流式细胞术分析和通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验进行生物活性分析。基于所证明的种间特异性双特异性结合和募集的细胞毒性，选择种间特异性结合分子用于进一步使用。

按照本文的描述，产生对包含在所选择的种间特异性双特异性单链分子中的FAPα种间特异性的非人scFv的人/人源化等价物。按照以上描述进行基于这些人/人源化scFv的种间特异性结合分子的克隆以及这些种间特异性双特异性单链分子的表达和纯化。按照以上描述进行种间特异性双特异性结合的流式细胞术分析和通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验进行生物活性分析。基于所证明的种间特异性双特异性结合和募集的细胞毒性，选择种间特异性结合分子用于进一步使用。

33.IGF-1R和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生和表征

33.1 表达人IGF-1R的CHO细胞的产生

根据标准方法通过基因合成获得如GenBank(登录号NM_000875)公开的人IGF-1R的编码序列。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是人IGF-1R蛋白的编码序列和终止密码子(所述构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.2011和2012)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。通过所述基因合成片段中编码序列的沉默突变除去不利的内部限制性位点。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

33.2 表达猕猴IGF-1R的CHO细胞的产生

根据标准方法通过基因合成获得如GenBank(登录号XM_001100407)公开的人IGF-1R的编码序列。所述基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的开始的Kozak位点，随后是人IGF-1R蛋白的编码序列和终止密码子(所述构建体的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.2013和2014)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。利用所引入的限制性位点，即5′末端的EcoRI和3′末端的SalI，进行如下克隆过程。通过所述基因合成片段中编码序列的沉默突变除去不利的内部限制性位点。根据标准方法，通过EcoRI和SalI将基因合成片段克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。根据标准方法，进行前述过程(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))。将序列经过证明的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞中以真核表达构建体。按照Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566的描述，在DHFR缺陷型CHO细胞中进行真核蛋白表达。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。

33.3 IGF-1R和CD3种间特异性双特异性单链分子的产生

种间特异性结合分子的克隆

通常，如下表18中所列，设计均包含具有对人和非黑猩猩灵长类CD3ε的种间特异性的结合特异性的结构域以及具有对人和非黑猩猩灵长类IGF-1R的种间特异性的结合特异性的结构域的各个双特异性抗体分子：

表18：抗CD3和抗IGF-1R种间特异性双特异性单链分子的形式

按照以上描述进行这些种间特异性双特异性单链分子的产生、表达和纯化。

按照上述进行IGF-1R和CD3种间特异性双特异性抗体的流式细胞结合分析。如图73所示，可清楚地检测到对IGF-1R具有种间特异性的且对人和非黑猩猩灵长类CD3具有种间特异性的以上所列单链分子的双特异性结合。在FACS分析中，与阴性对照相比，所有构建体都显示与CD3和IGF-1R的结合。这证明了该双特异性抗体对人和猕猴CD3以及IGF-1R抗原的种间特异性。

按照上文的描述通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如图74所示，所有产生的种间特异性双特异性单链抗体构建体都证明了由受刺激的去除人CD4/CD56的PBMC引发的针对人IGF-1R阳性靶细胞的细胞毒活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引发的针对猕猴IGF-1R阳性靶细胞的细胞毒活性。

按照本文的描述，产生对包含在所选择的种间特异性双特异性单链分子中的IGF-1R种间特异性的非人scFv的人/人源化等价物。按照以上描述进行基于这些人/人源化scFv的种间特异性结合分子的克隆以及这些种间特异性双特异性单链分子的表达和纯化。按照以上描述进行种间特异性双特异性结合的流式细胞术分析和通过铬51(⁵¹Cr)释放的体外细胞毒性试验进行生物活性分析。基于所证明的种间特异性双特异性结合和募集的细胞毒性，选择种间特异性结合分子用于进一步使用。