聚合物、二膦酸盐和抗血管生成剂的缀合物及其在治疗和监测骨相关疾病中的用途

摘要

本发明公开了具有连接在其上的抗血管生成剂和二膦酸盐骨靶向剂的聚合物或共聚物的缀合物，及其制备方法。还公开了含这些缀合物的药物组合物及其在治疗骨相关病症中的用途。

说明书

发明领域和背景

本发明在其某些实施方案中涉及化学缀合物及其在治疗和诊断中的用途，更具体但并非专门涉及在其上连接抗血管生成剂(anti-angiogenesis agent)和骨靶向部分(bone targeting moiety)的聚合物的化学缀合物，所述化学缀合物用于诊断、治疗和监测骨相关疾病和病症，例如骨癌和骨转移。

骨肉瘤是原发性骨癌的最常见类型，其归类为恶性间叶瘤，其中肿瘤直接产生有缺陷类骨质(未成熟骨)。它是富含血管并极有破坏性的恶性肿瘤，最常见于长骨的干骺端。过去二十多年来，由与根治性手术切除联合的侵略性化疗组成的多种形式的疗法成为处理骨肉瘤的主流，在没有呈现转移性疾病的患者中的5年存活率可达到50-70％。推荐了几种方案，例如基于免疫的疗法、肿瘤抑制剂或自杀基因疗法或在骨肉瘤中不常用的抗癌药物。然而，仍然有三分之一的患者死于这种毁灭型癌症，对于这些具有不能切除的癌症的患者而言，没有可治愈的系统疗法。

前列腺癌是工业化国家男性最常见的癌症，是男性癌症死亡率的第二位原因。这些患者的死亡不是由于原发性肿瘤生长，而是由于因转移到致命器官引起的并发症。前列腺癌主要转移到骨，但包括肺、肝和肾上腺在内的其它器官位点也受到影响。

乳腺癌经常也转移到骨。

晚期转移性疾病患者的骨转移发生率为大约70％。骨转移与相当多的骨骼不健全有关，所述骨骼不健全包括严重骨疼、病理性骨折、脊髓或神经根受压和恶性高血钙症。化疗剂、激素剥夺和二膦酸盐是对晚期转移性疾病的常见治疗。然而，该疾病随着时间可发展到标准疗法不能控制该恶性肿瘤的时期，并进一步发展到高度抗化疗的状态。

近年来，已经清楚肿瘤发展和转移形成适度依赖血管生成。现在认为血管生成是癌症治疗的重要控制点。因此，肿瘤募集的微血管内皮细胞在癌症治疗中成为重要的第二靶标。微血管内皮细胞不象肿瘤细胞本身，其往往不会出现对药物的抗性。肿瘤内皮细胞长时间对药物敏感，在″抗血管生成方案″中可用细胞毒素剂治疗。该方案涉及以大大低于最大耐受剂量(MTD)的低剂量给予化疗，并长期窄时间间隔给药(节拍式给药)。因此，应避免急性毒性，并可长期给予药物，最终将癌症转化为慢性可控制的疾病。尽管该方法对于非小细胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌显示出有前途的结果，但当长期节拍式给予即使是低剂量的化疗药物时，也会在身体内聚积并引起损伤(Browder等，Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer(化疗的抗血管生成方案改进实验性抗药癌症的疗效)，Cancer Res 2000；60：1878-1886)。

泰素紫杉醇(taxane paclitaxel)(PTX)是有效的抗肿瘤药。在临床上完全确定了紫杉醇是用于治疗转移性前列腺癌和乳腺癌的单一疗法及联合疗法的高度有效的抗肿瘤药物。紫杉醇的主要作用模式是促进微管蛋白组装并使其稳定，防止其解聚合并因此抑制引起损害的有丝分裂的微管动力学，导致细胞周期停止并最终导致细胞凋亡。尽管紫杉醇有很强的抗癌活性，但其水溶性很差，呈现严重的剂量限制毒性和来源于调配溶媒克列莫佛EL(cremophor EL)的超敏反应并对靶标组织缺乏选择性(Gelderblom等，2001，EurJCANCER 37(13)，1950-8；Bhalla，K.N.Oncogene 2003；22：9075-9086]。近些年来，已经明了低剂量紫杉醇具有抗血管生成性质(Wang等，Anticancer Drugs 2003；14：13-19)。

业已在乳腺癌患者中试验了节拍式给予低剂量紫杉醇的抗血管生长计划，显示出低毒性的诱人的结果[Munoz等，breast，14：466-79(2005)]。然而，即使是节拍式给予低剂量的紫杉醇也会引起副作用。

目前有8种公认具抗血管生成性质的核准的抗癌疗法。可将这些中断参与肿瘤血管生成和生长的关键的细胞信号转导途径的药物分为两个主要类别：(1)针对特异性的促血管生成因子和/或其受体的单克隆抗体(阿瓦斯丁(Avastin)、艾比特思(Erbitux)、维克替比(Vectibix)、曲妥单抗(Herceptin))；和(2)多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(特罗凯(Tarveca)、多吉美(Nexavar)、索坦(Sutent))。mTOR(哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶标)的抑制剂代表第三种较小类别的抗血管生成疗法，目前有一种核准药物(驮瑞塞尔(Torisel))。另外，至少有两种其它核准的血管生成剂可通过并未完全理解的机理间接抑制血管生成(硼替佐米(Velcade)，Celgene)。

第一个FDA核准的血管生成抑制剂贝伐单抗(Bevacizumab)(阿瓦斯丁，Genentech)是血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，其业已核准与标准的常规化疗联合用于转移性结肠癌治疗。

阻止血管生成的最大的药物类别是靶向VEGF受体(VEGFR)的多靶向酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。这些药物例如舒尼替尼(sunitinib)(索坦，Pfizer)、索拉非尼(Sorafenib)(多吉美，Bayer/Onyx Pharmaceuticals)和厄洛替尼(Erlotinib)(特罗凯，Gennentech/OSI/Roche)，具有击打多个靶标、方便口服给药和成本效益高的优点。尽管这些药物显示出有前景的功效，但其用途受到其缺乏靶标特异性的限制，缺乏靶标特异性导致始料不及的毒性[Cabebe等Curr Treat Options Oncol 2007；8：15-27]。

水溶性共聚物例如甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)为生物相容的、无免疫原性及无毒性的载体，其使得可特异性递送到肿瘤组织(Satchi-Fainaro等Nat Med 2004；10：255-261)。这些大分子不通过正常血管扩散，而是因为高渗透性及保持(enhanced permeability and retention，EPR)效果而在肿瘤位点选择性聚积。在很多实体肿瘤中观察到大分子物质及脂质的这种通过渗透性过高的新血管被动扩散并定位在肿瘤间质组织的现象。此外，与诸如HPMA等共聚物缀合应该阻碍通过血脑屏障的通道，并延长药物的循环半衰期，因此通过让在循环中比游离药物存在更长时间的被缀合的药物与细胞接触来抑制肿瘤内皮细胞和表皮细胞的生长。

Satchi-Fainaro等在WO 03/086382中阐述通过让抗血管生成剂与HPMA缀合而获得有利特点的实例。本专利申请教导水溶性聚合物与抗血管生成剂TNP-470的缀合物及其作为抗肿瘤剂的用途(尤其是它们作为进入肿瘤血管的TNP-470载体的用途)和它们对TNP-470的神经毒性的影响。根据WO 03/086382的教导，与单独的TNP-470比较，例示性所述缀合物HPMA-(TNP-470)缀合物(caplostatin)表现出较高的抗肿瘤活性连同降低的毒性水平。WO 03/086382另外建议纳入靶向配体，例如RGD或抗体。

业已在WO 03/086178中阐述HPMA-TNP-470缀合物用于治疗血管生成相关病症的用途。

在美国专利号6,884,817中介绍了通过让抗肿瘤药物与水溶性聚合物缀合而获得的增加活性但降低毒性的另一实例。

Meerum Terwogt等[PNU166945；Anticancer drugs 2001；12：315-323]亦阐述了紫杉醇的HPMA共聚物缀合物。这种缀合物的目标是改进药物溶解性并提供控释紫杉醇。

二膦酸盐，例如阿伦膦酸盐(alendronate)，是用于治疗骨质疏松症、骨转移和预防骨折的分子。这些化合物对骨矿物羟基磷灰石具有异常高的亲和性，因此已知亦被用于作为靶向部分(Uludag，H.Curr Pharm Des 2002；8：1929-1944)。

认为阿伦膦酸盐对于治疗骨相关疾病和癌症相关高血钙症有效。其已显示在几种体内癌症模型中通过几种不同机理具有抗肿瘤作用[Tuomela等2008，BMC Cancer 8：81；Molinuevo等2007，Eur JPharmacol 562：28-33；Hashimoto等2005，CancerRes 65：540-545]。另外，发现阿伦膦酸盐通过以下机理具有抗血管生成活性：(i)在卵巢癌症模型中阻止VEGF诱导的Rho激活[Hashimoto等2007，Biochem Biphys Res Commun 354：478-484]；(ii)在甲羟戊酸途径中抑制法尼基焦磷酸合成酶[Russell RG 2007，Pediatrics 119Suppl 2：S150-162]；和(iii)在骨肉瘤细胞系中调节细胞MMP-2表达水平[Cheng等2004，Pediatr Blood Cancer42；410-415]。

WO 2004/062588教导水溶性聚合缀合物对于骨靶向的药物递送具有改良的药代动力学参数，并且所装载的药物具有更好的水溶性。该申请教导的聚合物药物递送系统基于甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)缀合物，所述缀合物为靶向骨的药物(例如阿伦膦酸盐)和D-Asp₈连同骨-相关治疗剂(例如四环素(tetracycline))的缀合物。

PK2(FCE28069)是HPMA共聚物-阿霉素(doxorubicin)-半乳糖胺缀合物，其设计为治疗肝细胞癌或继发性肝病[Seymour等Journal of Clinical Oncology 2002；20：1668-1676]。阿霉素是在生理体液中溶解性有限的蒽环类抗生素，是已经确定的抗肿瘤药物。半乳糖胺与肝脏的无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合，由此作为特异性靶向肝脏的部分。这些组分经由酶生物可降解接头与HPMA聚合物连接，所述接头使得可在肝脏内释放游离阿霉素，由此增加其作用位点的药物浓度。酶可降解接头为四肽间隔基(Gly-Phe-Leu-Gly)，其设计为通过溶酶体组织蛋白酶来裂解。

O′hare等[Journal of Drug Targeting 1993；1：217-229]合成了HPMA共聚物，所述共聚物含阿霉素和作为特异性靶向黑素瘤部分的黑素细胞刺激激素(MSH)。阿霉素和黑素细胞刺激激素二者都经由酶生物可降解接头与HPMA聚合物连接。

Hruby等[Journal of Applied Polymer Science 2006；101：3192-3201]制备并合成了新型聚合物药物-递送系统，其设计用于靶向骨的抗肿瘤药物，所述递送系统基于生物相容的HPMA共聚物，其含羟基二膦酸盐靶向部分和模型药物放射性疗法¹²⁵I、显像剂¹¹¹In或抗癌药物阿霉素。

发明简述

目前已知的以达到抗肿瘤活性的剂量用于治疗骨相关癌症和其它血管生成-相关病症的药物的特征在于高毒性，这限制其应用。在研究改良目前已知的抗血管生成剂的方式以使其具有更高的治疗功效及降低的副作用水平的过程中，本发明人设计并成功制备和实施了羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、抗血管生成剂(例如紫杉醇)和诸如阿伦膦酸盐(ALN，一种二膦酸盐)等靶向骨的药物的新型缀合物，其中让抗血管生成剂和靶向骨的药物经由生物可降解接头与HPMA聚合物缀合。

本发明某些实施方案一方面提供包含具有连接在其上的抗血管生成剂和二膦酸盐骨靶向部分的聚合物主链的缀合物，所述聚合物主链源自选自以下的聚合物：右旋糖苷、水溶性聚氨基酸、聚乙二醇(PEG)、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLA/PLGA)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚丙三醇、聚酰氨基胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)。

根据某些实施方案，抗血管生成剂选自：紫杉醇、2-甲氧雌二醇、普利司他(prinomastat)、巴马司他(batimastat)、BAY 12-9566、羧基酰氨基三唑、CC-1088、乙酸右美沙芬(dextromethorphan acetic acid)、乙酸二甲基呫吨酮、内皮抑素、IM-862、马立马司他(marimastat)、基质金属蛋白酶、青霉胺(penicillamine)、PTK787/ZK 222584、RPI.4610、乳酸角鲨胺、SU5416、沙利度胺(thalidomide)、TNP-470、康普瑞汀(combretastatin)、他莫昔芬(tamoxifen)、COL-3、新伐司他(neovastat)、BMS-275291、SU6668、抗VEGF抗体、Medi-522(Vitaxin II)、CAI、白介素-12、IM862、阿米洛利(Amilloride)、蛋白、血管抑素K1-3、血管抑素K1-5、卡托普利(Captopril)、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑素^TM蛋白、夫马洁林(Fumagillin)、除莠霉素A(Herbimycin A)、4-羟基苯基视黄酰胺(4-Hydroxyphenylretinamide)、胡桃醌(Juglone)、层粘连蛋白、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、薰草菌素A(Lavendustin A)、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、米诺环素(Minocycline)、盐酸米诺环素、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明(Suramin)、苏拉明钠盐、人血小板反应蛋白、中性粒细胞、针对特异性的促血管生成因子和/或其受体的单克隆抗体(例如阿瓦斯丁、艾比特思、维克替比、曲妥单抗)；多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如它塞瓦(Tarceva)、多吉美、索坦、易瑞沙(Iressa))；mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶标)的抑制剂(例如驮瑞塞尔)；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马立马司他、巴马司他)；EMD121974(西仑吉肽(Cilengitide))；Vitaxin；角鲨胺(Squalamin)；COX-2抑制剂；PDGFR抑制剂(例如格列卫(Gleevec))；NM3和2-ME2。

根据某些实施方案，抗血管生成剂为紫杉醇。

根据某些实施方案，聚合物主链源自N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)。

本发明实施方案一方面提供包含具有连接在其上的抗血管生成剂和二膦酸盐骨靶向部分的聚合物主链的缀合物。

根据某些实施方案，抗血管生成剂和骨靶向部分中至少一种经由接头与聚合物主链连接。

根据某些实施方案，接头为生物可降解接头。

根据某些实施方案，抗血管生成剂和骨靶向部分各自经由接头与聚合物主链连接。

根据某些实施方案，二膦酸盐部分选自阿伦膦酸盐、英卡膦酸盐(cimadronate)、氯膦酸盐(clodronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)、依替膦酸盐(etidronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、奥帕膦酸盐(olpadronate)、利塞膦酸盐(risedonate)、吡利膦酸盐(piridronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)和唑来膦酸盐(zoledronate)。

根据某些实施方案，二膦酸盐为阿伦膦酸盐。

根据某些实施方案，生物可降解接头选自pH-敏感的接头和酶可裂解的接头。

根据某些实施方案，生物可降解接头为酶可裂解的接头。

根据某些实施方案，酶可裂解的接头由在肿瘤组织中表达的酶来裂解。

根据某些实施方案，酶可裂解的接头由在肿瘤组织中过表达的酶来裂解。

根据某些实施方案，所述酶选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、legumain、MMP-2和MMP-9。

根据某些实施方案，生物可降解接头包含具有2-10个氨基酸残基的寡肽。

根据某些实施方案，寡肽选自-[Ala-Leu-Ala]-、-[Cit-Val]-、-[Gly-Leu-Gly]-、-[Gly-Phe-Gly]-、-[Gly-Leu-Phe-Gly]-、-[Gly-Phe-Leu-Gly]-、-[Ala-Leu-Ala-Leu]-、-[Phe-Lys]-和-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。

根据某些实施方案，抗血管生成剂经由包含-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]的接头与聚合物主链连接。

根据某些实施方案，骨靶向部分经由包含-[Gly-Phe-Leu-Gly]-的接头与聚合物主链连接。

根据某些实施方案，缀合物进一步包含将抗血管生成剂和/或二膦酸盐与聚合物主链和/或与接头连接在一起的间隔基。

根据某些实施方案，抗血管生成剂为紫杉醇，间隔基让紫杉醇与聚合物主链或与生物可降解接头连接。

根据某些实施方案，间隔基可降解。

根据某些实施方案，间隔基为碳酸对氨基苯甲酯(PABC)。

根据某些实施方案，缀合物具有本文所定义的通式II。

根据某些实施方案，缀合物进一步包含连接在其上的标记物质。

根据某些实施方案，标记物质选自荧光剂、放射性试剂、磁化剂、发色团、生物发光剂、化学发光剂、磷光剂和重金属团簇。

本发明实施方案一方面提供包含作为活性成分的本文所述缀合物和药学可接受载体的药物组合物。

根据某些实施方案，将组合物包装在包装材料中，并在包装材料里或表面用印刷物说明用于治疗骨相关疾病或病症的用途。

根据某些实施方案，所述缀合物包含标记物质，所述组合物包装在包装材料中，并在包装材料里或表面用印刷物说明用于监测骨相关疾病或病症的用途。

本发明某些实施方案一方面提供在需要治疗的受试者中治疗骨相关疾病或病症的方法，所述方法包括给予受试者有效量的本文所述缀合物。

本发明某些实施方案一方面提供在受试者中监测骨相关疾病或病症的方法，所述方法包括：给予受试者本文所述的具有连接在其上的标记物质的缀合物；和采用成像技术来监测缀合物在身体或其部分内的分布。

本发明某些实施方案一方面提供作为药物的本文所述缀合物。

本发明某些实施方案一方面提供本文所述缀合物在制备用于治疗骨-相关疾病或病症的药物中的用途。

本发明某些实施方案一方面提供作为诊断剂的本文所述具有连接在其上的标记物质的缀合物。

本发明某些实施方案一方面提供本文所述具有连接在其上的标记物质的缀合物在制备用于监测骨相关疾病或病症的诊断剂中的用途。

根据某些实施方案，所述疾病或病症与血管生成有关。

根据某些实施方案，所述疾病或病症选自骨转移和骨癌。

本发明某些实施方案一方面提供制备本文所述缀合物的方法，所述方法包括：

(a)使多个聚合物主链单体单元共聚合，其中多个聚合物主链单体单元的一部分包含以第一反应性基团为终端的单体单元，多个聚合物主链单体单元的另一部分包含以第二反应性基团为终端的单体单元，因此获得包含包含多个主链单元的聚合物主链的共聚物，其中主链单元的一部分具有第一反应性基团，主链单元的另一部分具有第二反应性基团，所述第一反应性基团能够与抗血管生成剂起反应，所述第二反应性基团能够与二膦酸盐起反应；

(b)让共聚物与抗血管生成剂或与其衍生物经由第一反应性基团反应，因此获得具有连接在其上的抗血管生成剂的共聚物；和

(c)让共聚物与二膦酸盐或其衍生物经由第二反应性基团反应，因此获得具有连接在其上的二膦酸盐的共聚物，由此获得所述缀合物。

根据某些实施方案，(b)在(c)之后、同时或之前进行。

根据某些实施方案，所述以第一反应性基团为终端的单体单元和/或以第二反应性基团为终端的单体单元进一步包含接头，所述接头以所述第一反应性基团为终端或以第二反应性基团为终端。

根据某些实施方案，所述方法进一步包括在(a)之前让接头与单体单元连接。

根据某些实施方案，让抗血管生成剂和二膦酸盐中至少一种与聚合物主链和/或与接头经由间隔基连接，所述方法进一步包括在(a)之前让间隔基与单体单元的至少一个部分连接。

根据某些实施方案，让抗血管生成剂和二膦酸盐中至少一种与聚合物主链和/或与接头经由间隔基连接，所述方法进一步包括在(a)之前让间隔基与抗血管生成剂和/或与二膦酸盐连接，因此获得抗血管生成剂和/或二膦酸盐的衍生物。

除非另外定义，否则本文所用所有技术和/或科学术语具有与本发明所属技术的一般技术人员所通常理解一样的意义。尽管在实行或试验本发明实施方案中可使用与本文所述相似或等同的方法及材料，但例示性的方法和/或材料如下所述。在冲突的情况下，以本发明说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为阐明性的，并非必不可少的限制。

附图简述

本文仅通过举例关于附图及图像阐述本发明实施方案。关于现在特别详细地提及的附图，强调所显示的细节是为了举例及阐明性讨论本发明实施方案的目的。在这点上，对附图的说明使本领域技术人员明了可怎样实行本发明实施方案。

在附图中：

图1显示阐明通过组织蛋白酶B酶裂解本发明某些实施方案的HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物(化合物1)的机理的流程图。

图2A-C显示阐明本发明某些实施方案的合成HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物(化合物1)的流程图(图2A)，和缀合物的流体力学直径和粒径分布图(图2B)，和阐明根据本发明某些实施方案经由RAFT合成另一HPMA共聚物-PTX-ALN缀合物的流程图(图2C)。

图3A-B显示本发明某些实施方案的对所测样品中未结合的HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物的FPLC检测，其在存在及缺乏羟基磷灰石情况下于选择的时间点(图3A)进行，图表显示作为洗脱时间的函数的与羟基磷灰石结合的HPMA-紫杉醇-FK-ALN缀合物的百分比(图3B)。用作对照的是HPMA共聚物。

图4A-B显示根据本发明某些实施方案，通过组织蛋白酶B在体外酶引发的从HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物释放紫杉醇的HPLC检测，其在还原性谷胱甘肽和组织蛋白酶B存在下，在磷酸盐缓冲液中于37℃进行0、24和48小时孵育(图4A)，图表显示作为与组织蛋白酶B孵育时间的函数从缀合物释放的紫杉醇(游离PTX)的量(图4B)。

图5显示证明当紫杉醇与HPMA共聚物结合时保留其对HUVEC细胞的抗血管生成作用的比较性图表。结果表示为作为紫杉醇浓度的函数的细胞生长百分比(出自对照组)：单独HPMA聚合物(空心菱形)；游离紫杉醇-FK(PTX-FK)(实心三角形)；本发明某些实施方案的HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物(实心方框)；游离紫杉醇+游离ALN组合(ALN+PTX；空心三角形)；游离ALN(十字形)；游离紫杉醇(PTX，空心圆)；和游离紫杉醇-FK+游离ALN(PTX-FK+ALN；实心圆)。

图6A-C显示不可裂解的HPMA-GGGG-PTX缀合物(图6A)、组织蛋白酶B-酶可裂解的HPMA-GGFK-PTX缀合物(图6B)的2-D化学结构，比较性图表显示，在抑制HUVEC增殖方面不可裂解的对照HPMA-GGGG-PTX缀合物比组织蛋白酶B-可裂解的HPMAGGFK-PTX缀合物的活性小(图6C)。HUVEC与HPMA-GGGG-PTX(实心三角形)或与HPMA-GGFK-PTX(实心方框)缀合物孵育48小时。HPMA-GGGG-PTX缀合物以比组织蛋白酶B可裂解的HPMA-GGFK-PTX缀合物高2-log的浓度抑制HUVEC增殖。数据代表平均值±SD。X轴为对数标度。

图7代表显示在组织蛋白酶B抑制剂存在下本发明某些实施方案的HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物和PTX-FK的细胞毒性降低的条线图。HUVEC与HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物或与PTX-FK+ALN以500nM和300nM的浓度分别在组织蛋白酶B抑制剂(BI)存在或不存在下孵育48小时。HUVEC未与任何作为对照的药物孵育(表示为″未治疗″)。结果表示为细胞生长百分比(出自对照组)。数据代表平均值±SD。*＝p＜0.05。

图8显示本发明某些实施方案的显示由HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物抑制HUVEC迁向趋化剂VEGF的条线图。HUVEC与紫杉醇和ALN组合、紫杉醇-FK和ALN组合、与每种单独药物并与HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物孵育。测量朝VEGF的迁移，并用代表单独迁向VEGF的100％来使迁移百分比标准化。

图9A-B显示本发明某些实施方案的图像(图9A)和条线图(图9B)，其显示HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物、游离紫杉醇-FK(PTX)游离ALN及其混合物在8小时孵育后对HUVEC形成毛细管样管状结构的能力的影响(图9A)，及所测物质在不同浓度时抑制HUVEC毛细管样管状结构的百分比(图9B)。

图10显示证明紫杉醇与HPMA共聚物结合时保留其对人前列腺癌细胞(PC3)的细胞毒性作用的比较性图表。结果表示为作为紫杉醇浓度的函数的细胞生长百分比(出自对照组)。PC3细胞与PTX(空心圆)、ALN(十字形)、PTX-FK(实心三角)、ALN+PTX(空心三角)、PTX-FK+ALN(实心圆)、HPMA共聚物(空心菱形)和HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物(实心方框)孵育72小时。数据代表平均值±SD。X轴为对数标度。

图11A-B显示证明本发明某些实施方案的HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物抑制胫骨中的DA3肿瘤(图11A)及在治疗小鼠中未观察到体重减少(图11B)的比较性图表。将游离(闭合圆)或缀合的(闭合三角)ALN和PTX对DA3肿瘤生长的抗肿瘤作用与用溶媒处理的对照组(闭合方框)进行比较。用对荷有mCherry-标记的DA3肿瘤的小鼠进行静脉内非创伤性荧光成像来评估肿瘤发展。HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物开始治疗9天后抑制37％肿瘤生长，而在用游离ALN+游离PTX组合治疗的小鼠及对照组(图11A)中未观察到肿瘤生长的显著变化。监测治疗的小鼠的体重，在任何组中都未观察到体重减轻(图11B)。

本发明具体实施方案说明

在其某些实施方案中，本发明涉及化学缀合物及其在治疗和诊断中的用途，更具体但并非专有地，涉及具有连接在其上的抗血管生成剂和骨靶向部分的聚合物的化学缀合物，所述缀合物用于治疗和监测骨相关疾病和病症，例如骨癌和骨转移。

参考附图及随附说明，可更好地理解本发明缀合物、组合物、用途、方法和过程的原理及操作。

在详细解释至少一个本发明实施方案之前，应该理解，本发明不限于其在以下说明所提出的或实施例所举的细节方面的应用。本发明能够是其它实施方案或以各种方式实行或实施其它实施方案。同样地，应该理解本文采用的表达方式和术语为了说明目的，不应该认为是限制。

如上所述，目前已知的以达到抗肿瘤活性的剂量用于治疗骨相关癌症和其它血管生成-相关病症的药物的特征在于高毒性，这限制其应用。

本发明人现在设计并成功制备和实施了新型共聚物的缀合物，其具有连接在共聚物上的抗血管生成剂和骨靶向部分，即二膦酸盐。

在设计所述作用剂以便表现出有益于治疗骨癌或骨转移的抗血管生成活性的同时，所述改进的特异性由聚合物诱导的EPR作用及骨靶向部分诱导的靶向作用二者来实现。

如以下实施例章节所证明，本发明人成功地制备并实施了新型羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物的缀合物，其具有连接在共聚物上的抗血管生成剂紫杉醇和二膦酸盐阿伦膦酸盐(ALN)，其中紫杉醇和阿伦膦酸盐与源自HPMA的聚合物主链经由生物可降解接头缀合(HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN；参见图2)。缀合物的抗血管生成活性业已通过以下来证明：缀合物抑制HUVEC增殖的能力(图5)；抑制血管内皮生长因子(VEGF)-诱导的HUVEC迁移的能力(图8)；和抑制HUVEC形成毛细管样管状结构的能力(图9)。用体外羟基磷灰石结合测定进一步证明缀合物与骨矿物的结合能力，与羟基磷灰石结合的缀合物为50％(图3)。另外，显示了缀合物对人前列腺PC3细胞系增殖的细胞毒活性(图10)。体内实验表明缀合物与游离紫杉醇药物比较具有有益活性，由此胫骨内注射的极具侵略性的肿瘤模型DA3鼠乳房癌不受游离PTX治疗的影响，但HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物治疗抑制37％的肿瘤生长(图11)。

这些结果证明本文所述缀合物可有利地用于治疗骨和骨相关病症(例如特征在于血管生成的癌症和病症)。

本发明某些实施方案一方面提供聚合缀合物，所述聚合缀合物包含具有连接在其上的至少一种抗血管生成剂和至少一种骨靶向部分的聚合物主链，所述骨靶向部分为二膦酸盐。

本文亦互换称为″抗血管生成剂″或″血管生成抑制剂″的术语″抗血管生成剂″阐述具有以下能力的作用剂：(a)抑制内皮细胞增殖或迁移；(b)杀死增殖的内皮细胞；和/或(c)抑制组织中新血管形成。

适用于本发明实施方案情况的例示性抗血管生成剂包括但不限于：紫杉醇、2-甲氧雌二醇、普利司他、巴马司他、BAY 12-9566、羧基酰氨基三唑、CC-1088、乙酸右美沙芬、乙酸二甲基呫吨酮、内皮抑素、IM-862、马立马司他、基质金属蛋白酶、青霉胺、PTK787/ZK222584、RPI.4610、乳酸角鲨胺、SU5416、沙利度胺、TNP-470、康普瑞汀、他莫昔芬、COL-3、新伐司他、BMS-275291、SU6668、抗VEGF抗体、Medi-522(Vitaxin II)、CAI、白介素-12、IM862、阿米洛利、血管抑素蛋白、血管抑素K1-3、血管抑素K1-5、卡托普利、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑素^TM蛋白、夫马洁林、除莠霉素A、4-羟基苯基视黄酰胺、胡桃醌、层粘连蛋白、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、薰草菌素A、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、米诺环素、盐酸米诺环素、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明、苏拉明钠盐、人血小板反应蛋白、中性粒细胞、针对特异性的促血管生成因子和/或其受体的单克隆抗体(例如阿瓦斯丁、艾比特思、维克替比、曲妥单抗)；多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如它塞瓦、多吉美、索坦、易瑞沙)；mTOR的抑制剂(哺乳动物雷帕霉素靶标)(例如驮瑞塞尔)；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马立马司他、巴马司他)；EMD121974(西仑吉肽)；Vitaxin；角鲨胺；COX-2抑制剂；PDGFR抑制剂(例如格列卫)；NM3和2-ME2。

本文所用术语″COX-2抑制剂″指抑制COX-2酶相对优先于COX-1酶的非甾体类药物。优选COX-2抑制剂实例包括但不限于：塞来考昔(celecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、美洛昔康(meloxicam)和依托考昔(etoricoxib)。

在某些实施方案中，抗血管生成剂选自：TNP-470、紫杉醇、针对特异性的促血管生成因子和/或其受体的单克隆抗体(例如阿瓦斯丁、艾比特思、维克替比、曲妥单抗)；多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如它塞瓦、多吉美、索坦、易瑞沙)；mTOR的抑制剂(哺乳动物雷帕霉素靶标)(例如驮瑞塞尔)；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马立马司他、巴马司他)；EMD121974(西仑吉肽)；Vitaxin；角鲨胺；COX-2抑制剂；PDGFR抑制剂(例如格列卫)；NM3；和2-ME2。

在某些实施方案中，抗血管生成剂为紫杉醇。

微管干扰剂紫杉醇为常用于治疗晚期转移性乳腺癌的药物。然而，它毒害神经，引起血液学毒性，并且很多乳腺肿瘤对其发展出抗性。最近显示超低剂量的紫杉醇抑制血管生成。然而，紫杉醇溶解性差，现在用来溶解其商用形式的赋形剂克列莫佛EL或乙醇引发超敏反应。

本文注意到尽管某些抗血管生成剂表现出抗肿瘤活性，但本发明实施方案包括那些可经由抑制血管生成起作用的抗肿瘤药物。

本文所用短语″骨靶向部分″阐述体内给予后能够优先在硬组织(即骨组织)而不是任何其它器官或组织聚积的部分。

二膦酸盐(BP)例如阿伦膦酸盐是具有与无机焦磷酸盐(PPi)相似结构的化学结构的化合物，所述无机焦磷酸盐是骨矿物化的内生调节剂。在生理条件下对骨矿物表现出强亲和力的二膦酸盐的药代动力学概况、其低毒性和抗血管生成活性(通常以其相当高的浓度时表现出)，都有利于靶向限定在骨组织中的肿瘤。

因此，本文所述骨靶向部分为包含至少两个膦酸盐(-P(＝O)(OH)₂)基团和任选其它官能团的化合物。

例示性化合物具有如本文所定义的以下通式化合物或其药学可接受盐：

其中R₁和R₂各自独立选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代环烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、取代或未取代杂脂环、卤素、羟基、硫醇基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基和硫代芳氧基，其如下文所定义。

在某些实施方案中，R₁和R₂中至少一个为烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂脂环，其任选如本文所定义被取代。

在某些实施方案中，烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂脂环被如本文所定义的反应性基团例如胺、羟基、硫醇基、卤素、羧酸酯等取代，这使得其可与聚合物主链上的相容的反应性基团缀合。

在某些实施方案中，R₁和R₂中至少一个为羟基，另一个为烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂脂环，其如本文所述。

在某些实施方案中，R₁为羟基，R₂为以氨基基团为末端的烷基。所述烷基在其主链上可有1-6个碳原子。

适用于本发明实施方案情况的例示性二膦酸盐骨靶向部分包括但不限于：阿伦膦酸盐、英卡膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、利塞磷酸盐(risedronate)、吡利膦酸盐、帕米膦酸盐和唑来膦酸盐。

在某些实施方案中，骨靶向部分为阿伦膦酸盐(4-氨基-1-羟基亚丁基)二膦酸)：

本文术语″阿伦膦酸盐″和″二膦酸盐″包括其任何药学可接受盐、溶剂化物和/或水合物，其如下文所定义。

如上所述，本发明人业已让阿伦膦酸盐与聚合物主链连同紫杉醇缀合，通过提高缀合物与羟基磷灰石(作为模拟骨组织的模型)的结合证明获得的聚合缀合物的靶向骨的能力(图3)。亦证明所述缀合物在治疗骨癌转移小鼠模型中的有益的治疗活性(图11)。

在某些实施方案中，本文所述聚合缀合物由聚合物主链组成，所述主链由多个彼此共价连接的主链单元形成，其中这种多个主链单元中至少一部分有连接在其上的本文所述抗血管生成剂，多个主链单元中至少另一部分有连接在其上的骨靶向部分(本文所述二膦酸盐)。

那些具有连接在其上的抗血管生成剂的主链单元和那些具有连接在其上的二膦酸盐的主链单元可在聚合物主链内随机分散。

聚合物主链可进一步包括如下文所述的非功能化的主链单元，所述主链单元上未连接抗血管生成剂及二膦酸盐或任何其它作用剂。

在某些实施方案中，所述缀合物的聚合物主链构成聚合物(或共聚物)，在其上连接有抗血管生成剂和骨靶向部分。

适用于本发明实施方案情况的聚合物为生物相容、无免疫原性和无毒的。将所述聚合物用作载体，所述载体可能由于上文所述的EPR作用能够特异性递送到肿瘤组织。

本文所用术语″聚合物″阐述由多个彼此共价连接的重复结构单元(主链单元)组成的有机物质。本文所用术语“聚合物”包括有机聚合物和无机聚合物，并进一步包括一种或多种同型聚合物、共聚物或其混合物(混合品)。本文所用术语″同型聚合物″阐述由一种类型的单体单元构成并因此由同型主链单元组成的聚合物。本文所用术语″共聚物″阐述由不止一种类型的单体单元构成并因此由异型主链单元组成的聚合物。异型主链单元可因其所附的基团而彼此不相同。

所述聚合物由主链单元组成，所述主链单元通过让相应的单体单元聚合形成，藉此让抗血管生成剂和骨靶向部分与这些主链单元的至少部分连接。这些主链单元中某些或全部通常在缀合前功能化，以使具有用于连接抗血管生成剂和骨靶向部分的反应性基团。那些未功能化和/或不参与缀合抗血管生成剂和骨靶向部分的主链单元本文称之为″游离″主链单元。

聚合物可为生物稳定的聚合物、生物可降解聚合物或其组合。本发明实施方案情况中所用的术语″生物稳定的″，阐述了在生理条件下保持完整的化合物或聚合物(例如在体内不降解)。

术语″生物可降解″阐述在生理条件下和/或环境条件下可分解为裂解产物的物质。所述生理条件和/或环境条件包括例如水解(经由水解裂解分解)、酶催化作用(酶降解)和机械作用。该术语通常指在这些条件下分解从而在短于一年的时间内分解50％重量的物质。

本发明实施方案情况中所用术语″生物可降解″亦包括术语″生物可再吸收″，其阐述在生理条件下分解裂解为经历生物再吸收到宿主的产物的物质，也就是说，分解产物成为宿主-生物体生化系统中的代谢物。

所述聚合物可为水溶性或不溶于水。在某些实施方案中，聚合物在室温下为水溶性。

聚合物可进一步为带电荷聚合物或不带电荷聚合物。带电荷聚合物可为阳离子聚合物，其具有正电荷基团并在生理pH时带净正电荷；或为阴离子聚合物，其具有负电荷基团，并在生理pH时带净负电荷。不带电荷聚合物可具有在生理pH时为中性净电荷的正电荷和负电荷基团，或可不带电荷。

在某些实施方案中，所述聚合物具有在100Da-800kDa范围的平均分子量。在某些实施方案中，聚合物具有小于60kDa的平均分子量。在某些实施方案中，聚合物的平均分子量介于15-40kDa之间。

具有高于10kDa分子量的聚合物质通常表现出本文所述的EPR作用，同时具有100kDa及更高分子量的聚合物质具有相对长的血浆半衰期和低效率的肾清除。因此，当考虑血浆半衰期和肾清除率及缀合物在肿瘤中聚积时可确定聚合缀合物的分子量。

至少在某种程度上可通过聚合(或共聚合)程度来控制聚合物分子量。

本发明实施方案情况中所用聚合物可为合成聚合物或天然存在的聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物为合成聚合物。

本文所述聚合物的聚合主链可源自例如聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚酰胺、聚脲烷、聚亚胺、聚糖、聚肽、聚羧酸酯及其混合物。

适用于本发明实施方案情况的例示性聚合物包括但不限于：右旋糖苷、水溶性聚氨基酸、聚乙二醇(PEG)、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLA/PLGA)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚丙三醇、聚酰氨基胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)。

这些聚合物可如本文所述为任何分子量。

在某些实施方案中，聚合物主链源自聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)或其共聚物。所述聚合物主链包含甲基丙烯酰胺主链单元，所述主链单元具有连接在其上的2-羟基丙基，或所述2-羟基丙基可通过在其上连接(直接或间接)本文所述部分(例如二膦酸盐和抗血管生成剂)来进行修饰。

聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)(HPMA)聚合物是一类水溶性合成聚合载体，其可全面地表征为生物相容、无免疫原性和无毒。HPMA聚合物相对于其它水溶性聚合物的一个优点是，它们可通过相对简单的化学修饰来裁制，以便调整其各自药物及靶向部分的含量。另外，可操控这些聚合物的分子量和电荷以便肾清除并从身体排泄，或以便改变生物分布同时允许靶向肿瘤。

应该理解，本文讨论的聚合物阐述了以下聚合物：由同型或异型非功能化单体单元形成的聚合物；和构成聚合缀合物的聚合主链通过由相同的单体单元组成从而对应于所述聚合物，同时这些单体单元中若干如本文所述被功能化。因此，所述聚合缀合物的聚合主链与本文所述聚合物相似，并通过使上述作用剂连接在其中的一些主链单元上而与所述聚合物不同。

在每一个本文所述缀合物中，骨靶向部分和抗血管生成剂各自可直接或间接通过接头部分(本文亦称为接头、接头基团或连接基团)与聚合物主链的主链单元各部分连接，因此，在某些实施方案中，将直接/间接连接设计为在表征所期望的身体位点条件下可裂解(例如通过某些酶或pH)，其如下文所述。

因此，根据本发明某些实施方案，至少一种抗血管生成剂和骨靶向部分经由接头与聚合物连接。在某些实施方案中，抗血管生成剂和骨靶向部分各自经由接头与聚合物连接。连接抗血管生成剂与聚合物的接头和连接骨靶向部分与聚合物的接头可相同或不同。

本文所述接头指起让抗血管生成剂和/或骨靶向部分与聚合物主链偶联的作用而对骨靶向部分的靶向功能或抗血管生成剂的治疗作用无有害影响的化学部分。

在某些实施方案中，接头为生物可降解接头。

本文所用短语″生物可降解接头″阐述当暴露在生理条件时能够被降解或裂解的接头。所述生理条件可为例如pH、某些酶等。

在某些实施方案中，接头能够被预先选择的细胞酶裂解，例如在造骨细胞、破骨细胞、癌细胞溶酶体或增殖的内皮细胞中发现的那些酶。或者，酸可水解的接头可包含酯或酰胺连接，例如顺-乌头基连接。通过允许仅在所需身体位点释放抗血管生成药物和/或阿伦膦酸盐，所述接头进一步提高本文所述缀合物的治疗活性并降低其毒性。

因此，根据某些实施方案，生物可降解接头为pH-敏感的接头或酶可裂解的接头。

pH-敏感的接头包含仅在遭受到某种pH条件例如酸性pH(例如低于7)、中性pH(6.5-7)或碱性pH(高于7)时被裂解或降解的化学部分。

可例如将所述接头设计为在酸性或碱性条件下经历水解，因此，在所述缀合物未到达pH分别为酸性或碱性的生理环境之前，将会在身体内保持完整，不释放连接在聚合物上的作用剂。

例示性pH-敏感的接头包括但不限于：腙键、酯(包括原酸酯)键、顺-乌头残基酰胺键、三苯甲基、乙缩醛、缩酮、Gly-酯和-[Gly-Phe-Gly]-部分。

在某些实施方案中，生物可降解接头为酶可裂解的接头.

通常将所述接头设计为包括(通常但并非排它地)被预先选择的酶识别的氨基酸序列的化学部分。本文通常称所述氨基酸序列为″识别基序″。包含所述接头的缀合物在其环境中缺乏预先选择的酶时通常基本上保持完整，因此不会在与所述酶接触之前裂解或降解以释放连接在其上的作用剂。

在某些实施方案中，酶可裂解接头通过在肿瘤组织中表达的酶来裂解。在某些实施方案中，酶可裂解接头通过在肿瘤组织中过表达的酶来裂解。包含所述接头的缀合物确保例如大量缀合的抗血管生成剂仅在肿瘤组织中从缀合物释放，因此降低了与非选择性给予药物有关的副作用，并进一步提高肿瘤位点的药物浓度。

适用于本发明实施方案情况的例示性酶包括但不限于组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、legumain、MMP-2和MMP-9。

合适的接头包括但不限于烷基链；任选用一个或多个取代基取代的烷基链并其中一个或多个碳原子任选被氮、氧和/或硫杂原子间隔开。

其它合适的接头包括氨基酸和/或寡肽。

所述烷基链和/或寡肽可任选功能化以使其与藉此连接的部分(例如聚合物主链和骨靶向部分、聚合物主链和抗血管生成剂)共价结合。所述功能化可包括纳入或产生参与所述共价结合的反应性基团，其如下文所详述。

在某些实施方案中，接头为含有例如2-10个氨基酸残基的生物可降解寡肽基团。

在某些实施方案中，接头为组织蛋白酶B-可裂解接头。

组织蛋白酶B为在表皮肿瘤细胞和内皮肿瘤细胞中都过表达的溶酶体酶。合适的接头具有组织蛋白酶-B可裂解位点，包括例如但不限于以下氨基酸序列：-[Arg]-、-[Cit-Val]--[Arg-Arg]-、-[Phe-Lys]-、[Gly-Phe-Leu-Gly]、-[Gly-Phe-Ala-Leu]-和-[Ala-Leu-Ala-Leu]-、-[Gly-Leu-Gly]-、-[Gly-Phe-Gly]-、-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-及其组合。

在某些实施方案中，接头包含氨基酸序列-[Gly-Leu-Gly]-、-[Gly-Phe-Gly]-、-[Gly-Leu-Phe-Gly]-、-[Gly-Phe-Leu-Gly]-、-[Phe-Lys]-和/或-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。

在某些实施方案中，接头为-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。所述接头包含组织蛋白酶B的两个″识别基序″及其裂解，以使其仅在高酶浓度存在下实现释放连接在其上的部分。这种特点提高了连接部分在过表达酶的位点的选择性释放。

在某些实施方案中，接头为-[Gly-Phe-Leu-Gly]-。

如下文实施例章节所证明，使用的组织蛋白酶B可裂解接头为-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-和-[Gly-Phe-Leu-Gly]-，其让紫杉醇和阿伦膦酸盐与HPMA连接(参见图1)。-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-六肽不与紫杉醇药物而与碳酸对氨基苯甲酯(PABC)间隔基直接连接，如下文所详述。图1所示为组织蛋白酶B裂解缀合物的示意图，藉此组织蛋白酶B在以下位点裂解HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物：(1)紫杉醇-六肽接头的两个酰胺键(在Gly-Phe-Leu-Gly和Phe-Lys氨基酸之间和Phe-Lys和PABC之间)；和(2)ALN四肽接头的酰胺键(Gly-Phe-Leu-Gly)。组织蛋白酶B的裂解产物为PABC-紫杉醇和ALN。通过自发的1，6-苯甲基消除从PABC-紫杉醇获得最终产物游离紫杉醇，其如下文所详述。

应该理解，本文称为HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物的聚合缀合物包含源自HPMA单体单元的聚合物主链，而紫杉醇和阿伦膦酸盐二者都经由组织蛋白酶B-生物可降解接头与所述聚合物主链连接，由此紫杉醇经由包含-[Phe-Lys]-(称为FK)的接头与聚合物主链连接。

经由组织蛋白酶B依赖的机理从缀合物释放紫杉醇为以下实施例章节所证明。具体地，HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物与组织蛋白酶B孵育，从所述缀合物释放紫杉醇的程度增加与组织蛋白酶B孵育时间相关(图4)。此外，当紫杉醇经由不能为组织蛋白酶B识别的接头序列(GGGG)与HPMA共聚物缀合时，与具有被组织蛋白酶B裂解的接头(GGFK；参见图6)的对应缀合物比较，紫杉醇抗HUVEC的抗增殖的活性显著降低。当加入组织蛋白酶B抑制剂时缀合物的抗增殖活性降低，这进一步证明了组织蛋白酶B与紫杉醇从缀合物的释放有关(图7)。

在某些实施方案中，酶可裂解接头被组织蛋白酶K裂解。

组织蛋白酶K是参与骨重建和再吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，主要在破骨细胞中表达。组织损伤后及骨瘤中释放的炎性细胞因子刺激其表达[Pan等2006，J Drug Target 14：425-435；Husmann等2008，Mol Carcinog 47：66-73]。

具有组织蛋白酶K可裂解位点的接头的非限制性实例为-[Gly-Gly-Pro-Nle]-

亦可构建含有预先选择的氨基酸序列(识别基序)的寡肽接头，以使该识别基序在接头中重复若干次，因此提高所连接的作用剂的选择性释放。亦可将相同或不同酶的不同的识别基序纳入到接头中。同样地，接头可包含多个pH敏感的键或部分。包含所述多个可裂解位点的接头可提高抗血管生成剂在所需身体位点的选择性释放，因此降低有害副作用，并在其展现其活性时进一步提高所释放的药物在身体位点的相对浓度。

在抗血管生成剂和/或骨靶向部分直接与聚合物结合的情况下，连接这些部分的键亦可为可生物降解的，例如为酶可裂解的键或pH-敏感的键。所述键可在聚合物、骨靶向部分和/或抗血管生成剂功能化后形成，以便包括用于形成所需键的相容的反应性基团。

肽接头亦可包括起增加接头长度作用的肽序列。由于较长肽的接头与裂解酶的空间相互作用更有效，较长的肽可能有利。

在某些实施方案中，抗血管生成剂经由间隔基与聚合物主链或与接头连接。在某些实施方案中，骨靶向部分经由间隔基与聚合物主链或与接头连接。间隔基可相同或不同。

本文所用术语″间隔基″，阐述与聚合物主链和接头、抗血管生成剂和/或骨靶向部分共价连接并插入它们之间因此在聚合物主链和抗血管生成剂和/或骨靶向部分之间形成桥样结构的化学部分。或者，间隔基可与接头和抗血管生成剂和/或骨靶向部分共价连接并插入它们之间。

合适的间隔基包括但不限于亚烃基链，其任选被一个或多个取代基取代，其任选被一个或多个氮、氧和/或硫杂原子间隔开。

其它合适的间隔基包括氨基酸和氨基酸序列，任选用一种或多种用于让聚合物主链/抗血管生成剂/骨靶向部分/接头偶联的反应性基团功能化。

在某些实施方案中，间隔基具有式G-(CH₂)n-K，其中n为1-10的整数；和G和K各自为反应性基团，例如NH、O或S。在某些实施方案中，G和K各自为NH，n为2。

在某些实施方案中，间隔基为氨基酸序列，任选为惰性氨基酸序列(即不影响缀合物的亲和力或选择性)。可将所述间隔基用于延长接头或使接头功能化。

在某些情况中，从空间考虑(为聚合物提供使偶联阻碍更小的位点)或化学反应性考虑(将相容的反应性基团加到实现偶联的聚合物位点)方面来说，使用间隔基是为了使骨靶向部分和/或抗血管生成剂与聚合物主链或接头的连接更有效并更简单。在某些情况下，间隔基可有助于所得到的缀合物的性能。例如，间隔基可使酶可裂解间隔基的空间阻碍更小，因此更易于酶相互作用。

在某些情况中，使用间隔基是为了通过例如改变间隔基所连接的抗血管生成剂和/或骨靶向部分的溶解性(即更为疏水或更为亲水)，使缀合物的合成更有效并更简单。

在某些实施方案中，间隔基为可降解间隔基，其能够经受降解反应，以释放连接在其上的作用剂。在某些实施方案中，间隔基如本文所定义为生物可降解的。

间隔基可为例如：取代或未取代环烷基、取代或未取代杂脂环族基团、取代或未取代芳基和取代或未取代杂芳基；其中取代基可为例如：羟基、烷氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、亚磺酰基、磺酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和NRaRb，其中Ra和Rb各自独立为氢、烷基、环烷基、芳基、羰基、磺酰基、三卤代甲基磺酰基，当合在一起时表示5-或6-元杂脂环，藉此间隔基可直接通过环基团或经由一种或多种取代基与抗血管生成剂/骨靶向部分/接头/聚合物连接。

术语″烷基″阐述包括直链和支链基团的饱和脂肪族烃。优选地，烷基具有1-20个碳原子。本文任何时候指定数值范围例如″1-20″时，意即该基团(在本情况下为烷基)可含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等至多包括20个碳原子。在某些实施方案中，烷基具有1-10个碳原子。在某些实施方案中，烷基具有1-4个碳原子。例示性烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十七烷基、十八烷基和十九烷基。

术语″环烷基″阐述全碳单环或稠环(即共享相邻碳原子对的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子系统。环烷基的非限制性实例有环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷。

术语″芳基″阐述全碳单环或稠环多环(即共享相邻碳原子对的环)基团，其具有完全共轭的π电子系统。芳基的非限制性实例有苯基、萘基和蒽基。芳基可被取代或不被取代。

术语″杂芳基″阐述环中具有一种或多种原子并另外具有完全共轭的π电子系统的单环或稠环(即共享相邻碳原子对的环)基团，所述原子例如氮、氧和硫。杂芳基的非限制性实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。

术语″杂脂环″阐述环中具有一种或多种原子的单环或稠环基团，所述原子例如氮、氧和硫。所述环亦可具有一个或多个双键。然而，所述环不具有完全共轭的π电子系统。

术语″羟基″阐述-OH基。

术语″烷氧基″如本文所定义阐述-O-烷基和-O-环烷基两者。

术语″硫醇″阐述-SH基。

术语″硫代烷氧基″阐述-S-烷基和-S-环烷基两者，其中烷基和环烷基如本文所定义。

术语″氰基″阐述-C≡N基团。

术语″羰基″阐述-C(＝O)-R′基团，其中R′为如本文所定义的氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)或杂脂环(通过环碳键合)。

术语″硫代羰基″阐述-C(＝S)-R′基团，其中R′如本文所定义。

术语″O-氨基甲酰″阐述-OC(＝O)-NR′R″基团，其中R′如本文所定义，R″为如本文所定义的氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)或杂脂环(通过环碳键合)。

术语″N-氨基甲酰″阐述R′OC(＝O)-NR″-基团，其中R′和R″如本文所定义。

术语″O-硫代氨基甲酰″阐述-OC(＝S)-NR′R″基团，其中R′和R″如本文所定义。

术语“N-硫代氨基甲酰”阐述R″OC(＝S)NR′-基团，其中R′和R″如本文所定义。

术语″C-酰氨基″阐述-C(＝O)-NR′R″基团，其中R′和R″如本文所定义。

术语″N-酰氨基″阐述R′C(＝O)-NR″基团，其中R′和R″如本文所定义。

术语″C-羧基″阐述-C(＝O)-O-R′基团，其中R′如本文所定义。

术语″O-羧基″阐述R′C(＝O)-O-基团，其中R′如本文所定义。

术语″硝基”阐述-NO₂基团。

术语″氨基”阐述-NH₂基团。

术语″磺酰基”阐述-S(＝O)₂-R′基团，其中R′如本文所定义。

术语″卤素″或″卤代″阐述氟、氯、溴或碘原子。

在某些实施方案中，间隔基为取代或未取代芳基和取代或未取代杂芳基，藉此取代基可为碳酸盐、C-酰氨基、N-酰氨基和胺，藉此间隔基可直接通过芳香族基团或经由一种或多种取代基与抗血管生成剂/骨靶向部分/接头/聚合物连接。

在某些实施方案中，间隔基为所选择的可降解间隔基，由此在其从聚合缀合物裂解后经受自发降解。

所述间隔基可例如在一端与生物可降解接头连接，在另一端与抗血管生成剂或骨靶向部分连接，由此当生物可降解接头被裂解以释放间隔基和连接在其上的部分时，所述间隔基经受自发降解以释放连接在其上的部分。

经受所述自发降解的例示性间隔基包括但不限于可经由分解性电子反应级联经受自发1，4-、1，6-、1，8-等消除的化学部分。所述化学基团为本领域已知，或另外可由本领域技术人员设计。

在例示性实施方案中，间隔基可经受自发1，6-苯甲基消除。所述间隔基实例为碳酸对氨基苯甲酯(PABC)。

在某些实施方案中，间隔基促进抗血管生成剂或骨靶向部分与聚合物主链或接头的连接。这可通过给予所述待连接的部分反应性基团来实现，所述反应性基团与聚合物主链和/或连接在聚合物主链上的接头上的官能团化学上相容，和/或通过改变连接到聚合物的部分的溶解性以促进聚合物(或共聚物)与所述部分之间的反应来实现。

例如，在某些情况中，由聚合物主链构成的聚合物为水溶性聚合物，而抗血管生成剂疏水，因此在水溶液或在极性有机溶剂中的溶解性有限。在这种情况下，可让间隔基与抗血管生成剂连接以提高其水溶性并促进其在水溶液或质子或极性有机溶剂中与聚合物缀合。

如上所述，本发明人使用碳酸对氨基苯甲酯(PABC)间隔基通过-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-接头让紫杉醇与HPMA聚合物连接(参见图1)。如进一步所述，在组织蛋白酶B裂解缀合物时，释放PABC-紫杉醇，并通过自发的1，6-苯甲基消除从PABC-紫杉醇获得游离紫杉醇最终产物。

因此，所述PABC间隔基起以下两种作用：(i)促进紫杉醇与接头连接；和(ii)使得可在生物降解接头后接着降解间隔基来自发释放紫杉醇。

间隔基亦可用于让其它作用剂(例如下文所述标记物质)与缀合物连接。

间隔基的长度和组成可视空间考虑而变化，其可用于将抗血管生成剂和/或骨靶向部分与聚合物主链间隔开。

在某些实施方案中，本文所述缀合物的抗血管生成剂为紫杉醇，其通过接头-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-与源自HPMA的聚合物主链连接，所述聚合物主链经由-[Gly-Phe-Leu-Gly]-接头与骨靶向部分连接。在某些实施方案中，骨靶向部分为阿伦膦酸盐。

本文短语″聚合物上的装载″或简单地″装载″用于阐述与本文所述缀合物的聚合物主链连接的作用剂的量，在本文中通过缀合物中该作用剂的摩尔％来代表，其如下文所定义。

本文所用术语″摩尔％″阐述每1摩尔聚合缀合物的连接部分的摩尔数量乘以100。

因此，例如1摩尔％装载的骨靶向部分阐述由100个主链单元组成的聚合缀合物，其中1个主链单元具有连接在其上的靶向部分，另外99个主链单元为游离或具有连接在其上的其它作用剂。

凭经验确定给定缀合物和给定用途的抗血管生成剂和骨靶向部分的最佳装载度，其基于所需的缀合物的性质(例如水溶解性、治疗功效、药代动力学性质、毒性和给药需求)并任选基于可与所选合成途径中聚合物主链连接的缀合的部分的量。

可通过本领域技术人员众所周知的方法测量％装载，其中某些方法如以下实施例的材料与方法项下所述。

在某些实施方案中，聚合物中抗血管生成剂的装载大于1摩尔％。

在某些实施方案中，缀合物中抗血管生成剂的装载介于1摩尔％-99摩尔％、1摩尔％-50摩尔％、1摩尔％-20摩尔％、1摩尔％-10摩尔％或1摩尔％-5摩尔％之间。

在某些实施方案中，骨靶向部分的装载大于1摩尔％。

在某些实施方案中，缀合物中骨靶向部分的装载介于1摩尔％-99摩尔％、1摩尔％-50摩尔％、1摩尔％-20摩尔％、1摩尔％-10摩尔％或1摩尔％-5摩尔％之间。

本文将具有缀合在其上的抗血管生成剂的聚合物主链内的主链单元数量阐述为″y″，将具有缀合在其上的骨靶向部分的聚合物主链内的主链单元数量阐述为″w″，本文将聚合物主链内的游离主链单元(未与其它部分结合)的数量阐述为″x″。

因此，在某些实施方案中，本文所述缀合物可由通式I代表：

[A₁]x[A₂-L₁-B]y[A₃-L₂-D]w

式I

其中：

x为具有使x/(x+y+w)乘以100在0.01-99.9范围内的值的整数；

y为具有使y/(x+y+w)乘以100在0.01-99.9范围内的值的整数；和

w为具有使w/(x+y+w)乘以100在0.01-99.9范围内的值的整数；

A₁、A₂和A₃为彼此共价连接的各个主链单元，其形成聚合物主链，其中：

B为上文定义的抗血管生成剂；

D为上文定义的骨靶向部分；和

L₁和L₂各自独立为上文定义的接头；

由此[A₂-L₁-B]为具有连接在其上的抗血管生成剂的主链单元；和

[A₂-L₂-D]为具有连接在其上的骨靶向部分的主链单元；

其中[A₁]、[A₂-L₁-B]和[A₃-L₂-D]各自为与[A₁]、[A₂-L₁-B]和[A₃-L₂-D]中的一种连接的末端主链单元，或与[A₁]、[A₂-L₁-B]和[A₃-L₂-D]中的至少两种连接，A₁、A₂和/或A₃彼此连接而形成聚合物主链。

在其中缀合物的聚合物主链源自HPMA的实施方案中，A₁为羟基丙基甲基丙烯酰胺单元；A₂和A₃各自为甲基丙烯酰胺单元。

在某些实施方案中，本文所述缀合物可由通式II代表：

式II

其中y、w和x如本文所定义。

在某些实施方案中，缀合物具有以下结构：

其中y、w和x如本文所定义。

根据本发明某些实施方案，x为具有使x/(x+y+w)乘以100在70-99.9范围内的值的整数；y为具有使y/(x+y+w)乘以100在范围内的值的整数0.01-15；和w为具有使w/(x+y+w)乘以100在0.01-15范围内的值的整数。

例如，x/(x+y+w)乘以100可为71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9；y/(x+y+w)乘以100可为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；和w/(x+y+w)乘以100可为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

应该理解，可通过选择用于形成下文所述的聚合缀合物的各种单体单元的摩尔比率，来按需控制x、y和w。

根据某些实施方案，本文所述缀合物进一步包含连接在其上的标记物质。

标记物质与缀合物的连接使得能利用这些缀合物来监测骨相关疾病或病症，例如监测本文所述缀合物表现的治疗效果。

本文所用短语″标记物质″阐述可检测部分或探针。适用于这些实施方案情况的例示性标记物质包括但不限于：荧光剂、放射性试剂、磁化剂、发色团、生物发光剂、化学发光剂、磷光剂和重金属团簇。

短语″放射性试剂″阐述通过发射电离粒子及辐射失去能量(衰减)的物质(即放射性核或放射性同位素)。当所述物质衰减时，其通过检测其发射的辐射来测定它的存在。为这些目的，特别有用的放射性衰减类型为正电子放射。例示性放射性试剂包括^99mTc、¹⁸F、¹³¹I和¹²⁵I。

术语″磁化剂″阐述被吸引到外部施加的磁场的物质。这些物质通常作为对比剂用于改进磁共振成像(MRI)中内部身体结构的可视性。用于对比增强的最常用的化合物是基于钆的化合物。MRI对比剂改变其所存在的组织和体腔的弛豫时间，这可视图像权重提供较高或较低的信号。

本文所用术语“发色团”阐述当其与另一分子连接时使后者显示颜色因而当施用各种光谱测量时可见的化学部分。

术语″生物发光剂″阐述通过生化过程发光的物质。

术语″化学发光剂″阐述因化学反应而发光的物质。

短语“荧光剂”指当暴露于外部来源的辐射时在特定波长发光的化合物。

短语“磷光剂”指通过磷的缓慢氧化不必有可观的热或外部激发就可发光的化合物。

重金属团簇可例如为用于例如在电子显微镜技术中标记的金原子簇。

如上所述，由于EPR作用，肿瘤血管系统具有提高的吸收具有高分子量和大的流体力学直径的大分子和胶状药物载体的能力。因此，本文所述具有足够大的流体力学直径的缀合物是有利的。本文术语″足够大″用于阐述具有导致在肿瘤组织中的聚集的缀合物比率比其它组织增加的流体力学直径的缀合物。最佳比率的测定完全在本领域技术人员能力内。例如，所述比率可为1.1、2、3、4、5等。在某些实施方案中，流体力学直径在15nm-200nm范围内。在某些实施方案中，流体力学直径在50nm-150nm范围内。在某些实施方案中，流体力学直径在70nm-90nm范围内。在又一实施方案中，流体力学直径为95nm。可如下文中的实施例章节的材料及方法项下所述测量流体力学直径。

可在本发明的这方面或其它方面给予或另外使用上文所述缀合物，可原样给予或作为其药学可接受盐、对映异构体、非对映异构体、溶剂化物、水合物或前药给予。

短语″药学可接受盐″指母体化合物的带电荷物质及其反荷离子，其通常用于修饰母体化合物的溶解性特点，和/或降低母体化合物对生物体的显著刺激，但不消除所给予化合物的生物学活性和性质。优选通过让所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生化合物的中性形式。化合物的母体形式在某些物理性质方面与各种盐形式不同，所述物理性质例如在极性溶剂中的溶解性，但除此外所述盐在用于本发明目的方面等同于化合物的母体形式。

短语″药学可接受盐″意即包括用相对无毒的酸或碱制备的部分和/或缀合物的盐，所述盐视本文所述化合物上存在的特定取代基而定。当本发明缀合物含有相对酸性的官能团时，可通过让所述缀合物的中性形式(即非离子化)与所需的足量的碱(纯碱或在合适的惰性溶剂中的碱)接触来获得碱加成盐。药学可接受碱加成盐实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基的盐或镁盐或类似盐。当本发明缀合物含有相对碱性的官能团时，可通过让所述缀合物的中性形式(即非离子化)与所需的足量的酸(纯酸或在合适的惰性溶剂中的酸)接触来获得酸加成盐。药学可接受酸加成盐实例包括以下盐：源自无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸单氢盐、磷酸二氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢碘酸盐或亚磷酸盐等；以及源自相对无毒的有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、酞酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还包括氨基酸的盐例如精氨酸盐等和有机酸例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如，Berge等，″Pharmaceutical Salts(药用盐)″，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些特殊缀合物既含有碱性官能团又含有酸性官能团，使得可将所述缀合物转化为碱加成盐或酸加成盐。

优选通过让所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体缀合物来再生缀合物的中性形式。缀合物母体形式在某些物理性质方面与各种盐形式不同，所述物理性质例如在极性溶剂中的溶解性，但除此外所述盐在用于本发明目的方面等同于所述缀合物的母体形式。

在实施例中使用阿伦膦酸的药学可接受盐。例示性所述盐为阿伦膦酸钠。因此，含有阿伦膦酸盐的缀合物可包含阿伦膦酸的钠盐。

术语″前药″指在体内转化为活性化合物(活性母体药物)的作用剂。前药通常用于促进给予母体药物。与母体药物比较前药亦可改进在药物组合物中的溶解性。通常还将前药用于实现在体内持续释放活性化合物。

本文所述缀合物可具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体和单独的异构体涵盖于本发明范围内。

本文所用术语″对映异构体″阐述仅通过彼此完全倒置/反映(镜像)就可相对于其对应物重叠的化合物的立体异构体。将对映异构体阐述为具有“偏手性”，因为他们彼此象左右手。除存在于其本身具有偏手性的环境(例如所有生命系统)外，在其它情况下对映异构体具有同样的化学和物理性质。

本文所述缀合物可以以非溶剂化物形式以及溶剂化物形式(包括水合物形式)存在。一般而言，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并包括在本发明范围内。

术语“溶剂化物”指化学计量不等的络合物(例如二-、三-、四-、五-、六-等)，其由溶质(本文所述缀合物)和溶剂形成，藉此溶剂不干扰所述溶质的生物学活性。合适的溶剂包括例如乙醇、乙酸等。

术语“水合物”指如上文所定义的其中溶剂为水的溶剂化物。

本发明某些缀合物可以以多晶型或非晶型形式存在。一般而言，对于涵盖在本发明中的用途所有物理形式都是等同的，其意欲落在本发明范围内。

当将本发明用于实践时，本发明人设计并成功实施了用于制备具有连接在其上的抗血管生成剂、骨靶向部分和任选标记物质的HPMA共聚物的新颖的方法。要注意合成所述聚合缀合物受到各种限制，这些限制由以下原因造成：待缀合的各部分的溶解性不同、缀合物最佳性能所需的理想结构特征复杂、反应物不相容等。因此，设计克服这些限制并被设计为获得表现出至少合理的性能的缀合物的方法高度有利。

因此，本发明实施方案的另一方面提供合成本文所述缀合物的方法，所述方法包括：

(a)使多个形成聚合物主链的单体单元共聚合，其中所述多个单体单元的一部分包含以第一反应性基团为终端的单体单元，所述多个单体单元的另一部分包含以第二反应性基团为终端的单体单元，因此获得包含包含多个主链单元的聚合物主链的共聚物，其中主链单元的一部分具有第一反应性基团，主链单元的另一部分具有第二反应性基团，所述第一反应性基团能够与抗血管生成剂起反应，所述第二反应性基团能够与二膦酸盐起反应；

(b)让该共聚物与抗血管生成剂或与其衍生物经由第一反应性基团反应，因此获得具有连接在其上的所述抗血管生成剂的共聚物；和

(c)让该共聚物与二膦酸盐或其衍生物经由第二反应性基团反应，因此获得具有连接在其上的二膦酸盐的共聚物，由此获得所述缀合物。

共聚物与抗血管生成剂的反应(b)可在共聚物与二膦酸盐骨靶向部分的反应(c)之后、同时或之前进行。

本文所述以反应性基团为终端的单体单元在本文中亦被称为功能化单体或功能化单体单元。

由共聚合形成的共聚物本文亦被称为功能化共聚物。

在某些实施方案中，可在形成聚合物主链并且未功能化的单体单元存在下实现共聚合。

本文所用″反应性基团″阐述能够与另一基团反应以形成化学键(通常共价键)的化学基团。任选形成离子键或配位键。

如果一个基团在化学上与应该如所期望连接在作用剂或部分上的反应性基团相容，就可以将其称为反应性基团。例如羧基为适于与以胺基为终端的作用剂或部分缀合的反应性基团，反之亦然。

反应性基团可固有地存在于形成主链单元的单体单元中，或借助于对其上的化学基团进行化学修饰在其内产生，或借助于让这些化学基团与间隔基或与以所需反应性基团为终端的接头连接在其内产生。

抗血管生成剂或骨靶向部分通常可借助天然分子和/或聚合物主链单元上已经存在的官能团与形成聚合物主链的单体单元或与共聚物主链单元连接，或另外通过合成有机化学中众所周知的方法引入而不改变所述作用剂的活性。

例如，骨靶向部分和抗血管生成剂可经由肽接头的末端羧基和位于骨靶向部分和/或抗血管生成剂的胺基之间的酰胺键与聚合物主链连接。或者，如以下实施例章节所证明，将官能团对-硝基苯酚基团(-ONp)加到经包含肽接头Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(即HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp)的HPMA共聚物这种聚合物上，激活接头的最后一个氨基酸(Gly)，由此使得骨靶向部分阿伦膦酸盐和抗血管生成剂紫杉醇经由与甘氨酸形成酰胺键与聚合物的连接更有效更容易(参见图2)。在某些实施方案中，骨靶向部分和/或抗血管生成部分在与功能化聚合物缀合之前被修饰，以便包括分别与功能化的共聚物的第一及第二反应性基团相容的反应性基团。

可借助让间隔基和/或接头与骨靶向部分和/或抗血管生成剂在其与功能化的共聚物缀合之前连接，来实现所述修饰。

因此，在某些实施方案中，所述方法进一步通过制备所述经修饰的骨靶向部分和/或抗血管生成剂来实现。

设计插入聚合物主链和缀合在其上的部分之间的接头和/或间隔基，以便表现出上文关于其所详述的性质。

用合适的聚合启动子和任选链转移剂通过本领域已知的任何聚合方法可实现不同单体单元的共聚合。所述合适的聚合启动子和链转移剂可易于为本领域技术人员所确认。

如以下实施例章节所证明，可经由两种方法实施共聚合：″经典″法-热聚合和″可逆加成-断裂链转移″(RAFT)聚合技术。

用RAFT方法使得可在室温实施共聚合。

为了经由可逆链-转移过程介导聚合，″可逆加成-断裂链转移″(RAFT)聚合技术通常涉及硫代羰基硫代(thiocarbonylthio)化合物，例如二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯、三硫代碳酸酯和黄原酸酯。这使得可利用具有低多分散性和高官能性的聚合物。

在某些实施方案中，在各自与其缀合之前可让反应性基团得到保护。在这些情况下，所述方法进一步包括在各自缀合之前对反应性基团去保护。

这使得可区域性控制例如抗血管生成剂与包含生物可降解接头的主链单元的缀合。

如上所述，设计本文所述缀合物以使在所需的身体位点(即骨相关疾病或病症位点)释放抗血管生成剂。因此，可通过接头基团经由直接连接或经由间接连接让抗血管生成剂和/或骨靶向部分与聚合物连接，藉此，在某些实施方案中，将所述直接/间接连接设计为在表征所需身体位点的条件下(例如由某些酶或pH)可裂解。

因此，在某些实施方案中，以第一反应性基团为终端的单体单元和/或以第二反应性基团为终端的单体单元，进一步包含以所述第一反应性基团或以所述第二反应性基团为终端的接头。

因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括在(a)之前让接头与单体单元的各自部分连接。

在某些实施方案中，所述接头如下构建：可通过让接头的第一部分与聚合物连接并让接头的第二部分与抗血管生成剂/骨靶向部分连接，藉此在抗血管生成剂/骨靶向部分与聚合物连接后，这两部分彼此连接由此形成接头。

在某些实施方案中，接头首先与抗血管生成剂/骨靶向部分连接，接着接头与聚合物连接。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括让本文所述间隔基与功能化的共聚物的主链单元连接，此后让抗血管生成剂和/或骨靶向部分与该间隔基偶联。或者，可让间隔基在与聚合物主链缀合之前首先与抗血管生成剂和/或骨靶向部分连接。

因此，在某些实施方案中，在抗血管生成剂和二膦酸盐中至少一种经由间隔基与聚合物主链和/或与接头连接的情况下，本文所述方法进一步包括在(a)之前让间隔基与单体单元的至少一个部分连接。

应该理解，设计用于让抗血管生成剂和/或骨靶向部分与聚合物偶联所用的间隔基和接头，是为了使各个部分平稳有效地缀合并使获得的缀合物具有最佳性能，其如上文所详述。

在聚合物和/或抗血管生成剂和/或骨靶向部分进一步包含接头的情况下，所述方法通过让间隔基与接头部分连接来实现。

在某些实施方案中，本文所述方法进一步包括在(a)之前让间隔基与抗血管生成剂和/或与二膦酸盐连接，因此获得抗血管生成剂和/或二膦酸盐的衍生物。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括让本文所定义标记物质与形成的缀合物连接。标记物质可与共聚合之前的功能化的单体单元连接或与形成的共聚物连接。

在某些实施方案中，让标记物质与共聚物在连接骨靶向部分的同时连接。或者，其可在连接骨靶向部分和/或抗血管生成剂之前或之后连接。

在本发明任一实施方案中所述的每一个缀合物，可进一步包括缀合在其上的另外部分。所述另外部分可在聚合物主链内或在聚合物主链各处与单体单元缀合，或可连接在聚合物主链的一端或两端。

所述另外部分可为本文所述标记物质或另外的靶向部分或另外的治疗活性剂，它们可改进所形成的缀合物的性能。

如上所述，本文所述缀合物包含使所述缀合物靶向骨和骨相关(类骨质)结构的骨靶向部分。由于缀合物的抗血管生成/抗增殖活性，它们可用于治疗骨和骨相关疾病和病症。

因此，本发明某些实施方案另一方面提供在需要治疗的受试者中治疗骨相关疾病或病症方法。这些方法通过给予受试者治疗有效量的任何本文所述缀合物来实现。

因此，本发明某些实施方案另一方面提供本文所述任何缀合物作为药物的用途。在某些实施方案中，所述药物用于治疗骨-相关疾病或病症。

根据本发明某些实施方案另一方面，确认本文所述缀合物用于治疗骨相关疾病或病症。

本文所用术语″方法″指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，所述方法包括但不限于化学、药理学、生物学、生化学和医学技术的从业人员已知的那些方式、手段、技术和程序，或这些从业人员易于从已知的方式、手段、技术和程序来开发的那些方式、手段、技术和程序。

短语″骨相关疾病或病症″阐述其中骨形成、沉积或再吸收异常的疾病或病症，尤其是特征在于过度生成血管的疾病或病症。短语″骨相关疾病或病症″包括发生在身体位点而不是从骨相关疾病或病症演变而来的骨中发生的疾病和病症，例如，在另一器官中的骨癌转移。骨-相关病症包括但不限于：骨癌和骨癌转移、因骨转移引起的骨质减少症、牙周病、风湿性关节炎关节周围的磨损、Paget氏病、恶性高血钙症、由骨转移产生的溶骨性病变、由癌症治疗引起的骨异常和骨肥大。

本文所用术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病症进展、基本上减轻病症的临床症状或美学症状或基本上防止病症的临床症状或美学症状出现。当可治疗的疾病为骨癌时，该术语应包括任何抑制肿瘤生长或转移或任何试图抑制、减慢或消除肿瘤生长或转移的努力。

本文应注意，由于缀合物选择性靶向骨组织，通过经由本文所述方法靶向抗血管生成剂，抗血管生成剂的毒性大大降低。因此，本文所述缀合物除了任选与其它药物联合用于临床上明显的疾病外，对于因残留的蛰伏癌症而处于复发风险的个体，这些缀合物可潜在地用作长期预防。例如，无毒靶向的缀合物在治疗处于骨肉瘤复发风险的无症状个体中的用途，可成为癌症治疗从目前方法中改变的主要范例，在目前方法中通常直到骨相关疾病例如骨肉瘤在临床上明显后才开始治疗。

本文所用术语″受试者″(或者本文称为″患者″)指成为治疗、观察或实验目标的动物，优选哺乳动物，最优选人。

如以下实施例章节所证明，本文所述某些实施方案的例示性缀合物紫杉醇和阿伦膦酸盐的HPMA共聚物(HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物)抑制血管生成以及细胞增殖，因此，可用于治疗特征在于病理性过量血管生成的骨相关疾病和病症，其中抑制血管生成和/或细胞增殖是有利的。

因此，在某些实施方案中，骨相关疾病或病症与血管生成有关。

肿瘤生长和转移特别依赖血管生成的程度。肿瘤血管生成是渗入癌肿瘤以便提供营养及氧并移去废物的血管网络的增殖，由此导致肿瘤生长。肿瘤血管生成涉及激素刺激和致癌基因激活、血管生成生长因子表达、血浆蛋白溢出、临时性的细胞外基质(ECM)沉积、ECM降解和内皮毛细管迁移、增殖和拉伸。因此，抑制更多的血管扩张是癌症治疗的主动研究的焦点。

如以下实施例章节所证明，当将本文所述某些实施方案的例示性缀合物-紫杉醇和阿伦膦酸盐的HPMA共聚物(HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物)给予罹患胫骨内注射的DA3鼠乳房癌的小鼠(用作浸润性肿瘤细胞迁向骨的模型)时，其能抑制37％肿瘤生长，而单独给予紫杉醇没有治疗作用(参见图11)。

因此，在某些实施方案中，骨相关疾病或病症选自骨癌转移和骨癌。

术语″癌症″和″肿瘤″在本文中互换使用，其阐述其中一群细胞表现出不受控制的生长(分裂超出正常限制)的疾病类型。术语″癌症″包括恶性和良性肿瘤以及从原发性或继发性肿瘤形成的疾病状态。术语″恶性肿瘤″阐述其生长不能自我限制、能够侵入到邻近组织并能扩散到远端组织(转移)的肿瘤。术语″良性肿瘤″阐述并非恶性(即不能以无限制的浸润性方式生长、不侵入周围组织和不转移)的肿瘤。术语″原发性肿瘤″阐述位于其开始产生的原始位点的肿瘤。术语″继发性肿瘤″阐述从其生长的原始(原发)位点扩散到靠近或远离原发位点的另一位点的肿瘤。

术语″骨癌″阐述从骨组织产生的肿瘤。本文所用术语″骨癌″进一步包括位于骨结构邻近组织中的肿瘤及与骨例如软骨、骨腔和骨髓有关的肿瘤。术语″骨癌″进一步包括从骨细胞演变的癌症(即原发性肿瘤)以及从位于骨的原发性肿瘤″挣脱″、″漏出″或″溢出″进入淋巴和/或血管的癌症细胞，其通过淋巴系统和/或血流循环在身体别处的正常组织内定居并增殖，由此形成继发性肿瘤。例如，可在肺及其它器官中经常发现源自骨肉瘤的转移。这些病灶产生类骨质，因此同样可用对骨矿物羟基磷灰石具有高亲和力的化合物(例如阿伦膦酸盐和其它二膦酸盐以及寡天冬氨酸盐)来靶向。

骨癌在手臂和腿骨中最常见，但其可发生在任何骨中。

骨癌也称为肉瘤。视肿瘤发展的骨组织的类型而定，有几种类型的骨肉瘤。可按照本发明实施方案治疗的骨癌的例示性类型包括但不限于：骨肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性巨细胞肿瘤和脊索瘤。

骨肉瘤是原发性骨癌的最常见类型，分类为恶性间叶瘤，其中肿瘤直接产生有缺陷的类骨质(不成熟骨)。它是富含血管并极有破坏性的恶性肿瘤，最常见于长骨的干骺端。推荐几种策略，例如基于免疫的治疗、肿瘤抑制剂或自杀基因疗法或在骨肉瘤不常用的抗癌药物[Quan等Cancer Metastasis Rev 2006；10：707-713]。然而，仍有三分之一的患者死于这种破坏性癌症，对于患有不能切除肿瘤的这些患者没有可治愈的系统疗法。

术语″骨转移″阐述从位于身体位点而不是骨的原发性肿瘤演变但转移到骨的癌症(即继发性肿瘤)。常转移或扩散到骨的癌症包括乳腺癌、肺癌、胸腺癌、前列腺癌、某些脑癌和肾癌。

例如，前列腺癌是工业国家最常见的男性癌症，是男性癌症死亡率的第二位原因。前列腺癌主要转移到骨，但其它器官位点包括肺、肝和肾上腺也受影响。晚期转移性疾病患者的骨转移发生率大约70％。骨转移与大量的骨骼病态有关，包括严重骨疼、病理性骨折、脊髓或神经根受压和恶性高血钙症。

如以下实施例章节所证明，本文所述某些实施方案的例示性缀合物-紫杉醇和阿伦膦酸盐的HPMA共聚物(HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物)，有效抑制人前列腺PC3细胞系(参见图10)，因此提示本文所述缀合物在治疗前列腺癌转移到骨中的用途。

如上所述，可进一步将本文所述缀合物用于监测骨相关疾病或病症。在这样的情况下，所述缀合物进一步包含本文所定义的用于用众所周知的成像技术方便地检测患者身体内的缀合物的标记物质。例如，在骨相关疾病或病症为骨癌的情况下，由标记物质信号水平来评估的缀合物的检测可起检测不同于骨的身体位点的骨癌转移的作用。

因此，本发明某些实施方案另一方面提供监测受试者的骨相关疾病或病症的方法。本发明这些实施方案的方法通过给予受试者任何本文所述缀合物来实现，所述缀合物具有本文所述与聚合物连接的标记物质，和采用用于监测缀合物在身体或其部分内分布的成像技术。

因此，本发明某些实施方案另一方面提供任何本文所述缀合物作为诊断剂和/或在制备用于监测骨相关疾病或病症的诊断剂中的用途，所述缀合物具有本文所述标记物质。

根据本发明某些实施方案的另一方面，确定包含标记物质的本文所述每一种缀合物用作诊断剂用于监测骨相关疾病或病症。

合适的成像技术包括但不限于：正电子放射断层扫描(PET)、γ-闪烁扫描、磁共振成像(MRI)、功能性磁共振成像(FMRI)、脑磁图(MEG)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机轴向断层(CAT)扫描、超声、荧光显微镜和常规X-射线成像。合适的成像技术的选择视标记物质的性质而定，其在本领域技术范围内。例如，若标记物质包含Gd离子，那么合适的成像技术为MRI；若标记物质包含放射性核素，则合适的成像技术为γ-闪烁扫描；若标记物质包含超声物质，则超声是合适的成像技术；等等。

本发明另一方面提供药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的任何本文所述缀合物和药学可接受载体。

因此，在本文所述任何方法和用途中，可将任何本文所述缀合物本身提供给个体，或作为药物组合物的部分在其中与药学可接受载体混合提供给个体。

本文所用″药物组合物″指一种或多种本文所述缀合物(作为活性成分)或其生理上可接受盐或前药与其它化学组分的制剂，所述其它化学组分包括但不限于：生理上合适的载体、赋形剂、润滑剂、缓冲剂、抗菌剂、膨胀剂(例如甘露醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸钠)、抗炎剂、抗病毒剂、化疗剂、抗组胺等。药物组合物的目的是促进将化合物给予受试者。术语″活性成分″指负责生物学效应的化合物。

可互换使用的术语″生理上可接受载体″和″药学可接受载体″，指对生物体不产生显著刺激并且不消除所给予的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。

本文术语“赋形剂”指加到药物组合物中以进一步促进给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、白明胶、植物油和聚乙二醇。

可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中发现用于调配和给予药物的技术，该书在此引作参考。

因此，可以以常规方式用一种或多种药学可接受载体调配符合本发明用途的药物组合物，所述载体包含赋形剂和助剂，它们有助于将所述化合物加工到可药用的制剂中。合适制剂视所选给药途径而定。剂量可视所采用剂型及所用的给药途径而变化。可由各医生根据患者病症选择准确的制剂、给药途径和剂量(参见例如Fingl等，1975，载于“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章第1页)。

可将药物组合物调配为用于一种或多种给药途径，这视局部或全身治疗或给药是否是首选的，及待治疗区域而定。可经口、通过吸入或胃肠外或局部给予(包括眼部、阴道、直肠、鼻内)，所述胃肠外给予例如通过静脉内滴注或腹膜内、皮下、肌肉内或静脉内注射。

局部给予的制剂可包括但不限于：洗剂、膏剂、凝胶剂、霜剂、栓剂、滴剂、液体制剂、喷雾剂和散剂。常规药物载体、水性、粉质或油性基质、增稠剂等可为必不可少的或合乎需要的。

用于口服的组合物包括散剂或颗粒剂、水性或非水性基质中的混悬剂或溶液剂、囊剂、丸剂、扁囊剂、胶囊剂或片剂。增稠剂、稀释剂、矫味剂、分散助剂、乳化剂或粘合剂可为合乎需要的。

胃肠外给予的制剂可包括但不限于无菌溶液剂，其亦可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。拟想将缓慢释放的组合物用于治疗。

当然，给予的组合物的量将视待治疗的受试者、痛苦的严重程度、给药方式、主治医生的判断等而定。

药物组合物可进一步包含另外的药用活性剂或非活性剂，例如但不限于抗菌剂、抗氧化剂、缓冲剂、膨胀剂、表面活性剂、抗炎剂、抗病毒剂、化疗剂和抗组胺剂。

根据本发明实施方案，上文所述药物组合物包装在包装材料中，并在包装材料里或表面用印刷物说明用于治疗骨相关疾病或病症的用途。

根据本发明另一实施方案，所述药物组合物包装在包装材料中，并在包装材料里或表面用印刷物说明用于监测骨相关疾病或病症的用途。

若需要，本发明组合物可存在于包装或分发装置中，例如FDA批准的药盒，其可含有一种或多种含活性成分的单位剂型。包装可例如包含金属或塑料薄片，例如泡罩包装。包装或分发装置还可附有给药说明书。包装或分发装置还可容纳与容器相联的通告，其采用管理药物制备、使用或销售的政府机构规定的形式，所述通告阐明所述机构批准的组合物的形式或人用或兽用给药形式。例如，所述通告可以是美国食品和药品监督管理局批准的用于处方药的标签或批准的产品插入物。

在本文所述的任何方法、用途和组合物中，本文所述缀合物可与另外的治疗活性剂联合使用。所述另外的活性剂包括作为非限制性实例的：化疗剂、抗血管生成剂、激素、生长因子、抗生素、抗微生物药物、抗镇静剂、免疫刺激剂和可提高缀合物的治疗效果和/或提高待治疗的受试者健康的任何其它作用剂。

本文所用术语“约”指±10％。

术语″包含″、″涵盖″、″包括″、″含有″、“具有”及其变化形式意即″包括但不限于″。

术语“由...组成”意即“包括并且限于”。

术语″基本由...组成″意即组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但必须另外的成分、步骤和/或部分不会大大改变所声明的组合物、方法或结构的基本特点及新的特点。

除非上下文明确指出不是这样，否则本文所用单数形式″一个″、″一种″和″该″包括复数提及物。例如，术语″一种化合物″或″至少一种化合物″可包括多种化合物，包括其混合物。

在整个说明书中，本发明各种实施方案可以以范围形式表示。应该理解，以范围形式说明仅为了方便简洁，不应该理解为对本发明范围的僵硬的限制。因此，应该认为范围的说明明确地公开了所有可能的亚范围以及该范围内的单个数值。例如，应该认为例如1-6的范围说明明确公开了亚范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的单个数值例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何范围宽度。

本文无论何时指定数值范围，意即包括所指定范围内的任何引用的数值(分数或整数)。本文互换使用短语“介于/介于(第一个指定数值与第二个指定数值)之间”和“从(第一个指定数值到第二个指定数值)/从(第一个指定数值到第二个指定数值)的范围”，意即包括所述第一个和第二个指定数值及在其间的所有分数和整数数值。

应该理解，为了清晰起见，在不同实施方案情况中阐述的本发明某些特点，亦可以以单个实施方案的组合来提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案情况中阐述的本发明不同特点，亦可以分别提供或以任何合适的亚组合或如合适以任何本发明其它所述实施方案来提供。除非没有这些要素实施方案就不可操作，否则不同实施方案情况中所述的某些特点不能认为对这些实施方案是必不可少的特点。

上文所述和以下权利要求章节描述的本发明各种实施方案和方面，在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在谈及以下实施例，它们与以上说明一起以非限制性方式阐明本发明。

材料和方法

材料

所有需要无水条件的反应都在氩气及氮气气氛下进行。

从聚合物实验室(Church Stretton，UK)获得纳入5摩尔％甲基丙烯酰基-Gly-Gly-对-硝基苯酚酯单体单元的HPMA共聚物-Gly-Gly-对-硝基苯酚(ONp)和纳入10摩尔％甲基丙烯酰基-Gly-Phe-Leu-Gly-对-硝基苯酚酯单体单元的HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp。HPMA共聚物-GFLG-ONp具有31，600Da的分子量和1.66的多分散性。

PTX和ALN购自Petrus Chemicals和Materials Ltd。

牛脾组织蛋白酶B、羟基磷灰石(HA)、组织蛋白酶B抑制剂(CA-074甲酯)和所有化学试剂(包括盐和溶剂)皆购自Sigma-Aldrich。

化学药品和溶剂为分析纯级别，或通过标注技术来纯化。

薄层色谱法(TLC)：硅胶板Merck 60F₂₅₄；通过用UV光照射和/或通过用磷钼酸溶液(乙醇中20％wt.)处理接着加热来使化合物显现。

快速色谱法(FC)：硅胶Merck 60(粒径0.040-0.063mm)，在括号中给出洗脱液。

¹H NMR：Bruker AMX 200或400仪器。以相对于TMS(δ＝0ppm)的δ来表示化学位移，耦合常数J以Hz表示。在室温中以CDCl₃作为溶剂记录光谱。

400目的铜筛购自SPI Supplies，West Chester，PA。

细胞培养

人脐带内皮细胞(HUVEC)购自Lonza，Switzerland。让细胞在EGM-2培养基(Lonza，Switzerland)中培养，在37℃、5％CO₂中生长。人前列腺细胞系PC3购自美国典型培养物保藏中心。在补充10％FBS、100μg/ml青霉素(Penicillin)、100U/ml链霉素(Streptomycin)、12.5U/ml制霉菌素(Nystatin)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中培养PC3细胞。让细胞在37℃、5％CO₂中生长。

表征HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物

测定ALN含量

让HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物(3.4、1.7和0.85mg)溶于0.8ml的0.2M高氯酸(HClO₄)和0.1ml的4mM FeCl₃混合物中。针对0-3mM ALN系列稀释的标定图来测定HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物中的ALN含量。在λ＝300nm处分光光度测量样品的吸收率。

定量评估HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物的流体力学直径和粒径分布

用实时颗粒分析仪(NanoSight LM20^TM)评估缀合物的平均流体力学直径，所述分析仪含固态单模式激光二极管(＜20mW，655nm)，配置所述二极管以发射精细定位的光束来通过500μL的样品室。让HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物溶于PBS到终浓度为2、1、0.5mg/ml。然后用注射器将样品注射到样品室中，使其平衡到单元温度(230℃)30秒。通过CCD照相装置以640x 480的分辨率以30帧画面/秒(fps)使粒子动力学显现60秒。用纳米粒跟踪分析(NTA)软件分析布朗运动下颗粒随时间采取的路径。单独测定每一颗粒的分散系数，并由此测定球体等效流体力学半径(sphere equivalent hydrodynamic radius)，产生粒径分布曲线。以一式三份对每一样品测量三次，结果表示为平均直径。

细胞增殖测定

将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)铺到含补充5％胎牛血清(FBS)的生长因子减少的培养基(EBM-2，Cambrex，USA)的24-孔板(1x 10⁴个细胞/孔)上。孵育(37℃；5％CO₂)24小时后用EGM-2(Cambrex，USA)置换培养基。将PC3细胞铺到含补充5％FBS的DMEM的96孔板(2x 10³个细胞/孔)上，孵育24小时(37℃；5％CO2)。孵育24小时后，用含10％FBS的DMEM置换培养基。用紫杉醇和ALN组合、紫杉醇-FK和ALN组合、单独用每一种药物和用HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物以系列浓度攻击细胞72小时。对照细胞在含或不含生长因子下生长。孵育后分别用库尔特计数器或用XTT对HUVEC和PC3计数。

毛细管样管形成测定

用基质胶基质(50μl/孔；BD Biosecience，USA)在冰上包被24-孔板表面，然后使其在37℃聚合30分钟。用紫杉醇和ALN组合、紫杉醇-FK和ALN组合、单用每一种药物和用HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物攻击HUVEC(3x 10⁴)，并在完全EGM-2培养基存在下将其接种在包被的板上。孵育(37℃；5％CO₂)8小时后，用装有NikonDS5冷却CCD照相机的Nikon TE2000E倒置显微镜以4X物镜亮视野技术给细胞成像。

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移测定

用包被10μg/ml纤维连接蛋白(Biological industries，Beit Haemek，Israel)的改良8μm Boyden chambers(Costar Inc.，USA)实施细胞迁移测定。用紫杉醇和ALN组合、紫杉醇-FK和ALN组合、单用每一种药物和用HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物攻击HUVEC(15x 10⁴个细胞/100μl)，将它们加到转移孔的上腔室孵育2小时，然后向血管内皮生长因子(VEGF)迁移。孵育后使细胞在下腔室存在或不存在VEGF(20ng/ml)时迁移4小时到腔室下侧。然后用Hema 3染色系统(Fisher Diagnostic，USA)固定细胞并染色。用装有Nikon DS5冷却CCD照相机的Nikon TE2000E倒置显微镜以10X物镜亮视野技术给染色的迁移细胞成像。用NIH图像软件从每片膜捕获的图像计数迁移细胞。将迁移标准化为迁移百分比，以100％代表不与任何药物孵育时的细胞的VEGF依赖性迁移。

通过组织蛋白酶B从HPMA-紫杉醇-FK-ALN酶释放紫杉醇及紫杉醇含量测定

通过牛脾组织蛋白酶B在模拟溶酶体细胞内药物释放条件下从HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN释放紫杉醇和ALN。HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN(7mg/ml的0.5mM紫杉醇-等同物)在37℃于磷酸盐缓冲液(0.1M磷酸钠、0.05M NaCl、1mM EDTA，pH 6)、还原性谷胱甘肽(5mM)和组织蛋白酶B(0.5μM)中孵育。在12、24和48小时后采取300μl等份试样。在0.2M Na₂CO₃/NaHCO₃，pH 9.8通过100％EtOAc提取游离紫杉醇。通过高压液相色谱(HPLC，AKTA^TMAmersham Biosciences，μBondapak^TM C 183.9x 150mm柱，Waters，30-100％乙腈的乙腈-水梯度，1ml/分钟，λ＝245nm)用未与组织蛋白酶B孵育并在同样条件下提取用于标定的紫杉醇标定曲线分析游离紫杉醇浓度。

羟基磷灰石结合测定

将HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物溶于磷酸盐缓冲盐水(PBSX1)，pH 7.4(1mg/ml)中。缀合物溶液(500μl)与羟基磷灰石粉末(15mg)在500μl PBS，pH 7.4中孵育。用HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly作为对照。以6000RPM将孵育样品离心3分钟，在选择的时间点从上层收集样品(100μl)。将使用HighTrap^TM脱盐柱的快速蛋白质液相色谱(FPLC，AKTA^TMAmersham Biosceinces)用于检测样品中未结合的缀合物(FPLC条件：AKTA^TM流动相100％DDW，2ml/分钟，λ＝215nm)。用AKTA^TM软件实施缀合物的羟基磷灰石-结合动力学分析。从色谱图计算每一时间点的曲线下面积(AUC)。将每一个羟基磷灰石-孵育的缀合物色谱图的AUC标准化为不存在羟基磷灰石的缀合物样品的AUC的百分比。

评估HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物体内的抗肿瘤活性

用5x10⁵mCherry-标记的DA3鼠乳房癌细胞胫骨内注射9只Balb/c雌性小鼠(每组n＝3只)。用游离ALN和PTX(1∶1.6，1.25mg/kg ALN和2mg/kg PTX)组合、等剂量的HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物或用溶媒(1∶1∶8克列莫佛EL∶乙醇∶盐水)腹膜内注射荷有肿瘤的小鼠。在注射肿瘤细胞10天后开始治疗。由CRI^TM Maestro非侵入式活体内成像系统监测肿瘤进展。结束时给胫骨称重并分析。将数据表示为平均值±平均标准误差(s.e.m.)。

统计方法

数据表示为平均值±SD。用不成对t-检验来测定统计显著性。认为p＜0.05为统计学显著。所有统计学检验都为双侧检验。

实施例1

合成HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物

图2A描绘了HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN(化合物1)的例示性通用合成。

制备化合物2：将L-Boc-Phe-ONp(104.3mg，0.27mM)溶于2ml二甲基甲酰胺(DMF)中。然后加入市购的L-Lys(alloc)-OH(62mg，0.27mM)和Et₃N(100μL)。将反应混合物搅拌12小时，同时用TLC(AcOH∶MeOH∶EtOAc 0.5∶10∶89.5)监测。在反应完成后，减压下除去溶剂，通过柱色谱在硅胶(AcOH∶MeOH∶EtOAc 0.5∶10∶89.5)上纯化粗产物，得到化合物2(107mg，83％)，为白色固体。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)：δ＝7.24-7.11(5H，m)；5.83(1H，m)；5.45-5.11(3H，m)；4.50-4.48(3H，m)；3.08-2.92(4H，m)；1.84-1.64(2H，m)；1.44-1.36(4H，m)；1.30(9H，s)ppm。

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ＝177.09，164.91，158.52，157.61，138.45，134.82，131.26，130.50，128.83，120.24，82.27，67.51，57.59，53.98，42.37，38.60，33.53，33.44，30.14，22.63ppm。

MS(FAB)：m/z：478.3[M+H]⁺，500.3[M+Na]⁺。

制备化合物3：将化合物2(832.1mg，1.74mM)溶于无水四氢呋喃(THF)中，让溶液冷却到-15℃，接着加入NMM(0.19ml，1.74mM)和氯甲酸异丁酯(0.27ml，2.09mM)。将反应搅拌20分钟，加入4-氨基苯甲醇(321.85mg，2.61mM)的无水THF溶液。将反应混合物搅拌2小时，用TLC(EtOAc 100％)监测。在反应完成后，减压下除去溶剂，通过柱色谱在硅胶(EtOAc 100％)上纯化粗产物，得到化合物3(835mg，82％)，为黄色固体。

¹H NMR(200MHz，MeOD)：δ＝7.56(2H，d，J＝8Hz)；7.29(2H，d，J＝8Hz)；7.21-7.07(5H，m)；5.86(1H，m)；5.29-5.10(2H，m)；4.83(2H，s)；4.49-4.46(4H，m)；3.17-3.08(4H，m)；1.88-1.70(2H，m)；1.44(4H，m)；1.34(9H，s)ppm。

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ＝174.08，171.45，158.61，157.79，139.17，138.87，138.03，134.79，131.12，130.71，130.49，129.90，129.08，122.15，82.71，67.48，66.83，58.08，55.74，42.09，39.84，32.70，31.31，30.16，24.31ppm。

MS(FAB)：m/z：583.3[M+H]⁺，605.3[M+Na]⁺。

制备化合物4：将化合物3(353.6mg、0.60mM)溶于无水THF中，让溶液冷却到0℃。然后加入二异丙基乙基胺(DIPEA；0.42ml，2.42mM)、PNP-氯甲酸酯(367mg，1.82mM)和催化量的吡啶。将反应混合物搅拌2小时，由TLC(EtOAc∶Hex 3∶1)监测。在反应完成后，减压下除去溶剂。用EtOAc稀释粗产物，并用饱和NH₄Cl洗涤。经硫酸镁干燥有机层，减压下除去溶剂。通过柱色谱在硅胶(EtOAc∶Hex 3∶1)上纯化粗产物，得到化合物4(453.2m，79％)，为白色固体。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)：δ＝8.26(2H，d，J＝8Hz)；7.64(2H，d，J＝8Hz)；7.40-7.34(4H，m)；7.22-7.14(5H，m)；5.83(1H，m)；5.24(2H，s)；5.18-5.06(2H，m)；4.56-4.37(4H，m)；3.19-3.05(4H，m)；1.95-1.73(2H，m)；1.59-1.46(4H，m)；1.39(9H，s)ppm。

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ＝174.11，171.51，158.63，157.60，157.46，154.36，147.32，140.70，137.91，134.76，131.75，131.53，131.08，130.78，129.17，127.21，123.72，122.05，119.61，82.86，72.65，67.50，58.17，55.84，41.95，39.71，32.42，31.40，30.16，24.27ppm。

MS(FAB)：m/z：770.4[M+Na]⁺。

制备化合物5：将化合物4(360.3mg、0.48mM)溶于无水二氯甲烷(DCM)中。然后加入紫杉醇(494.06mg、0.57mM)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(70.61mg、0.57mM)。将反应混合物搅拌8小时，由TLC(EtOAc 100％)监测。在反应完成后，减压下除去溶剂，通过柱色谱在硅胶(EtOAc 100％)上纯化粗产物，得到化合物5(662mg，94％)，为白色固体。

MS(FAB)：m/z：1463.7[M]，1486.9[M+Na]⁺。

制备化合物6：将化合物5(82.1mg，56.1μM)溶于1.5ml三氟乙酸酸(TFA)中，于0℃将溶液搅拌2分钟。减压下除去过量的酸，让粗胺盐溶于2ml DMF中。加入HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(198mg，ONp＝66.0μmol)，接着加入Et₃N(100μl)。将反应混合物搅拌12小时，减压下除去溶剂。粗产物无需进一步纯化用于下一步。

制备化合物7：让ALN(100mg，30.8μM)溶于水(1ml)。一边搅拌样品一边将粗化合物6(80mg，ONp＝最多26.6μmol)的DMF(350μl)溶液逐滴加入到该水溶液中，然后将NaOH(0.2M)滴入到该溶液中。pH值缓慢地上升到7。然后在1小时内pH再上升到8。此后反应混合物的pH值快速上升到9以终结反应。用含Sephadex LH20的XK26/70柱以FPLC柱色谱(MeOH 100％，1ml/l分钟)除去游离胺化合物6、ONp和ALN，得到化合物7，为白色固体(47mg)。

制备化合物1：让化合物7(47mg，alloc＝最多15.6μM)溶于DMF(1.5ml)中。然后加入乙酸(4.46μl，78μM)、Bu₃SnH(25.17μl，93.6mM)和催化量的Pd(PPh₃)₄。将反应混合物搅拌2小时，此后减压下浓缩，接着加入10ml丙酮。过滤掉沉淀，用丙酮洗涤几次。通过HPLC用含Sephadex LH20的XK26/70柱(MeOH 100％，1ml/l分钟)纯化粗产物，得到化合物1(32mg)，为白色固体。

定量评估HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物的粒径分布

于是，通过激光散射显微镜用纳米粒跟踪分析(NTA)技术(NanoSight LM20，Salisbury，UK)来表征多分散的纳米级HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物的流体力学直径和粒径分布。缀合物的平均流体力学直径为95nm(图2B)。

在备选合成途径中，用上文详述的RAFT方法制备HPMA共聚物-PTX-ALN缀合物，其如图2C所描绘。由RAFT方法制备的缀合物通常特征在于低PDI(例如低于1.4)。

实施例2

HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物与羟基磷灰石的结合

选择已知为对骨具有强亲和力的骨靶向部分二膦酸盐ALN为骨靶向部分。评估了缀合物与骨矿物的结合能力。用羟基磷灰石作为模拟骨组织的模型。用Hitrap脱盐柱实施体外羟基磷灰石结合测定和FPLC分析(图3A)。未结合的缀合物作为保留时间为2分钟的单峰洗脱。对应于洗脱的未结合缀合物的量的曲线下面积(AUC)减小与羟基磷灰石孵育时间相关。HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN被迅速吸附到羟基磷灰石。孵育5分钟后，溶液中43％的缀合物与羟基磷灰石结合(图3B)。与羟基磷灰石的这种快速结合率在孵育30分钟后到达约50％结合缀合物的平台。

实施例3

测定HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物中阿伦膦酸盐的装载

经由在高氯酸中的ALN和Fe³⁺离子之间形成发色络合物并用ALN标定图，分光光度测定ALN在HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物上的装载。发现HPMA共聚物的10摩尔％Gly-Phe-Leu-Gly-ONp链中的2.5摩尔％结合ALN。该百分比超过了先前所指出的靶向骨所需的量[参见Wang等2003，Bioconjugate Chem14：853]。

实施例4

通过组织蛋白酶B从HPMA-紫杉醇-FK-ALN酶释放紫杉醇并测定紫杉醇的装载

体外用在肿瘤和内皮细胞中过表达的组织蛋白酶B在37℃、pH5.5时于以下位点裂解HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物：(1)紫杉醇-六肽接头的两个酰胺键(在Gly-Phe-Leu-Gly和Phe-Lys氨基酸之间和在Phe-Lys和碳酸对氨基苯甲酯(PABC)之间)；和(2)ALN四肽接头(Gly-Phe-Leu-Gly)的酰胺键。组织蛋白酶B裂解产物为PABC-紫杉醇和ALN。通过自发的1，6-苯甲基消除(图1中示意显示)从PABC-紫杉醇获得终产物游离紫杉醇。在12、24、48小时和72小时后采取样品，用HPLC分析测定HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物中紫杉醇的含量。游离紫杉醇作为保留时间10.55分钟的单峰洗脱。AUC增加与组织蛋白酶B孵育时间相关(图4A和4B)。

同样用游离紫杉醇标定曲线测定聚合物上的紫杉醇装载。发现存在于HPMA共聚物中的10摩尔％的Gly-Phe-Leu-Gly-ONp链中4摩尔％与紫杉醇结合。

实施例5

HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN对HUVEC增殖的作用

作为评估紫杉醇和ALN与HPMA共聚物结合时是否保留其抗血管生成作用的尝试，实施了增殖、迁移和毛细管样管形成。

HUVEC增殖同样受到与紫杉醇/FK/ALN等同浓度的紫杉醇-FK+ALN组合和HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物的抑制，分别表现出约10nM和约2.5nM的IC₅₀(图5)。已知以1-100μM浓度表现出抗血管生成作用的ALN，当与紫杉醇或与紫杉醇-FK组合时在所测浓度(10μM-0.001nM)对HUVEC增殖没有另外的作用。单独的ALN仅在最高试验剂量6.25μM时抑制HUVEC增殖。单独的HPMA在体内和体外都无活性，这与先前发表的资料一致。

实施例6

不可裂解HPMA共聚物-GGGG-PTX与可用组织蛋白酶B裂解的HPMA共聚物-GGFK-PTX缀合物比较

为了证明HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物主要是通过组织蛋白酶B裂解而不是通过自发的水解释放PTX起作用，合成了含不可裂解的Gly-Gly(GG)接头的HPMA共聚物-GGGG-PTX缀合物(2D化学结构示于图6A中)，并与可裂解HPMA共聚物-GGFK-PTX缀合物(2D化学结构示于图6B中)比较。HPMA共聚物-GGGG-PTX缀合物以大约10，000nM的IC₅₀值抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖，也就是以比组织蛋白酶B裂解的(参见图6C)HPMA共聚物-GGFK-PTX缀合物(IC₅₀_100nM)高两个数量级的浓度来抑制。72小时后，观察到某些紫杉醇水解释放，这导致以高于100nM紫杉醇等同物的浓度抑制增殖。

这些发现进一步支持与HPMA共聚物结合的PTX-FK主要通过组织蛋白酶B裂解来释放的观点。

实施例7

组织蛋白酶B抑制剂降低PTX-FK和HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物的细胞毒性

为了进一步证明HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物主要是通过组织蛋白酶B裂解而不是通过自发的水解释放PTX起作用，在组织蛋白酶B抑制剂存在和不存在时实施HUVEC的增殖测定。如图7所示，用HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物和用游离PTX-FK+游离ALN组合分别以500nM和300nM的等同浓度来孵育HUVEC。48小时后，在存在或不存在组织蛋白酶B抑制剂时，HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物分别抑制约27％和约40％的HUVEC增殖。同样地，在有或没有组织蛋白酶B抑制剂时，PTX-FK+ALN相应地减少约25％和约50％的HUVEC增殖。

实施倒8

HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物体外对HUVEC迁向VEGF的影响

测定了HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物对HUVEC迁向血管内皮生长因子(VEGF)的能力的影响。HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物和游离PTX-FK+游离ALN组合，分别以100和60nM的等同浓度抑制大约35％的HUVEC迁向VEGF，如图8所示。

实施例9

HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物体外对HUVEC的毛细管样管形成的影响

业已证明游离及缀合的紫杉醇-FK-ALN通过抑制HUVEC增殖和迁移，具有抗血管生成潜力，测定了这些药物对HUVEC形成毛细管样管状结构的能力(参见图9A)。HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN和游离紫杉醇-FK+游离ALN组合分别以0.5和0.3nM的等同浓度，抑制约65％的HUVEC形成管状结构(图9B)。HPMA用作对照，对HUVEC形成管状结构的能力没有抑制作用。

实施例10

HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN对人前列腺细胞系PC3增殖的作用

有若干报道指出，PTX作为有效药物可用于治疗晚期转移性前列腺癌。评估了当与HPMA共聚物结合时保留的PTX和ALN对人前列腺PC3细胞系增殖的细胞毒活性。HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物和游离PTX-FK+游离ALN组合以等同浓度抑制PC3细胞增殖，表现出约10mM PTX-FK和约6μM ALN的IC₅₀(图10)。单独的PTX表现出1μM的IC₅₀。单独的ALN或当其与PTX或与PTX-FK组合时以0.01nM-10μM的测试浓度对PC3细胞增殖没有作用。

实施例11

HPMA共聚物-紫杉醇-FK-ALN缀合物在体内胫骨中抑制DA3乳腺肿瘤

用游离和缀合的ALN和PTX(1∶1.6，每天1.25mg/kg ALN和2mg/kg PTX)治疗在胫骨内荷有mCherry标记的DA3肿瘤的Balb/c雌性小鼠。测量肿瘤生长速率，并通过mCherry荧光信号用CRI^TM Maestro非侵入性活体内成像系统监测。游离PTX与ALN组合及HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物两种治疗都表现出抗肿瘤活性(参见图11A)。9天治疗后，用HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物治疗的小鼠中抑制37％的肿瘤生长，在用游离ALN和PTX治疗的小鼠中未观察到显著抑制(参见图11A)。HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物不引起重量减轻(参见图11B)。因为重量减轻与药物毒性有关，所以这些结果提示降低了缀合物毒性水平。

胫骨内注射DA3鼠乳房癌是模拟临床情景的极富侵略性的肿瘤模型，其中浸润性肿瘤细胞向骨例如胫骨迁移，并形成快速增长的转移。游离PTX对该肿瘤模型没有抗肿瘤作用。因此，用HPMA共聚物-PTX-FK-ALN缀合物治疗抑制37％的肿瘤生长是史无前例的结果。目前正在进行对小鼠中侵润性小些的标准肿瘤模型的体内研究。

尽管联合其特定实施方案阐述了本发明，但显然很多备选、修改和变化对本领域技术人员显而易见。因此，意欲涵盖落入附加权利要求精神和广泛范围内的所有所述备选、修改和变化。

本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请以其整体在本文中引作参考，引作参考的程度与每一个单独的出版物、专利和专利申请明确和个别地指出在本文中引作参考一样。另外，对本申请中的任何参考资料的引用或确认不应该理解为承认所述参考文献作为本发明的先前技术来使用。在使用章节标题程度方面，不应该理解为必要的限制。