探针法检测CHO细胞DNA含量的方法

摘要

本发明公开了一种探针法检测CHO细胞DNA含量的方法，采用GeneBank登录号为EF540878.1的核苷酸序列设计特异性引物对及Taqman探针，对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。本发明还进一步公开了基于该方法的试剂盒。本发明可以精确定量检测来源于CHO细胞的治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品中CHO细胞残留DNA含量，本方法还为分析CHO细胞中特定基因的拷贝数提供内参。

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测CHO细胞DNA(即中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA)含量的方法。

背景技术

基因工程领域所用基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。哺乳动物细胞的规模化生产技术也日渐成熟和完善。因此，通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术，目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，70％来自于哺乳动物细胞，而这其中CHO细胞是最常用的细胞系。为了确保治疗性重组蛋白质药物的产品质量，欧美食品和药品管理局以及我国国家食品药品监督管理局都对药品中宿主细胞残留DNA量提出了明确的要求。分子杂交分析以及immunoassay分析具有灵敏度低、耗费时间长、不易定量检测等缺陷。

基因拷贝数是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在基因组中出现的次数。对CHO细胞基因工程细胞株进行基因拷贝数的分析对于评价基因工程细胞株的稳定性、遗传特性具有重要的意义。而选择合适的内参是准确分析某一特定基因拷贝数的基础。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确、自动化程度高和实时性等特点。Taqman探针是基于与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对的一类寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’端，而淬灭基团则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。Taqman探针技术因其灵敏度较高，特异性强，是目前备受推崇的荧光定量PCR使用技术。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。

本发明的荧光PCR方法采用Taqman探针技术，克服传统检测方法灵敏度低、实施费用高等缺点，提供一种简单、廉价、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测CHO细胞DNA的方法，本方法可用于检测治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品CHO细胞残留DNA，从而对重组蛋白质药物生产过程进行质量监测。

本发明采用GeneBank登录号为EF540878.1的核苷酸序列，设计特异引物和Taqman探针，以提取的CHO细胞基因组DNA为模板进行荧光定量PCR。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种荧光定量PCR检测CHO细胞DNA的方法，采用GeneBank登录号为EF540878.1的核苷酸序列设计特异性引物对及Taqman探针，对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

所述待检样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。

所述的特异引物对序列为：

Primer-F的核苷酸序列为：5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3’(SEQ ID NO：1)；

Primer-R的核苷酸序列为：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’(SEQ ID NO：2)；

所述Taqman探针序列核苷酸为：

Probe：5’-CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3’(SEQ ID NO：3)。

其中所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，荧光报告基团优选为FAM，也可为其它具有相似功能的基团，3’端标记有淬灭基团，淬灭基团为MGB或BHQ1，也可为其它具有相似功能的基团。

所述实时荧光定量PCR检测反应体系中含有DNA模板、Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺、PCR缓冲液、Taqman探针、正向引物和反向引物。Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺及PCR缓冲液均为常见组分，其含量亦为常规。一般而言，所述PCR反应体系中，正向引物浓度为0.2-1μmol/L，反向引物浓度为0.2-1μmol/L，探针浓度为0.2-3μmol/L，Taq酶用量为50000-200000U/L，dNTP含量为0.1-0.5mM/L，Mg2+浓度为3.0-6.0mM/L，引物总浓度为0.4-2.0μmol/L，PCR缓冲液则稀释为1X。反应体系一般可设为30μL。所述DNA模板可以来自待测样本，也可以来自参考品或阳性质控品。

所述实时荧光定量PCR中，每次检测均设立参考品，阴性质控品和阳性质控品。参考品为CHO细胞基因组DNA，其DNA浓度可为1.0×10⁷-5.0×10⁷fg/μL，如3.0×10⁷fg/ul。使用时用DNA稀释液稀释成7个浓度梯度，分别为3.0×10⁵fg/μl，3.0×10⁴fg/μl，3.0×10³fg/μl，3.0×10²fg/μl，3.0×10¹fg/μl，及3.0fg/μl。其中阳性质控品为CHO细胞基因组DNA，浓度可为3.0×10³fg/ul，阴性对照品为纯水。所述DNA稀释液可为常规。优选由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成，其中Tris-HCl浓度为5.0-10.0mM/L，EDTA的浓度为0.5-1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为6.0-8.5。该DNA稀释液能高效稀释低浓度的DNA样品，而且适合于PCR扩增。

所有待检样品均需通过提取后溶解于DNA稀释液或纯水中。

实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

基于上述荧光定量PCR检测CHO细胞DNA的方法，本发明还进一步提供了一种荧光定量PCR检测CHO细胞DNA的试剂盒，包括：PCR扩增反应液、参考品、阴性质控品、阳性质控品以及DNA稀释液，所述PCR扩增反应液含有Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺、PCR缓冲液、正向引物、反向引物以及Taqman探针，其中，所述正向引物、反向引物及Taqman探针为Genebank登录号为EF540878.1序列的特异性引物及探针。

较佳的，试剂盒中，所述正向引物、反向引物及Taqman探针的核苷酸序列如前所述。

所述PCR扩增反应液中，正向引物浓度为0.2-1.0μmol/L，反向引物浓度为0.2-1.0μmol/L，Taqman探针浓度为0.2-3.0μmol/L，Taq酶用量为50000-200000U/L，dNTP含量为0.1-0.5mM/L，Mg²⁺浓度为3.0-6.0mM/L，引物总浓度为0.4-2.0μmol/L，PCR缓冲液则稀释为1X。

所述参考品为CHO细胞基因组DNA，其CHO细胞基因组DNA的浓度可为1.0×10⁷-5.0×10⁷fg/μL，如3.0×10⁷f g/ul。其中阳性质控品为CHO细胞基因组DNA，浓度可为3.0×10³fg/ul，阴性对照品为纯水。所述DNA稀释液可为常规。优选由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成，其中Tris-HCl浓度为5.0-10.0mM/L，EDTA的浓度为0.5-1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为6.0-8.5。

本发明的试剂盒可以与常规市购DNA提取试剂盒组合使用，也可进一步包括DNA提取液，所述DNA提取液可采用常规市购的DNA提取试剂盒中所含试剂。

本发明提供的实施荧光定量PCR方法可以定量检测出CHO细胞DNA的浓度低于3.0fg/ul，表明本方法具有非常好的灵敏度，且具有较高的特异性。

本发明提供的实时荧光定量PCR方法可以检测重组蛋白产程中间样品、半成品、成品等样品中的CHO细胞残留DNA，还为分析CHO细胞中特定基因的拷贝数提供内参。可以为重组蛋白药物的生产提供可靠的质控证据，为重组蛋白药物研发和安全生产提供重要支持。

附图说明

图1参考品扩增曲线。扩增曲线有明显的指数增长期，每个浓度的扩增曲线均匀叠和在一起，表明本方法重复性好。

图2参考品标准曲线。由图可知，当参考品浓度为3.0×10⁵fgμl，3.0×10⁴fg/μl，3.0×10³fg/μl，3.0×10²fg/μl，3.0×10¹fg/μl，3.0fg/μl时，样品的Ct值为-之间，检测下线低于3.0fg/ul。绘制得到的标准曲线斜率为-3.445，相关系数(R²)＝0.999，扩增效率为95.1％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到3.0fg/μl。

图3样品定量分析的扩增曲线。扩增曲线有明显的指数增长期，表明提取样品可用本方法进行定量分析。

图4样品定量分析标准曲线。当参考品浓度为3.0×10⁶fg/μl，3.0×10⁵fgμl，3.0×10⁴fgμl，3.0×10³fgμl，3.0×10²fg/μl，3.0×10¹fg/μl，3.0fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.351，相关系数(R²)＝1.0，扩增效率为98.789％。标准曲线线性及扩增效率良好，所分析样品均在标准曲线分析范围内。

图5实施例3特异性分析扩增曲线

图6实施例3特异性分析标准曲线

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步说明，所列实例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：

荧光定量PCR法检测CHO细胞DNA残留的引物设计及参考品制备

1、材料和试剂

DNTPs、Taq DNA聚合酶、荧光染料及PCR缓冲液为市售产品，7500Fast荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品，DNA稀释液由本实验室采用分析纯试剂配制，基因组DNA提取试剂盒为美国Bio-Tek公司产品。

2、引物及探针的设计与合成

以Genebank登录序列(Genebank登录号EF540878.1)为模板，使用Primer Primer 5.0软件(美国PremierBiosoft公司)设计PCR引物及探针，通过预实验，从中选择如下组合。

Primer-F的核苷酸序列为：5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3’；

Primer-R的核苷酸序列为：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’；

Probe：5’-CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3’：

引物及探针由上海生工生物工程有限公司合成。

3、检测参考品制备及检测

培养CHO细胞，离心收集细胞，用PBS无菌洗涤2次，按基因组DNA提取试剂盒说明书提取CHO细胞基因组DNA，分光光度法测定其在260nm(A-260)测定其浓度并稀释成30ng/μl(3.0×107fg/μl)，分装后-20℃储存，作为参考品使用。

取7支新的1.5mL低吸附离心管，分别标记为SD0、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6，向每管中各加入45μL DNA稀释缓冲液(Tris-HCl 10mM/L，EDTA 1mM/L，pH为8)。SD0管中加入5μL CHO DNA参考品(3.0×10⁷f g/ul)，涡旋混匀器充分混匀，之后每一管依次加入5μL上一浓度梯度稀释液，各管加入DNA后均用涡旋混匀器充分混匀，再进行下一个梯度稀释。

参考品制备后，配置如下PCR反应体系：

PCR体系：PCR缓冲液(10X)3.0μl；dNTP(2mM/L)2.0μl；MgCl₂(50mM/L)2.0μl；Rox染料(50X)0.6μl；正向引物(10μmol/L)1.0μl；反向引物(10μmol/L)1.0μl；探针(10μmol/L)1.5μl Taq酶(50U/μl)0.1μl；模板9.5μl；纯水9.3μl。

PCR反应体系配置完成后，在ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR条件为95℃预变性10min；95℃15s，60℃60s，40个循环；分析标准曲线。实验结果如图1，图2所示。

实施例2荧光定量PCR法检测CHO细胞DNA浓度在分析CHO细胞基因拷贝数的应用

1、目的为分析目的基因的基因拷贝数提供内参。

2、制备CHO细胞DNA

收集不同细胞株、不同传代次数的CHO细胞，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，先用分光光度法初步测定所提基因组DNA的浓度，将样品做适当稀释，使各样品在标准曲线范围内。

3、选用7个浓度的参考品，参考品浓度分别为3.0×106fg/μl，3.0×105fg/μl，3.0×104fg/μl，3.0×103fg/μl，3.0×102fg/μl，3.0×101fg/μl，3.0fg/μl参考实施例1所述方法进行定量PCR分析。扩增结果及标准曲线如图3，图4所示。

4、通过定量PCR方法分析目的基因的表达情况，再以各个样品CHO细胞DNA浓度为内参进行校正。

实施例3荧光定量PCR法检测CHO细胞残留DNA的应用及特异性分析

1、制备包括以下PCR扩增反应液及稀释液：

PCR体系：PCR缓冲液(10X)3.0μl；dNTP(2mM/L)2.0μl；MgCl₂(50mM/L)2.0μl；Rox染料(50X)0.6μl；正向引物(10μmol/L)1.0μl；反向引物(10μmol/L)1.0μl；探针(10μmol/L)1.5μl Taq酶(50U/μl)0.1μl；模板9.5μl；纯水9.3μl。

DNA稀释液：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为5.0mM/L，EDTA的浓度为1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为8.0。

2、样品采集、运送和保存

样品采集：包括各种用CHO细胞做为宿主细胞生产的重组蛋白药物半成品、成品等，按照国家生物制品检定所取样要求进行操作，密封送检。用作分析本方法特异性所用细胞株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)、质粒为本实验室自制。

样品保存和运送：样品可立即用于检测，也可保存于-20℃待检，保存期为6个月。样品运送时应保存于0℃-8℃。

3、检测步骤

a)样品处理与DNA提取

本例测定样品包括Wil2-S细胞基因组DNA(30pg/μl)，正常人血清基因组DNA(批号：CP18)，pHLX101质粒(10⁷拷贝/μl)，利妥昔单克隆抗体成品(罗氏公司，批号：B6029)，HLX-01单克隆抗体半成品(本公司生产，批号：RS20110102)，CHO细胞基因组DNA样品(提取的CHO基因组DNA做为阳性样品，紫外分光光度法定量其浓度为30pg/ul)。采用磁珠富集法提取DNA。提取样品时，同时提取阳性质控品及阴性质控品，阴性质控品用于判断提取过程中有无污染，阳性质控品用于测定提取收率。

所有待检样品均需通过提取后溶解于试剂盒所带DNA稀释液或纯水中。

b)PCR扩增与结果分析

检测时设立参考品，阴性质控品和阳性质控品。参考品使用时用DNA稀释液稀释成6个浓度梯度，分别为3.0×10⁵fg/μl，3.0×10⁴fg/μl，3.0×10³fg/μl，3.0×10²fg/μl，3.0×10¹fg/μl，及3.0fg/μl。

PCR反应液配置完成后。在ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。同时加参考品检测作标准曲线。

反应结束后保存检测数据文件。结果显示，标准曲线相关系数为0.998，大于0.99，扩增效率为104％介于95％-105％之间。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样品中CHO细胞DNA残留量，样品检测结果如附图5、图6所示，其中Wil2-S细胞基因组DNA，正常人血清基因组DNA，pHLX101质粒，利妥昔单克隆抗体成品，HLX-01单克隆抗体原液，检测结果Ct值均低于检测下限；CHO细胞基因组DNA样品的Ct值为19.34，参照同一次实验中线性定量参考品的标准曲线图，可以判定样品中CHO细胞残留DNA的浓度为33.7pg/μl。结果表明本试剂盒具有较好的专一性。

实施例4试剂盒的制备

本方法也可进一步开发为检测试剂盒，实施例如下：

制备包括以下组成成分的试剂盒：

DNA稀释液(1ml/管)1管、PCR扩增反应液(1ml/管)1管、阴性质控品(150μl/管)2管、阳性质控品(150μl/管)2管、参考品(50μl/管)1管。

阳性质控品为CHO细胞基因组DNA，浓度可为3.0×10³fg/ul。

所述阴性对照品为纯水。

参考品为CHO细胞基因组DNA，浓度为3.0×10⁷fg/ul。

DNA稀释液(选自以下任一)：

配方一：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为5.0mM/L，EDTA的浓度为1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为8.5。

配方二：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为8mM/L，EDTA的浓度为0.7mM/L，用NaOH溶液调节pH为8.0。

配方三：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为10.0mM/L，EDTA的浓度为0.5mM/L，用NaOH溶液调节pH为6.0。

PCR扩增反应液：Taq酶100000U/L，dNTP含量为0.5mM/L，Mg²⁺浓度为5mM/L，Rox染料(50X)20ml/L，PCR缓冲液(10X)100ml/L，正向引物浓度为0.5μmol/L，反向引物浓度为0.5μmol/L，Taqman探针浓度为0.8μmol/L，混合配置。

试剂盒准备完成后，储存于-20℃。