一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用

摘要

本发明公开了一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用。本发明提供的矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)，命名为LD29，菌种保藏号为CGMCCNo.4400。矢野口鞘氨醇杆菌LD29可在好氧条件下分别以菲、蒽、荧蒽和芘作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。另外，矢野口鞘氨醇杆菌LD29对混合多环芳烃也有降解效果，尤其对混合多环芳烃中五环的苯并[a]芘也产生了降解效果。本发明可用于多环芳烃污染土壤的修复和多环芳烃污染水体的修复，减少环境中多环芳烃含量，具有快速、方便、环保的优点，为多环芳烃污染的生物修复提供了新的微生物资源，对于环境治理具有重大价值，具有可观的经济效益与良好的社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，涉及一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称PAHs)是含有两个或两个以上苯环的芳香族碳氢化合物。常温下，纯的多环芳烃呈固态，其总体特征是高熔点、高沸点、低水溶性，多环芳烃的水溶性随着苯环数量的增加而降低，其生物可利用性和可降解性也随之降低，在环境中停留的时间长。

多环芳烃来自自然界和人类活动。多环芳烃是本来就存在于自然界中的一类有机物，可以通过某些藻类、植物及降解菌在好氧生长过程中合成，还可能是微生物在厌氧情况下降解大量有机物时产生多环芳烃，比如未开采的煤和石油中都含有大量多环芳烃，另一方面，有机物的不完全燃烧是产生多环芳烃污染的一个重要因素。自然环境中的多环芳烃对环境并未构成太大的威胁，而来自人类活动的多环芳烃的含量已经足以影响整个生态系统的安全。

随着人类活动的加剧，有毒有害物质对环境的污染日趋加重，其中多环芳烃就是一类典型的有害物质，因其具有致畸性、致癌性及致突变性而受到人们的广泛关注。多环芳烃在大气、水、土壤和植物中均有分布，虽然大气中的多环芳烃浓度不是很高，但其可以通过呼吸作用损坏动物的肺；水体中的多环芳烃通过大气中多环芳烃沉降，以及含多环芳烃污水的直接排放等方式进入水体当中，水体沉积物中的多环芳烃的含量是很高的；土壤中的多环芳烃主要来源于大气的颗粒沉降和降水降雪，还有一些来自油田和废弃的炼油厂的直接倾倒和排污；植物中的多环芳烃大部分来源于大气沉降，一些植物能吸收这类物质。多环芳烃广泛地分布在我们的生活环境中，对人体和环境都有很大的危害，因此，对多环芳烃污染的生物修复进行研究是非常具有实际意义的。

尽管多环芳烃能够经过吸附、挥发、光解、化学降解等方法去除，但生物降解是最重要的降解途径。目前，学者们已经分离出许多可以降解多环芳烃的微生物，其中细菌占主要地位。但是，以往降解芳烃的微生物大多都是针对低分子量的多环芳烃，对高分子量多环芳烃的降解效果不明显。因此，寻找降解高分子量(高环)多环芳烃降解菌是目前的热点问题。

发明内容

本发明的目的是提供一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用。

本发明提供的矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)，命名为LD29，分离自海南省海口市福山油田美台1号井出油口原油污染表层(＜2cm)沙质土，已于2010年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4400。矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)LD29CGMCC No.4400简称矢野口鞘氨醇杆菌LD29。

矢野口鞘氨醇杆菌LD29可用于降解有机芳香化合物。所述有机芳香化合物可为多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)。所述多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)具体可为菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘中的至少一种。

本发明还保护一种降解有机芳香化合物的制剂(菌剂)，它的活性成分为矢野口鞘氨醇杆菌LD29。所述有机芳香化合物可为多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)。所述多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)具体可为菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘中的至少一种。

矢野口鞘氨醇杆菌LD29可用于环境污染修复。所述环境污染可为有机芳香化合物污染。所述有机芳香化合物可为多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)。所述多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)具体可为菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘中的至少一种。所述环境为土壤或水体。

矢野口鞘氨醇杆菌LD29可在好氧条件下分别以菲、蒽、荧蒽和芘作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。另外，矢野口鞘氨醇杆菌LD29对混合多环芳烃也有降解效果，尤其对混合多环芳烃中五环的苯并[a]芘也产生了降解效果。本发明可用于多环芳烃污染土壤的修复和多环芳烃污染水体的修复，减少环境中多环芳烃含量，具有快速、方便、环保的优点，为多环芳烃污染的生物修复提供了新的微生物资源，对于环境治理具有重大价值，具有可观的经济效益与良好的社会效益。

附图说明

图1为矢野口鞘氨醇杆菌LD29对混合PAHs降解效果曲线图。

图2为不同葡萄糖浓度对矢野口鞘氨醇杆菌LD29降解荧蒽的影响柱状图；CK为不加葡萄糖母液的处理。

图3为不同氮素浓度对矢野口鞘氨醇杆菌LD29降解荧蒽的影响柱状图；CK为不加蛋白胨母液的处理。

图4为菲标准品的标准曲线。

图5为蒽标准品的标准曲线。

图6为荧蒽标准品的标准曲线。

图7为芘标准品的标准曲线。

图8为苯并[a]芘标准品的标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘的检测方法：

实验结束后，向每个试管中加10mL乙酸乙酯，涡旋30s。静置待水层与有机层分离，用移液管从上层有机层取1mL乙酸乙酯到干净的棕色玻璃瓶。55℃下用氮气流轻轻吹乙酸乙酯至完全挥发，再加入2mL乙腈溶解结晶的PAHs。用0.22μm孔径的有机相滤膜过滤乙腈溶液到另一干净的棕色玻璃瓶中，盖上盖。用安捷伦LC1200高效液相色谱仪测定多环芳烃浓度，采用Venusil MP-C18柱(粒径5μm，直径4mm，长度250mm，天津博纳艾杰尔科技)，流动相为乙腈和水；前5min内采用60％乙腈洗脱，在接下来的25min，进行梯度洗脱(60％乙腈→100％乙腈)，100％乙腈洗脱保持5min，共计35min。

菲标准品的标准曲线见图4，目标峰为自洗脱开始24.157±0.059min。

蒽标准品的标准曲线见图5，目标峰为自洗脱开始24.579±0.076min。

荧蒽标准品的标准曲见图6，目标峰为自洗脱开始25.801±0.055min。

芘标准品的标准曲线见图7，目标峰为自洗脱开始26.311±0.056min。

苯并[a]芘标准品的标准曲线见图8，目标峰为自洗脱开始29.700±0.060min。

实施例1、矢野口鞘氨醇杆菌LD29的分离与鉴定

一、样品的采集

2008年10月现场采集海南省海口市福山油田美台1号井出油口原油污染表层(＜2cm)沙质土。

二、矢野口鞘氨醇杆菌LD29的分离和筛选

采用水-硅油双相体系驯化多环芳烃降解菌，蒽的起始浓度为100mg/L。水相无机盐培养基(pH 7.5)：MgSO₄·7H₂O 0.2g，KH₂PO₄1.0g，K₂HPO₄1.0g，FeSO₄0.05g，CaCl₂0.02g，NH₄NO₃1.0g，NaCl 0.5g，去离子水1000mL。

经过若干代反复驯化，在NR固体培养基中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解能力，最后得到一株能够降解蒽、菲、芘、荧蒽的高效降解菌，将其命名为LD29。NR固体培养基(pH7.4～7.6)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，去离子水1000mL。

三、矢野口鞘氨醇杆菌LD29的鉴定

1、形态学鉴定

菌落呈规则圆形，黄色，表面湿润、光滑、突起，边缘整齐，不透明，质地粘稠。

2、生理生化鉴定

鉴定结果见表1。

表1菌株LD29的生理生化特征

  试验项目  结果  试验项目  结果  试验项目  结果 试验项目  结果  细胞形态  杆状  革兰氏染色  阴性  氧化酶  + 接触酶  +  对照  -  D-蜜二糖  +  p-苯乙醇酸  - L-组氨酸  -  a-环糊精  +  甲基葡糖苷  +  衣康酸  - 羟基脯氨酸  +  糊精  +  D-阿洛酮糖  +  a-氧代丁酸  - L-亮氨酸  +  糖原  -  D-棉子糖  +  a-氧代戊二酸  - L-鸟氨酸  -  Tween40  +  L-鼠李糖  +  a-氧代戊酸  - L-苯丙氨酸  -

  Tween80  +  D-山梨醇  -  D，L-乳酸  B L-脯氨酸  +  N-乙酰半乳糖胺  -  蔗糖  +  丙二酸  - L-焦谷氨酸  -  N-乙酰葡萄糖胺  +  D-海藻糖  +  丙酸  + D-丝氨酸  -  核糖醇  -  松二糖  +  奎尼酸  + L-丝氨酸  -  L-阿拉伯糖  +  木糖醇  -  D-己糖酸  - L-苏氨酸  -  D-阿糖醇  -  丙酮酸甲酯  +  葵二酸  - D，L-肉碱  -  D-纤维二糖  +  丁二酸一甲酯  -  丁二酸  + g-氨基丁酸  -  i-赤藓醇  -  乙酸  +  溴代丁二酸  + 尿刊酸  -  D-果糖  +  顺-阿康酸  -  琥珀酰胺酸  - 肌苷  -  L-果糖  -  柠檬酸  -  葡糖醛酰胺  - 尿苷  -  D-半乳糖  +  甲酸  -  L 丙氨酰胺  + 胸苷  -  龙胆二糖  +  D-半乳糖酸内酯  -  D-丙氨酸  - 苯基乙胺  -  a-D-葡萄糖  +  D-半乳糖醛酸  -  L-丙氨酸  - 腐胺  -  m-肌醇  -  D-葡糖酸  +  L-丙氨酰甘氨酸  + 2-氨基乙醇  -  a-D-乳糖  +  b-甲基葡糖苷  -  L-天冬酰胺  - 2，3-丁二醇  -  Lactulose  +  D-葡糖醛酸  -  L-天冬氨酸  - 甘油  -  麦芽糖  +  a-羟基丁酸  L-谷氨酸  + D，L-甘油磷酸盐  -  D-甘露醇  -  b-羟基丁酸  +  甘氨酰天冬氨酸  + D-葡糖-1-磷酸  -  D-甘露糖  +  g-羟基丁酸  -  甘氨酰谷氨酸  + D-葡糖-6-磷酸  -

3、16SrDNA鉴定

16SrDNA序列见序列表的序列1。

通过对菌株的形态、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定分析，将LD29鉴定为矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)。将矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobiumyanoikuyae)LD29保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为No.4400。矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)LD29CGMCC No.4400简称矢野口鞘氨醇杆菌LD29。矢野口鞘氨醇杆菌LD29的适宜生长条件为：pH＝7.5，温度30℃。

实施例2、矢野口鞘氨醇杆菌LD29对多环芳烃类化合物的降解

残留率＝培养后多环芳烃类化合物的含量÷接种前多环芳烃类化合物的含量×100％。降解效率＝(接种前多环芳烃类化合物的含量-培养后多环芳烃类化合物的含量)÷接种前多环芳烃类化合物的含量×100％。降解效率+残留率＝1。

水相无机盐培养基同实施例1。

挑取矢野口鞘氨醇杆菌LD29单菌落，在pH＝7.5的水相无机盐培养基中30℃培养2天，得到矢野口鞘氨醇杆菌LD29菌液。

一、矢野口鞘氨醇杆菌LD29对单一化合物的降解

1mL矢野口鞘氨醇杆菌LD29菌液接种至10mL含有50mg/L各种多环芳烃类化合物(菲、蒽、荧蒽或芘)的水相无机盐培养基中，在180r/min，30℃摇床中避光振荡培养，4天后测定多环芳烃类化合物的残留率，计算降解效率。

进行三次重复实验，结果取平均值。菲的降解效率为92％，蒽的降解效率为87％，荧蒽的降解效率为28％，芘的降解效率为7％。

二、矢野口鞘氨醇杆菌LD29对混合多环芳烃的降解

取6组试管，每组3支；每支试管中，将1mL矢野口鞘氨醇杆菌LD29菌液接种至10mL含有多环芳烃类化合物(含有菲、蒽、荧蒽和芘各100mg/L，苯并[a]芘10mg/L)的水相无机盐培养基中，在180r/min，30℃摇床中避光振荡培养，每天取样(每天取1组试管，结果为3支试管的平均值)，测定各种多环芳烃类化合物的残留率(见图1)。6天后计算降解效率。

矢野口鞘氨醇杆菌LD29对3环的菲和蒽有快速降解能力，第1天就有近11％的菲和45％的蒽被降解。6天后，3环的菲和蒽的残留量分别为0.5mg/L和38mg/L。4环的荧蒽和芘的残留量分别为41mg/L和52mg/L。第6天时，菲的降解效率为99％，蒽的降解效率为62％，荧蒽的降解效率为59％，芘的降解效率为48％，苯并[a]芘的降解效率为17％。说明矢野口鞘氨醇杆菌LD29可降解菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘组成的混合多环芳烃，并且对高分子量多环芳烃也有很好的降解效果。

实施例3、添加营养物质对矢野口鞘氨醇杆菌LD29荧蒽降解率的影响

水相无机盐培养基同实施例1，氮素浓度为350mg/L。

降解率＝(C₀-C₁)/C₀×100％。残留率＝C₁/C₀×100％。降解率+残留率＝1。

挑取矢野口鞘氨醇杆菌LD29单菌落，在pH＝7.5的水相无机盐培养基中30℃培养2天，得到矢野口鞘氨醇杆菌LD29菌液。

一、添加葡萄糖对矢野口鞘氨醇杆菌LD29荧蒽降解率的影响

1、用去离子水配置1000mg/L的葡萄糖母液(葡萄糖含量为1000mg/L)，115℃灭菌20min。

2、准备5个试管，其中4个试管分别加入0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL灭菌后的葡萄糖母液，然后向5个试管中分别加入荧蒽和灭菌的水相无机盐培养基，然后向每个试管中加入1mL矢野口鞘氨醇杆菌LD29菌液。5个试管的终体积均为10mL，荧蒽的终浓度均为100mg/L(C₀＝100mg/L)，葡萄糖终浓度分别为0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L。

3、试管倾斜置于摇床30℃、避光、180r/min振荡培养6d，检测荧蒽的浓度(C₁)。

进行三次重复实验，结果取平均值。残留率的检测结果见图2。没有添加葡萄糖时降解率为34％。随着葡萄糖浓度从0mg/L(CK)增加到200mg/L，矢野口鞘氨醇杆菌LD29对荧蒽的降解率也逐渐从34％增加69％，而在葡萄糖浓度为500mg/L的处理中，荧蒽的降解率反而比200mg/L处理的低。这说明在降解体系中添加适量葡萄糖，可以促进对荧蒽的降解，但葡萄糖的促进作用只能在一定浓度范围内递增，超过一定范围时则会出现抑制作用。

二、添加蛋白胨对矢野口鞘氨醇杆菌LD29荧蒽降解率的影响

1、称取0.138g蛋白胨(含氮量为14.5％)，溶于20mL去离子水中，得到蛋白胨母液(氮素浓度为1000mg/L)。

2、准备6个试管，其中5个试管分别加入蛋白胨母液，然后向6个试管中分别加入荧蒽和灭菌的水相无机盐培养基，然后向每个试管中加入1mL矢野口鞘氨醇杆菌LD29菌液。5个试管的终体积均为10mL，荧蒽的终浓度C₀均为100mg/L，氮素终浓度分别为350mg/L、360mg/L、370mg/L、400mg/L、450mg/L、500mg/L。

3、试管倾斜置于摇床30℃、避光、180r/min振荡培养6d，检测荧蒽的浓度(C₁)。

进行三次重复实验，结果取平均值。残留率的检测结果见图3。没有添加蛋白胨时降解率为34％。添加氮素蛋白胨可以促进矢野口鞘氨醇杆菌LD29对荧蒽的降解，随着氮素浓度从350mg/L增加到400mg/L，矢野口鞘氨醇杆菌LD29对荧蒽的降解率从34％快速增加到81％，而后氮素的增加反而对荧蒽的降解起到抑制作用。