己酮可可碱在制备预防或治疗功能性便秘的药物中的用途

摘要

本发明属于医药领域，具体涉及己酮可可碱的一种新用途，特别涉及己酮可可碱在制备预防或治疗功能性便秘的药物中的用途。为此，本发明提供了一种治疗功能性便秘的含有己酮可可碱的药物组合物，通过试验惊奇地发现己酮可可碱在改善功能性便秘方面具有预料不到的效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及己酮可可碱的一种新用途，特别涉及己酮可可碱在制备预防或治疗功能性便秘的药物中的用途。

背景技术

磷酸二酯酶(PDE)具有水解细胞内第二信使环磷酸腺苷(cAMP)或环磷酸鸟苷(cGMP)的功能，降解细胞内cAMP或cGMP，从而终结这些第二信使所传导的生化作用。cAMP和cGMP对于细胞活动起着重要的调节作用。而其浓度的调节主要由核苷酸环化酶的合成和磷酸二酯酶(PDE)水解作用之间的平衡决定。PDE在人体内分布广泛，生理作用涉及多个研究领域。近年来，PDE作为新的治疗靶点，引起了众多学者广泛的关注，成为一个新的研究热点。

磷酸二酯酶抑制剂是一个多基因大家族，是抑制磷酸二酯酶活性的药物。磷酸二酯酶抑制剂是可以抑制组织中cAMP和cGMP降解的化合物，PDE抑制剂包括非特异性PDE抑制剂和特异性PDE抑制剂，特异性PDE抑制剂仅能够抑制一种类型的PDE，对其他类型则几乎没有作用。非特异性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂包括茶碱、氨茶碱、己酮可可碱、帕吉维林和咖啡因等。

茶碱是茶中所含的白色不定形的结晶状生物碱，为可可碱的异构体，作用和结构都类似咖啡碱。属于磷酸二酯酶，能使细胞cAMP含量提高，具有松弛平滑肌、兴奋心脏肌以及利尿的作用。氨茶碱是国内应用最广泛的茶碱与乙二胺的复盐制剂，临床上已经使用多年。氨茶碱比茶碱水溶性高，易于溶解和吸收。但氨茶碱碱性较高，局部刺激性大，口服易致恶心、呕吐、食欲下降等胃肠道反应。帕吉维林是一种骨骼肌松弛药。咖啡因是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱，适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。

己酮可可碱是从可可豆中提取的可可豆碱、再引入已酮基而得到的一种生物碱，分子式为C₁₃H₂₀N₄O₃，化学名称为3，7-二甲基黄嘌呤，是甲基黄嘌呤衍生物，是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂。PTX可增加红细胞的变形性，改善白细胞的血流变特征，抑制嗜中性粒细胞的黏附和激活；扩张微血管；降低血液粘滞度；增加组织氧分压；有抗炎作用；可消除自由基。60年代，PTX仅用于末梢循环障碍的治疗；后作为一种血管扩张药，被用于治疗血管性疾病，已有10余年的历史；还用于动脉硬化、血管栓塞、糖尿病性血管病变、冻疮、静脉溃疡等外周血管疾病的治疗。70年代，开始用于男性不育，体外刺激精子活力的治疗，疗效显著。此外，对内耳循环障碍性疾病有效，可抗肝纤维化，对肾、肺等有保护作用。PTX在小肠内吸收良好，其在血浆中的半衰期为30min；主要在肝脏中去甲基及氧化代谢，主要以3-甲基嘌呤及7-甲基嘌呤两种形式排出。

慢性便秘是一种常见的症状，其病因复杂，给患者带来许多苦恼，严重影响患者的生活质量。随着社会发展，生存压力增加、竞争激烈，以及饮食结构等生活习惯的改变，便秘的发生率成上升趋势。

国际上有关功能性胃肠病，包括便秘，在诊断、病理生理学以及治疗方面于1994年推出了罗马I标准，2000年推出了罗马II标准。国际上对便秘的概念以罗马II标准为通用标准。即便秘是指粪便干结、排便困难或排便不尽感和排便次数减少。

从病因学上慢性便秘可以分为器质性便秘和功能性便秘。器质性便秘主要是由于器质性病因引起的便秘，慢性便秘的器质性病因主要有胃肠道疾病(肠道肿瘤、先天性巨结肠等)、肛周疾病(直肠脱垂、直肠前突)、神经系统疾病(多发性硬化、帕金森病、脑卒中、脊髓损伤及周围神经病变)、内分泌或代谢性疾病(糖尿病肠病、甲状腺功能低下、甲状旁腺疾病)和精神病，同时还应排除药物性因素(阿片类药物、抗胆碱药、抗抑郁药、钙通道拮抗剂、抗酸剂、铁剂、抗腹泻药、利尿剂、抗组胺药等)引起的便秘。

功能性便秘是排除器质性病因及其他因素导致的便秘，并符合以下标准：在过去的12个月中，持续或累积至少12周有以下两个或两个以上症状：(1)1/4时间排便费力；(2)1/4时间粪便是呈团块状或坚硬；(3)大于1/4时间排便不尽感；(4)大于1/4时间肛门有阻塞感或排出困难；(5)大于1/4时间排便时需用物协助(支持盆底肌阻碍)；(6)每周排便小于3次。根据排便困难发生部位和动力障碍，功能性便秘一般分为三种类型：慢传输型便秘(STC)、出口梗阻型便秘(OOC)和混合型便秘(MIX)。STC是功能性便秘的常见的类型，约占40％，而OOC则在多发生在儿童、妇女和老年人。STC与结肠运动障碍有关，在曼谷胃肠动力疾病新分类中，明确肠神经病、肠肌病、帕金森病、内分泌疾病或脊髓损伤等可导致结肠传输延迟，成为STC。慢传输型便秘患者肠道Cajal间质细胞(ICC)数量减少、体积缩小，故可认为ICC减少是慢传输型便秘肠道组织细胞学的主要特点。c-kit为一种原癌基因，位于5号染色体w位点上，它编码kit受体，后者属酪氨酸激酶膜受体。在ICC表达均表达c-kit，并且ICC能过kit受体接受各种信号，如果阻断kit受体，不但ICC发育受到影响，而且其功能也将丧失，故ICC有无c-kit表达与肠道动力密切相关，因此可以利用c-kit抗体标记识别ICC。OOC则与肛门括约肌功能协调或直肠对排便反射感阈值异常有关，患者常主诉排便费力、肛门下坠感、排便不尽感、排便量少、质地较硬或成形软便。混合型便秘是具备上述两个特点。由于各种类型便秘发病机制不同，所以应重视和详细分析患者对便秘的自身感受特点，初步进行分型，采取相应治疗措施。

功能性便秘特殊的病变部位和发病机制使临床治疗非常困难，目前常用的便秘治疗药物疗效不理想：或治疗时间过长，或无效，或排出少量稀便，或不良反应大以致患者难以接受。目前临床上采用非药物治疗和药物治疗，严重者甚至需要进行外科手术治疗。

采用非药物治疗，如排便方式的指导、饮食等生活习惯的改变和生物反馈治疗等，大都需要经过较长的时间才能够缓解，很多患者因个人因素难以坚持下去。

治疗便秘的主要药物有刺激性泻药、润滑性泻药、容积性泻药以及渗透性缓泻剂和促动力药物等。刺激性泻药作用强而迅速，多用于大便嵌塞和需迅速通便患者，不宜长期应用，因其刺激肠黏膜和肠壁神经丛，提高黏膜通透性，影响了肠内水、电解质和维生素吸收以至紊乱，还可致大肠肌无力，形成用药依赖性和大便失禁；容积性泻药可以增加大便的容量，但不能有效地增加结肠张力，肠道运动迟缓者使用受限；润滑性泻药口感差，作用弱，长时间使用可以引起脂溶性维生素吸收障碍、肛周油质渗漏等不良反应；渗透性缓泻剂例如乳果糖，不在小肠内吸收，他们通过结肠细菌分解并释放有机酸而在结肠内产生作用，存在腹胀或腹痛以及长期应用疗效差和易引起肠道菌群改变等缺点；而肠动力药物常常需要联合其他药物使用，副作用也较大。

对于占功能性便秘50％以上的出口梗阻型便秘，肛门内外括约肌的持续痉挛和压力升高是其主要的病理生理改变之一。目前主要是采取手术、生物反馈等治疗方法对其进行治疗，通过降低肛门括约肌的压力，从而缓解其肛直肠出口的梗阻症状。治疗手段虽多，但疗效却不能令人满意。手术治疗时间长、创伤大，且可能出现肛门失禁、复发等并发症。而生物反馈治疗常需长期、反复治疗，疗效不确定。近年来，人们开始考虑使用各种药物降低肛门括约肌的压力，从而达到治疗出口梗阻型便秘的效果。

发明内容

本发明提供了己酮可可碱在医药领域的一种新的用途，具体涉及己酮可可碱在制备预防或治疗功能性便秘的药物中的应用。己酮可可碱作为一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，主要用于血栓闭塞性脉管炎、脑血管障碍、血管性头痛、末梢血管病、耳蜗扰乱症、冻疮及缺氧所产生的痛症。虽然己酮可可碱在临床上使用会引起便秘、口干等不良反应，但是经过试验研究，发明人惊奇地发现己酮可可碱在治疗功能性便秘方面表现出预料不到的效果。

现有技术没有对己酮可可碱在治疗功能性便秘上的研究，本发明通过试验研究惊奇地发现己酮可可碱在改善功能性便秘方面具有预料不到的效果。表明己酮可可碱可以作为治疗功能性便秘的药物使用。

由于临床上对于功能性便秘的治疗尚无理想的药物，本发明提供了治疗功能性便秘的药物组合物，它由己酮可可碱和赋形剂组成。己酮可可碱和赋形剂可以根据常规制剂技术制备成局部外用制剂或口服制剂，其中局部外用制剂优选适合肛门直肠给药的局部外用制剂，比如喷雾剂、气雾剂、栓剂、凝胶剂、乳膏剂、霜剂、软膏剂、溶液剂、乳胶剂和脂质体制剂；口服剂型优选片剂、肠溶衣片、胶囊、滴丸、颗粒剂、散剂和口服液。

上述药物组合物局部外用制剂中的赋形剂选自半合成脂肪酸甘油脂、卡波姆、三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、液体石蜡、单硝酸甘油脂、对羟基苯甲酸、动植物油、凡士林、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、硅酸、硬脂酸铝、丙二醇、羊毛脂、蜂蜡、滑石粉和氧化锌中的一种或多种；喷雾剂赋形剂选自乳糖、滑石粉、丙三醇、氯化钠和尿素中的一种或多种，还可以含有常用的推进剂，例如氯氟烃和/或挥发性非取代烃，挥发性非取代烃优选丁烷和丙烷。外用搽剂或滴剂可用水性或油性基质来配制，可以按照常规制备方法进行制备。

上述药物组合物局部外用制剂的赋形剂中还可以包含一种或多种防腐剂，例如醋酸洗必泰和苯扎溴铵等；外用制剂可在无菌条件下将己酮可可碱与赋形剂混合，优选地，它还含有推进剂。

上述药物组合物局部外用制剂优选透黏膜药物剂型，它可用黏膜粘附性聚合物来配制，从而延缓有效成分在肛门黏膜内的释放。透黏膜药物剂型可与黏膜保持接触，同时迅速崩解和/或溶解，从而引起局部性或全身性的吸收。透黏膜药物传递可使活性物质有效进入全身循环，并减少肝和小肠壁菌群对药物的立即代谢。

本发明还对己酮可可碱在局部外用制剂中的重量百分含量进行了优选。优选地，己酮可可碱在局部外用制剂中的重量百分含量为0.1％-10％。

上述药物组合物口服制剂中的赋形剂可以选自稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂中的一种或多种；其中稀释剂选自淀粉、糊精、乳糖和微晶纤维素中的一种或多种；润湿剂和粘合剂选自水、乙醇、羟丙基甲纤维素、乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠和交联聚维酮中的一种或多种；润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸锌和微粉硅胶中一种或多种。上述口服制剂均按照常规制剂技术进行制备，比如干法制粒、湿法制粒等。

本发明还提供了将上述药物组合物应用到功能性便秘的治疗方法。可以给与患者口服上述有效量的药物组合物，或者向患者的相应直肠肛门区或患病肛门组织，例如外肛或内肛组织或肛道给予有效量的上述各种药物组合物。本发明优选向功能性便秘患者的直肠肛门区直接给与有效量的上述药物组合物，即优选己酮可可碱的局部外用制剂，包括栓剂、气雾剂和软膏剂等。局部外用制剂在给药之前，应当将肛门区清洗干净，这样将利于药物在直肠黏膜的吸收。

己酮可可碱治疗功能性便秘的对象包括人或动物。己酮可可碱的具体剂量取决于许多因素，这些都是本领域技术人员所熟知的。例如具体的药物剂型，所治疗对象、病情、年龄、体重和接受者的临床情况。给药剂量的范围根据所用的己酮可可碱、给药途径等存在下列不同：

(1)成年人，口服制剂包括片剂、胶囊、肠溶衣片、滴剂、颗粒剂、散剂、口服溶液，按照己酮可可碱的量计，口服剂量为0.05g-0.60g/次，每日1-3次；局部外用制剂包括喷雾剂、栓剂、凝胶剂、乳膏剂、霜剂、软膏剂、溶液剂、乳胶剂和脂质体制剂，按照己酮可可碱的量计，外用剂量同口服制剂。用药时间具体根据临床症状及其症状的缓解程度而定。

(2)儿童，口服制剂包括片剂、胶囊、肠溶衣片、滴剂、颗粒剂、散剂、口服溶液，按照己酮可可碱的量计，口服剂量为0.01-0.30g/次，每日1-3次；局部外用制剂包括喷雾剂、栓剂、凝胶剂、乳膏剂、霜剂、软膏剂、溶液剂、乳胶剂和脂质体制剂，按照己酮可可碱的量计，外用剂量同口服制剂。用药时间具体根据临床症状及其症状的缓解程度而定。

(3)3岁以下的幼儿，动物包括猪、狗、羊、牛、虎等，口服制剂或局部外用制剂的有效剂量可以按照儿童用药量进行适当的调整，这对于本领域的技术人员来说是容易做到的。

本发明还提供了将上述含有己酮可可碱的药物组合物治疗功能性便秘的试验研究。本发明通过实施例11小鼠皮下注射吗啡诱导建立了慢传输型便秘小鼠模型，记录小鼠粪便重量，利用活性炭灌胃法试验比较实验组与对照组小鼠结肠传输功能；利用免疫组化技术计算c-kit阳性细胞面积比较两组小鼠结肠组织中Cajal细胞(ICC)数量。给药后，模型对照组小鼠粪便减少，肠道推进力减弱(首粒黑便排出时间延长)，肠道ICC数量减少(c-kit阳性细胞面积减小)，与正常组差异显著。给药非选择性磷酸二酯酶抑制剂己酮可可碱、茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林后，结果发现己酮可可碱治疗组(包括片剂组和栓剂组)小鼠日均排便量增加，小鼠肠道推进力增强，肠道ICC数量增加。研究表明，己酮可可碱在改善慢传输型便秘的症状方面具有预料不到的效果，其它非选择性磷酸二酯酶抑制剂如茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林在治疗功能性便秘时效果远远不如己酮可可碱。另外，本发明还惊奇地发现，与己酮可可碱片剂组相比，己酮可可碱栓剂组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit阳性细胞面积均具有显著性差异(p＜0.05)，这表明己酮可可碱直肠黏膜直接给药治疗慢传输型小鼠便秘的效果还优于己酮可可碱口服给药。

本发明还通过实施例13己酮可可碱对洛哌丁胺诱导的便秘大鼠直肠黏膜黏液的影响，表明洛哌丁胺诱导的便秘大鼠肠黏膜上皮黏液较正常大鼠明显减少，给药己酮可可碱后大鼠肠黏膜上皮黏液明显增多，且具有显著性差异；并且与己酮可可碱灌胃组相比，己酮可可碱外用组大鼠肠黏膜上皮黏液明显增多，且具有显著性差异(p＜0.05)，这表明直肠给药对于增强肠黏膜功能效果更加明显。

对于占功能性便秘50％以上的出口梗阻型便秘，肛门内外括约肌的持续痉挛和压力升高是其主要的病理生理改变之一。本发明通过实施例12研究表明，己酮可可碱治疗组的肛直肠静息压、最大自主收缩压和直肠肛门抑制反射值明显下降，说明其有效地降低了肛门括约肌的肌张力，达到了松弛肛门括约肌的效果。病理组织学切片观察发现，己酮可可碱治疗组的肛门括约肌纤维有一定程度的萎缩。己酮可可碱能有效降低肛门括约肌的压力，为临床治疗慢性出口梗阻型便秘提供了新的方法和思路，值得进一步研究。

正常结肠黏膜杯状细胞的分泌液富含黏蛋白，黏蛋白与水结合形成黏液，构成黏液保障，对黏膜起到机械性保护作用。黏液分泌的减少是结肠功能衰弱的表现，或固水能力减少，或细胞黏蛋白分泌减少。本发明通过给药己酮可可碱，惊奇地发现己酮可可碱在改善结肠功能，增加肠黏膜黏液正常分泌方面具有意想不到的效果。可见，己酮可可碱治疗功能性便秘，不仅仅在改善功能性便秘症状上，并且能显著改善肠黏膜的功能，从而有可能实现功能性便秘的显著改善。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。

(一)己酮可可碱的药物制剂部分

实施例1栓剂的制备

己酮可可碱                    45g

聚山梨酯80                    5g

甘油                          3000g

明胶                          900g

纯化水                       加至4500g

制备工艺：

称取处方量的明胶，置器皿中加入适量的纯化水，放置1h左右，使其溶胀变软，然后加入处方量甘油后置水浴上加热，使明胶溶解，继续加热并搅拌；取已酮可可碱、聚山梨酯80混匀后加入已制好的甘油明胶溶液中，搅拌均匀后，趁热灌入已涂好润滑剂的栓模中，冷却，削去模口上溢出的部分，脱模，质检、包装，共制100粒。

实施例2栓剂的制备

己酮可可碱                    50

半合成脂肪酸甘油脂            4500g

甘油                          400g

聚山梨酯80                    50g

制备工艺：

取半合成脂肪酸甘油脂置器皿中，水浴加热融化，待温度降至50℃左右，加入甘油、聚山梨酯80，搅拌均匀，加入己酮可可碱，搅拌均匀，搅匀后注入涂有润滑剂的栓模中至稍溢出模口为度，冷却，凝固后削去溢出部分，脱模，质检，包装，共制100粒。

实施例3栓剂的制备

己酮可可碱                    50g

聚乙二醇4000                  2450g

聚乙二醇1000                  2450g

甘油                          50g

制备工艺：

取聚乙二醇4000和聚乙二醇1000置器皿中，水浴加热融化，待温度降至50℃左右，加入甘油，搅拌均匀，加入己酮可可碱，搅拌均匀，搅匀后注入涂有润滑剂的栓模中至稍溢出模口为度，冷却，凝固后削去溢出部分，脱模，质检，包装，共制100粒。

实施例4栓剂的制备

己酮可可碱                500g

聚乙二醇4000              2250g

聚乙二醇1000              2200g

甘油                      50g

制备工艺：

取聚乙二醇4000和聚乙二醇1000置器皿中，水浴加热融化，待温度降至50℃左右，加入甘油，搅拌均匀，加入己酮可可碱，搅拌均匀，搅匀后注入涂有润滑剂的栓模中至稍溢出模口为度，冷却，凝固后削去溢出部分，脱模，质检，包装，共制1000粒。

实施例5凝胶剂的制备

己酮可可碱                10g

卡波姆                    10g

丙二醇                    60ml

甘油                      50ml

三乙醇胺                  适量

纯化水                    加至1000g

制备工艺：

将卡波姆缓慢加入到处方量50％左右的水中，边加边搅拌直至形成透明的凝胶基质，将己酮可可碱溶于适量水中，再加入基质中，搅拌均匀，加入丙二醇、甘油、纯化水至全量，三乙醇胺调节PH值至中性，即得。

实施例6乳膏剂的制备

己酮可可碱                20g

单硬脂酸甘油酯            48g

硬脂酸                    120g

白凡士林                  100g

三乙醇胺                  15g

尼泊金乙脂            3g

十二烷基硫酸钠        12g

甘油                  18g

纯化水                加至1000g

制备工艺：

按处方量取单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、三乙醇胺水浴加热至熔化，混匀，作为油相。另外取适量的纯化水，将己酮可可碱溶解到水中。

取甘油、十二烷基硫酸钠、纯化水、尼泊金乙脂混合加热至80℃左右，作为水相。待油相温度为80℃左右时，搅拌下将己酮可可碱溶液加入其中，并使温度保持在80℃左右。将搅拌均匀后的油相，在慢速搅拌下，缓缓加入水相中，后加速搅拌30min，停止搅拌，即得乳膏。

实施例7软膏剂的制备

己酮可可碱            10g

单硬脂酸甘油酯        100g

石蜡                  100g

白凡士林              46g

液体石蜡              53g

丙二醇                50g

司盘80                5g

对羟基苯甲酸乙酯      1g

纯化水                加至1000g

制备工艺：

取石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、液状石蜡、丙二醇、司盘80和对羟基苯甲酸乙酯于水浴上加热熔化并保持80℃，搅拌下缓慢加入80℃的水，边加边搅拌至冷凝，即软膏基质。取己酮可可碱溶于适量的纯化水中，加入到基质中，最后加水至1000g，搅拌均匀，即得。

实施例8片剂的制备

己酮可可碱            10g

微晶纤维素            200g

羧甲基淀粉钠        8g

硬脂酸镁            1.5g

8％淀粉浆           适量

制备工艺：

将己酮可可碱和辅料微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量的淀粉浆制软材，然过16目筛制粒。湿颗粒在60℃干燥，干颗粒过16目筛整粒，筛出干粒中的细粉，与硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，压片，即得。

实施例9喷雾剂

己酮可可碱        10g

蒸馏水            适量

甘油              30g

尿素              2g

苯扎溴铵          0.1g

氯化钠            0.9g

蒸馏水            加至100ml

制备工艺：

在常温常压下，称量己酮可可碱10g，溶于适量的蒸馏水中，再按照处方中各组分的配比分别加入其中，即甘油30g，尿素2g，苯扎溴铵0.1g，氯化钠0.9g，最后加蒸馏水至100ml，充分混匀，罐装，封口，检验得成品。

实施例10气雾剂

己酮可可碱        10g

蒸馏水            适量

甘油              5g

尿素              2g

苯扎溴铵          0.1g

氟里昂F₁₂         适量

蒸馏水            加至100ml

制备工艺：

在常温常压下，称量己酮可可碱10g，溶于适量的蒸馏水中，再按照处方中各组分的配比分别加入其中，即甘油10g，尿素2g，苯扎溴铵0.1g，适量抛射剂F₁₂，最后加蒸馏水至100ml，充分混匀，罐装，封口，检验得成品。

对照例1茶碱片剂

茶碱            10g

微晶纤维素      200g

羧甲基淀粉钠    8g

硬脂酸镁        1.5g

8％淀粉浆       适量

制备工艺：

将茶碱和辅料微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量的淀粉浆制软材，然过16目筛制粒。湿颗粒在60℃干燥，干颗粒过16目筛整粒，筛出干粒中的细粉，与硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，压片，即得。

对照例2氨茶碱片剂

氨茶碱          10g

微晶纤维素      200g

羧甲基淀粉钠    8g

硬脂酸镁        1.5g

8％淀粉浆       适量

制备工艺：同对照例1。

对照例3咖啡因片剂

咖啡因          10g

微晶纤维素      200g

羧甲基淀粉钠    8g

硬脂酸镁        1.5g

8％淀粉浆        适量

制备工艺：同对照例1。

对照例4帕吉维林片剂

帕吉维林          10g

微晶纤维素        200g

羧甲基淀粉钠      8g

硬脂酸镁          1.5g

8％淀粉浆         适量

制备工艺：同对照例1。

(二)己酮可可碱的药效学研究

实施例11酮可可碱对慢传输型便秘小鼠模型的影响

1.试验目的

实验组小鼠皮下注射吗啡诱导建立慢传输型便秘小鼠模型，记录小鼠粪便重量，利用活性炭灌胃法试验比较实验组与对照组小鼠结肠传输功能；利用免疫组化技术比较两组小鼠结肠组织中Cajal细胞数量。

2.材料

无特殊病原体SPF级ICR鼠80只，山东新时代药业动物中心，雌雄各半，体重20～25克；小鼠代谢笼(苏州冯氏实验动物公司)；注射用盐酸吗啡(沈阳第一制药厂，规格10mg/支)；生理盐水；一抗(sc-168，Santa Cruz Biotechnology，Inc，200mg/L)；二抗(羊抗兔抗体，中山生物科技公司)；己酮可可碱片剂，制备工艺同实施例8；己酮可可碱栓剂，制备工艺同实施例3；茶碱片剂，制备工艺同对照例1；氨茶碱片剂，制备工艺同对照例2；咖啡因片剂，制备工艺同对照例3；帕吉维林片剂，制备工艺同对照例4。

3试验方法和步骤

3.1慢传输型便秘小鼠模型的建立

ICR鼠80只，随机分为6个实验组，1个正常对照组和1个模型对照组，每组10只。6个实验组分别为：己酮可可碱片剂组；己酮可可碱栓剂组；茶碱片剂组；氨茶碱片剂组；咖啡因片剂组；帕吉维林片剂组。所有小鼠置入80个小鼠代谢笼中，SPF级环境饲养。适应性喂养3天后，实验组和模型对照组小鼠皮下注射盐酸吗啡2.5mg/(kg·d)，正常对照组注射等量生理盐水。每3天记录一次小鼠大便粒数、大便干重及小鼠体重，计算小鼠日均排便重量(g)。以小鼠日均排便量减少，且日均排便量与正常对照组相比具有显著性差异作为慢传输型便秘小鼠模型的建立成功的标志，造模成功后停止注射给药。

3.2小鼠日均排便重量的测定

给与造模成功后(饲养第46天起)的小鼠按照如下给药方案给药，己酮可可碱片剂组小鼠灌胃给药己酮可可碱，给药剂量按照己酮可可碱计1mg/(kg·d)；己酮可可碱栓剂组直肠给药己酮可可碱栓剂，给药剂量按照己酮可可碱计1mg/(kg·d)；茶碱片剂组、氨茶碱片剂组、咖啡因片剂组和帕吉维林片剂组给药剂量均为1mg/(kg·d)，灌胃给药。正常对照组和模型对照组给与蒸馏水。每隔1天记录一次小鼠大便粒数、大便干重及小鼠体重，计算小鼠日均排便重量(g)。小鼠日均排便量与正常组相比减少，表明慢传输型便秘程度增大。

3.3肠道传输功能测定

用活性炭灌胃法测定首粒黑便排出时间。停药1周的所有小鼠禁食24小时，经口灌入100mg/ml活性炭悬液2ml。从活性炭灌胃完毕开始时计时，记录从灌胃到首粒黑便排出的时间。首粒黑便排出时间越长表明慢传输型便秘程度越大。

3.4免疫组化标记小鼠结肠组织ICC及小鼠结肠组织ICC数量的比较

实验结束后颈椎脱臼法处死，剖腹取出幽门到直肠末端全部肠道，分别取每只小鼠远端结肠组织2～3处，4％甲醛溶液固定，石蜡包埋连续切片(厚度：4～5μm)；脱蜡和水化后，切片放入pH8.0的EDTA缓冲液，煮沸15min，保温10min，室温冷却；PBS液(pH7.6)冲洗3次，每次5min；每张切片滴加50μl3％双氧水以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min；PBS液(pH7.6)冲洗3次，每次5min；去除血清，分别加入一抗(1∶500)50μl，37℃孵育60min，PBS液冲洗3次，每次5min；去除PBS液，分别加入生物素标记的二抗(1∶50)50μl，室温孵育10min；PBS液冲洗3次，每次3min；去除PBS液，加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10min；PBS液冲洗3次，每次3min；去除PBS液，加2滴新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～10min；自来水冲洗；苏木精复染，0.1％HCl乙醇分化，流水冲洗返蓝；梯度乙醇脱水干燥(二甲苯透明)，中性树胶封固，细胞质呈棕色为阳性反应。每张切片选择五个高倍镜视野(×200)，应用Lecia RX250型图像分析系统及Qwin软件标记并计算c-kit阳性细胞面积。c-kit阳性细胞面积与正常组小鼠相比越小，表明慢传输型便秘程度越大。

3.5试验数据的统计学处理

实验数据录入SPSS211.0统计软件包，统计方法选用t检验，p＜0.05为差异有显著性意义。

4结果

实验结果表明：

(1)与正常组相比，模型组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit阳性细胞面积均具有极其显著性差异(p＜0.01)，表明慢传输型便秘小鼠模型建造成功；

(2)与模型组小鼠相比，己酮可可碱片剂组、己酮可可碱栓剂组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit阳性细胞面积均具有显著性差异(p＜0.05)，然而茶碱片剂组、氨茶碱片剂组、咖啡因片剂组、帕吉维林片剂组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit阳性细胞面积均无统计学意义(p＞0.05)，这表明己酮可可碱能够明显改善小鼠排便量，增强小鼠肠道推进力并增加肠道ICC数量，缓解慢传输型小鼠便秘的症状，然而茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林无此功能。

(3)与茶碱片剂组、氨茶碱片剂组、咖啡因片剂组、帕吉维林片剂组相比，己酮可可碱片剂组、己酮可可碱栓剂组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit阳性细胞面积均具有显著或极显著性差异性差异。这表明己酮可可碱在治疗慢传输型便秘方面效果显著优于其它非选择性磷酸二酯酶抑制如茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林。

(4)与己酮可可碱片剂组相比，己酮可可碱栓剂组小鼠日均排便量、首粒黑便排出时间以及c-kit阳性细胞面积均较好.虽无显著性差异(p＞0.05)，但己酮可可碱直肠给药治疗慢传输型小鼠便秘的效果优于己酮可可碱口服给药。

表1己酮可可碱对慢传输型便秘小鼠的影响

^*与模型对照组相比，p＜0.05；^**与模型对照组相比，p＜0.01；

^■■与正常对照组比较，p＜0.01；^★与己酮可可碱片剂组相比，p＜0.05；

#与茶碱片组相比，p＜0.05；##与茶碱片组相比，p＜0.01；

$$与氨茶碱片组相比，p＜0.05；$$与茶碱片组相比，p＜0.01；

&与咖啡因片组相比，p＜0.05；&&与咖啡因片组相比，p＜0.01；

△与帕吉维林片组相比，p＜0.05；△△与帕吉维林片组相比，p＜0.01；

5讨论

慢传输型便秘患者肠道Cajal间质细胞(ICC)数量减少、体积缩小，故可认为ICC减少是慢传输型便秘肠道组织细胞学的主要特点。c-kit为一种原癌基因，位于5号染色体w位点上，它编码kit受体，后者属酪氨酸激酶膜受体。ICC有无c-kit表达与肠道动力密切相关，因此可以利用c-kit抗体标记识别ICC。本研究利用c-kit抗体标记ICC后对比两组小鼠阳性细胞数量，给药后，模型对照组小鼠粪便减少，肠道推进力减弱，肠道ICC数量减少，与正常组差异显著，故本研究所造模型与慢传输型便秘生理、病理组织细胞学特点一致。己酮可可碱给药组包括片剂和栓剂组，在改善慢传输型便秘的上述症状即增加小鼠日均排便量，增强小鼠肠道推进力并增加肠道ICC数量方面具有预料不到的药效。

实施例12己酮可可可碱对大鼠肛门括约肌的影响

1材料与方法

1.1材料：

6个雄性Wister大鼠70只，体重240±10g，来源：山东新时代药业动物中心，随即放进不锈钢钢筋笼内饲养，温度24±0.5℃，相对湿度为55±10％，每天07:00-19:00光照12小时，大鼠自由进食和饮水，统一标准餐进食。茶碱片剂，制备工艺同对照例1；氨茶碱片剂，制备工艺同对照例2；咖啡因片剂，制备工艺同对照例3；帕吉维林片剂，制备工艺同对照例；0.9％NaCl溶液；己酮可可碱片剂，制备工艺同实施例8；己酮可可碱气雾剂，制备工艺同实施例10。

1.2方法：

所有大鼠随机分为7组，每组10只。具体分组与给药如下：

己酮可可碱灌胃组，给药己酮可可碱0.15mg/kg·d；

己酮可可碱外用组，给药己酮可可碱0.15mg/kg·d；

生理盐水组，灌胃给药生理盐水0.15mg/kg·d；

茶碱组，灌胃给药茶碱0.15mg/kg·d；

氨茶碱组，灌胃给药氨茶碱0.15mg/kg·d；

咖啡因组，灌胃给药咖啡因0.15mg/kg·d；

帕吉维林组，灌胃给药帕吉维林0.15mg/kg·d。

在给药前1h、给药后72h，分别检测7组动物的肛周括约肌肌电图，同时进行肛直肠测压。用DANTEC公司生产的Counterpoint MK II型神经肌电图仪进行肛门括约肌表面肌电图检测。滤波频带500-1000Hz，灵敏度0.2-1mV/cm，扫描速度0.5-1ms，采用表面电极置于肛门周围皮肤，记录4组实验动物的肛门括约肌肌电图情况，利用自带软件计算出电位平均振幅及平均时限。

采用RT-2070型多通道直肠肛管测压仪，加以自制的微型气囊(最大0.5ml)测压导管，行试验动物的肛直肠测压。微型多极探头深入肛直肠内0.5cm，测量肛直肠静息压、肛直肠最大自主收缩压和直肠肛门抑制反射值。由于大鼠肛管短、细，与直肠无明显交界，故仅用单气囊行肛直肠测压。同时，通过多导生理记录仪记录测量值。

检测完毕后处死试验动物，切取4组实验动物的肛门括约肌组织，行病理切片，苏木素-伊红(HE)染色，在400倍光学显微镜下观察试验动物的肛门括约肌肌维组织形态学特点。

1.3统计学处理：

所有统计学数据均采用平均值±方差。采用SIx3S11.0统计分析软件进行方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肛门括约肌肌电图的变化情况

实验结果显示7组实验动物在治疗前后的肛周括约肌肌电图均为有规律的持续性电活动7组动物治疗前肌电图表现差异无统计学意义(P＜0.05)，电位振幅(96.8±35.7)μV，时限(3.8±0.9)ms。

与生理盐水组相比，治疗后72h，所有治疗组的肌电图运动电位振幅都有所降低，平均时限有所提高，但茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林组与生理盐水组相比无显著性差异，己酮可可碱灌胃组和外用组与生理盐水组相比具有显著性差异；

与茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林组相比，己酮可可碱灌胃组和外用组在降低电位振幅和延长时限方面具有显著性差异；与茶碱组和帕吉维林组相比，己酮可可碱灌胃组和外用组延长时限方面具有显著性差异。具体见表2。

表2己酮可可碱肛门括约肌肌电图电位振幅及平均时限

注：^*与生理盐水组相比，p＜0.05；

^#与茶碱片组相比，p＜0.05；

^$与氨茶碱片组相比，p＜0.05；

^&与咖啡因片组相比，p＜0.05；

^△与帕吉维林片组相比，p＜0.05。

2.2肛直肠测压情况：

与生理盐水组相比，治疗后72h，所有治疗组的肛直肠静息压、肛直肠最大自主收缩压、直肠肛门抑制反射值的气囊容量均低于生理盐水组。但茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林组与生理盐水组相比无显著性差异，己酮可可碱灌胃组和外用组与生理盐水组相比具有显著性差异；

与茶碱、氨茶碱、咖啡因、帕吉维林组相比，己酮可可碱灌胃组和外用组在降低肛直肠静息压、肛直肠最大自主收缩压、直肠肛门抑制反射值的气囊容量具有显著性差异；

与己酮可可碱灌胃组相比，己酮可可碱外用组在降低肛直肠静息压、肛直肠最大自主收缩压、直肠肛门抑制反射值的气囊容量效果更好，但无统计学差异。具体见表4。

对于占功能性便秘50％以上的出口梗阻型便秘，肛门内外括约肌的持续痉挛和压力升高是其主要的病理生理改变之一。己酮可可碱治疗组的肛直肠静息压、最大自主收缩压和直肠肛门抑制反射值明显下降，说明其有效地降低了肛门括约肌的肌张力，达到了松弛肛门括约肌的效果。病理组织学切片观察发现，己酮可可碱治疗组的肛门括约肌纤维有一定程度的萎缩。研究表明，己酮可可碱能有效降低肛门括约肌的压力，为临床治疗慢性出口梗阻型便秘提供了新的方法和思路，值得进一步研究。

表3己酮可可碱对肛直肠压力的影响

注：

^*与生理盐水组相比，p＜0.05；

^#与茶碱片组相比，p＜0.05；

^$与氨茶碱片组相比，p＜0.05；

^&与咖啡因片组相比，p＜0.05；

^△与帕吉维林片组相比，p＜0.05。

实施例13己酮可可碱对洛哌丁胺诱导的便秘大鼠直肠黏膜黏液的影响

1.实验材料

8周龄的SD大鼠，体重240±10g，来源：山东新时代药业动物中心，随即放进不锈钢钢筋笼内饲养，温度24±0.5℃，相对湿度为55±10％，每天07:00-19:00光照12小时，大鼠自由进食和饮水，统一标准餐进食。洛哌丁胺(Loperamide)，0.9％NaCl溶液，己酮可可碱片剂，制备工艺同实施例8；己酮可可碱栓剂，制备工艺同实施例1。

2.实验方法与步骤

我们随即将大鼠分为己酮可可碱灌胃组、己酮可可碱外用组、1个模型对照组、1个正常对照组，每组5只。适应性饲养3天。灌胃组、外用组、模型对照组皮下注射洛哌丁胺1.5mg/kg，注射前洛哌丁胺溶解于0.9％NaCl溶液中，每天于09:00和18:00分别注射一次。正常组大鼠注射0.9％NaCl溶液，实验方法同模型组。

灌胃组大鼠每天于10:00灌胃给药己酮可可碱片剂，给药剂量1.5mg/kg；外用组大鼠直肠给药己酮可可碱栓剂1.5mg/kg，给药剂量均按照己酮可可碱的量计。模型对照组和正常对照组大鼠给与蒸馏水，剂量和方法同上。

以上各组大鼠均笼养，自由饮食，用药14天后，将各组大鼠用氯氨酮麻醉，剖腹，割取远端结肠8cm，纵向剖开，冲净内容物，10％中性福尔马林固定，备用。全部固定后的标本用石蜡包埋，常规切片，AB-PAS染色。含黏液的细胞灰度值较低，不含黏液的细胞灰度值较高。采用IMS全真彩色图像分析系统(上海申腾信息技术公司产品)分析黏液阳性面积。技术指标为图像分辨率512×512，灰度等级为256。显微镜为Olympus-BH2。每个标本随机检测6个10×10低倍视野。实验结果以均值±标准差表示，采用SPSS10.0软件包进行方差分析。

3.结果

实验结果表明：

(1)正常对照组大鼠肠黏膜上皮黏液丰富；模型对照组大鼠肠黏膜上皮黏液明显减少，与正常组相比具有极其显著性差异(p＜0.01)。

(2)与模型组相比，己酮可可碱灌胃组、外用组大鼠肠黏膜上皮黏液明显增多，且具有显著性差异。

(3)与己酮可可碱灌胃组相比，己酮可可碱外用组大鼠肠黏膜上皮黏液明显增多，且具有显著性差异(p＜0.05)，这表明直肠黏膜直接给药对于增强肠黏膜功能效果更加明显。

表4己酮可可碱对洛哌丁胺诱导的便秘大鼠直肠黏膜黏液的影响

^**与模型对照组相比，p＜0.01；

^★与灌胃组相比，p＜0.05；

^■■与正常对照组比较，p＜0.01。

4.讨论

正常结肠黏膜杯状细胞的分泌液富含黏蛋白，黏蛋白与水结合形成黏液，构成黏液保障，对黏膜起到机械性保护作用。黏液分泌的减少是结肠功能衰弱的表现，或固水能力减少，或细胞黏蛋白分泌减少。本发明通过给药己酮可可碱，惊奇地发现己酮可可碱在改善结肠功能，增加肠黏膜黏液正常分泌方面具有意想不到的效果。可见，己酮可可碱治疗功能性便秘，不仅仅在改善功能性便秘症状上，并且能显著改善肠黏膜的功能，从而有可能实现功能性便秘的显著改善。

以上通过具体优选实施方式描述了本发明，任何等同替换对于本领域的技术人员来说都是显而易见的且包括在本发明之中，在本发明范围之内的优选，应当视作本发明给予的技术启示的结果，并包括在本发明之中。所述的等同替换包括但不限于如下情形：

1、选用本发明提供的任一口服制剂或局部外用制剂按照本发明的实施例11-13进行实验；或者对文献报道的有关功能性便秘的动物模型给予本发明提供的任一药物组合物制剂，包括口服制剂和局部外用制剂。

2、根据本发明公开的治疗功能性便秘的己酮可可碱剂量，按照体表面积或重量换算进行实验，视作本发明的给予的技术启示。