大黄鱼脂肪细胞体外培养方法

摘要

本发明公开了一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包括以下步骤：1）取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；2）将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；3）将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；完全培养基为含20%胎牛血清培养液；4）原代培养：将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，可进行传代接种培养。使用本发明的方法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，具体涉及一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法。

背景技术

我国是世界上产量最大的水产养殖大国，养殖鱼类脂肪的过度蓄积已是当前困扰养殖业的主要问题之一。大黄鱼[Pseudosciaena crocea (Richardson)]是我国重要的经济鱼类，由于过量捕捞，产量急剧下降。1987年我国大黄鱼人工育苗获得成功，并在1994年开始人工养殖。但养殖大黄鱼体型差，鱼肉口感、营养价值远不及野生大黄鱼（段青源等，2000），因此无法满足市场“质”的需求，大量研究表明，脂肪的过度沉积是影响体型、口感的重要因素之一（缪伏荣等2008；徐继林等，2005）。而且养殖过程中因为脂肪大量沉积，脂肪肝的高发生率严重影响了养殖的经济效益（刘振勇等，2007；曾端等，2008），影响了大黄鱼养殖的可持续发展。因此如何改善大黄鱼肉质，降低脂肪的过多沉积是当前最具有现实经济意义的重大课题。要改善脂肪过多沉积的问题，首先要了解鱼的脂肪代谢和脂肪沉积的机制。

脂肪组织的形成是脂肪细胞增殖、分化和凋亡等过程综合作用的结果；当前体脂肪细胞过度增殖和分化，凋亡程度降低时，脂肪组织就会过度增长，从而造成水产品脂肪过多沉积，影响水产品的肉质品质。控制体脂沉积的实质就是降低脂肪细胞的数目和减小脂肪细胞的体积，也就是抑制前体脂肪细胞的增殖与分化，促进细胞凋亡进行；因此研究前体脂肪细胞的增殖、分化和凋亡及其控制机制，可以为控制体脂沉积提供理论依据。脂肪细胞体外培养这种方法已经成为研究脂肪沉积机制、脂肪细胞增殖与分化以及分化过程中分子事件和标志基因表达的有效手段。

关于脂肪细胞的培养，历史悠久，1961年，Hauner等首先进行小鼠脂肪细胞离体培养的实验工作（宋文华等，2006），20世纪80年代，Hausman首先采用SVF细胞，通过培养，就激素和生长因子对猪不同阶段的脂肪分化影响进行了研究，直到今天，脂肪细胞的培养主要集中在小鼠、畜类等哺乳动物上，在鱼中开展的相关工作较少。

2003年，Vegusdal等首次在体外成功培养了大西洋鲑的脂肪细胞，随后2006年，Oku等，进行了真鲷（Pagrus major）脂肪细胞的培养，2007年，刘茜在草鱼中做了脂肪细胞的培养，但是目前作为我国重要经济海产鱼类--大黄鱼的脂肪培养相关工作尚未见报道。大西洋鲑属于冷水性动物，其培养条件和温度无法直接应用于大黄鱼，真鲷是采用无血清培养技术，目前应用于大黄鱼有相当的困难，而草鱼属于淡水性草食鱼类，其生理状态和培养参数也无法直接利用于大黄鱼。 在这种前提下，研究大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，从而为研究大黄鱼脂肪代谢和脂肪沉积问题提供物质基础和有效手段就显得意义重大。

文中所用的参考文献如下：

1、Oku H, Tokuda M, et al. Effects of insulin, triiodothyronine and fat soluble vitamins on adipocyte differentiation and LPL gene expression in the stromal-vascular cells of red sea bream, Pagrus major. Comparative Biochemistry and Physiology, 2006, 144:326-33（Oku，Tokuda等，胰岛素，T3及脂溶性维生素对真鲷脂肪细胞分化及LPL基因表达的影响。 比较生理生化, 2006, 144:326-333）。

2、Vegusdal A, Sundvold H, et al. An in vitro method for studying the proliferation and differentiation of atlantic salmon preadipocytes. Lipids, 2003, 38:289-296.（Vegusda, Sundvold等，一种体外研究大西洋鲑前体脂肪细胞增殖分化的方法。脂肪，2003, 38:289-296. ）。

3、段青源，钟惠英等. 网箱养殖大黄鱼与天然大黄鱼营养成分的比较分析[J]. 浙江海洋学院学报，2000，19(2)：125-128。

4、缪伏荣，刘景等. 对不同养殖模式大黄鱼营养成分的比较[J]. 现代农业科学 2008，15（9）：72-74。

5、刘茜， 吉红，等. 草鱼脂肪细胞提取与保存的研究[J]. 水利渔业，2007，27（2）：7-8。

6、刘振勇，谢友佺等. 大黄鱼肝脏病变组织病理学观察[J]. 海洋水产研究，2007，28（5）：7-11。

7、宋文华，王贵，等. 脂肪细胞培养研究现状[J]. 动物医学进展， 2006，27（4）：46-51。

8、徐继林，朱艺峰等. 养殖与野生大黄鱼肌肉脂肪酸组成的比较[J]. 营养学报, 2005, 27(3)：256-258。

9、曾端，麦康森等. 脂肪肝病变大黄鱼肝脏脂肪酸组成、代谢酶活性及抗氧化能力的研究[J]. 中国海洋大学学报，2008，38（4）：542-546。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，使用该种方法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包括以下步骤：

1）、取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；

2）、将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；

3）、将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；所述完全培养基为含20%胎牛血清培养液；

4）、原代培养：将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。

作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的改进：待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，进行传代接种培养。

作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进：步骤2）的细胞分散处理包括以下内容：

A、将脂肪组织切成小块，用双抗PBS浸泡、冲洗；得冲洗后小块组织；

B、将冲洗后小块组织悬浮于0.2%胶原酶II消化液中，在22～28℃恒温摇床中消化0.8～1.2小时；上述0.2%胶原酶II消化液为按照0.2g胶原酶II与100ml的PBS相混合所得；

C、在步骤B所得物中加入与0.2%胶原酶II消化液同体积的完全培养基，以中和消化液；然后依次通过220～280μm尼龙膜和80～120μm尼龙膜，收集滤液；

D、将上述滤液离心，弃上清，加入PBS冲洗；得大黄鱼前体脂肪细胞。

作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进：步骤2）的B中：每1g的冲洗后小块组织悬浮于4～6ml的0.2%胶原酶II消化液中。

作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进：含20%血清培养基配方为：DMEM/F12培养基， 20%标准胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素， 3.7g/L NaHCO₃， 2mM L-glutamine。

作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进：步骤4）为：将细胞悬液在血细胞计数板上计数，以5×10⁴个细胞/cm²的密度接种于事先用鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，然后放在细胞培养箱中进行培养，培养条件为：25℃，5%（体积浓度）CO₂。

作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进：传代接种培养为：

①、待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，先用胰蛋白酶消化液在24～26℃下消化2～3min，然后用与胰蛋白酶消化液同体积的完全培养基终止消化， 1000rmp/min离心5min，得沉淀；将沉淀与完全培养基按照1：3的体积比进行传代接种培养；在此培养过程中，每2～3天更换一次完全培养基；

②、待细胞达到70～80%汇合时，重复上述步骤①。

与现有技术相比，本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法具有以下明显的优点：

1、本发明首次提出中国重要经济鱼类—大黄鱼脂肪细胞体外培养方法。

2、本发明根据大黄鱼的生理特征，摸索了最佳的脂肪细胞体外培养条件。

3、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行细胞培养的研究人员，比较顺利的完成大黄鱼脂肪细胞的体外培养。

4、本发明所述的培养条件和方法，能够使大黄鱼脂肪细胞顺利传代。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是接种1～11天时大黄鱼前体脂肪细胞形态观察示意图（在40倍的显微镜下所得）。

图2是接种1～11天时大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线。

图3是F1代和F10代分别接种4天后的大黄鱼前体脂肪细胞形态观察示意图（在40倍的显微镜下所得）。

图4是F1代和F10代分别接种4天后的大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线。

具体实施方式

以下实施例中所用的完全培养基均为含20%胎牛血清培养液；具体配方为：DMEM/F12培养基， 20%标准胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素， 3.7g/L NaHCO₃， 2mM L-glutamine。其制备方法如下：在80mlDMEM/F12培养基中加入20ml的标准胎牛血清、10000IU的青霉素、10000IU的链霉素、0.37g的NaHCO₃、L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺在所述含20%血清培养液中的浓度为2mM。

实施例1、一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次进行以下步骤：

1）、取大黄鱼腹腔腹壁脂肪组织：

取体重为300-500g大黄鱼，先用MS-222麻醉后，切断鳃弓，放血后击头至鱼死；在无菌条件下，剖开大黄鱼腹腔，取腹壁的脂肪组织。

2）、将上述脂肪组织经过细胞分散处理，依次进行以下步骤：

A、将脂肪组织切成1mm³左右的小块，用含双抗（100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素）的PBS缓冲液浸泡、冲洗；得冲洗后小块组织；

B、将冲洗后小块组织悬浮于0.2％胶原酶II消化液中，在25℃恒温摇床中消化1小时。冲洗后小块组织与0.2％胶原酶II消化液的用量比是：1g/5ml。0.2％胶原酶II消化液的制作方法如下：将0.2g胶原酶II与100ml的PBS缓冲液相混合；

C、步骤B的消化结束后，在步骤B所得物中加入与0.2％胶原酶II消化液同体积的完全培养基，以中和消化液；然后依次通过250μm尼龙膜和100μm尼龙膜，收集滤液；

D、将上述滤液1000rpm/min离心10min，弃上清，在所得的沉淀物中加入PBS缓冲液冲洗2次，得大黄鱼前体脂肪细胞。

3）、将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液，细胞密度在5×10⁵个/ml。

4）、原代培养：

将细胞悬液在血细胞计数板上计数，以5×10⁴个细胞/cm²的密度接种于细胞瓶中，此细胞培养瓶需事先用鼠尾胶蛋白包被，以增加细胞的贴壁能力；然后放在细胞培养箱中进行培养。培养条件为：25℃，CO₂浓度为5%（体积比）。从而培养成贴壁生长的脂肪细胞。

实施例2、一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，待实施例1的步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，进行传代接种培养，具体内容为依次进行以下步骤：

①、待原代培养的细胞达到70～80%汇合时，先用1ml胰蛋白酶消化液在25℃下消化2～3min，该胰蛋白酶消化液的制作方法如下：将0.25g胰蛋白酶与100ml的PBS缓冲液相混合配制成0.25%胰酶消化液。1瓶（为底面积是25cm²的培养皿）细胞用1ml胰蛋白酶消化液。

然后用与胰蛋白酶消化液同体积的完全培养基终止消化，1000rmp/min离心5min，得沉淀；将沉淀与完全培养基按照1：3的体积比进行传代接种培养；在此培养过程中，每2～3天更换一次完全培养基。

②、上述培养直至细胞达到70～80%汇合时，并铺满整个培养皿时，重复上述步骤①。

传到第十代的脂肪细胞仍能保持原有特性。

实验：为了证明本发明的方法确实能实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养，发明人作了如下的验证实验：

1.      大黄鱼前体脂肪细胞形态观察：

具体如图1所示。

2.      大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线：

具体如图2所示。

根据图1和图2，可以得出以下结论：

1）、应用本发明的方法可以顺利实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养，实现大黄鱼脂肪细胞的体外增殖；

2）、应用本发明的方法可以实现大黄鱼脂肪细胞的体外顺利传代，而且传到第十代的脂肪细胞仍能保持原有特性。

3、将实施例1步骤4）所得的脂肪细胞和后续的接种培养第十代所得脂肪细胞分别进行了如下鉴定：

1）、 大黄鱼前体脂肪细胞形态比较观察：

如图3所示。结果：细胞形态没有显著差异。

2）、大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线比较：

如图4所示。结果：细胞生长没有显著差异。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。