花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了睡莲花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法。睡莲花器官发育基因NsAGL6，序列为SEQ ID NO.1，本发明所构建的表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6是由NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。将该植物表达载体用于植物遗传转化，NsAGL6基因在CaMV35S启动子的驱动下超量表达，大量合成AGL6蛋白，调控下游基因的表达，使之提前开花，改变植物花型。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及睡莲花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法。

背景技术

AGL6是参与花分生组织的建成和花器官形成过程中的一类重要转录因子。目前已经从玉米、矮牵牛、风信子、水稻等植物中克隆到了AGL6的同源基因，并对其功能进行了分析。研究发现，尽管这些植物的亲缘关系不尽相同，但其AGL6基因都参与了花发育的调控。这类基因的功能多集中于使植物提前开花和改变花器官形态、花部数目。AGL6类基因均含有高度保守的MADS结构域，并且在表达模式上具有一定的相似性。但迄今为止对AGL6基因的功能尚未完全确定。

睡莲(Nymphaea ssp.)为睡莲属睡莲科多年生水生植物，具有很高观赏价值。由于花色艳丽，姿态优美，花态各异、其品种资源十分丰富。通过克隆控制睡莲花器官发育的关键基因，构建表达载体，转化其他植物，可培育出新花型、花期提前的植物新品种。

在作物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将控制花发育的基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，使该转录因子在CaMV35S启动子的启动下超量表达，并调控下游目的基因的表达，改变植物形态建成，对于植物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

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发明内容

本发明的目的在于为改良植物花型和花期，提供一个睡莲花器官发育基因NsAGL6，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

本发明的另一目的在于提供睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体。

本发明的又一目的在于提供睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制新花型、花期提前的新种质，可用于植物品种改良。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

睡莲花器官发育基因NsAGL6，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体，由所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6与质粒pCAMBIA 1301-220构成。

上述的睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体，该植物表达载体是由NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。

睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)睡莲花器官发育基因NsAGL6的克隆

以睡莲小花蕾为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物并用高保真酶扩增NsAGL6基因，

上游引物NsAGL6-F：SEQ ID NO.2

下游引物NsAGL6-R：SEQ ID NO.3

以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；

2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建

从TOP10菌株中提取提取pMD19-T Simple-NsAGL6重组质粒，BamH I和Sma I双酶切后回收NsAGL6片段，再插入到经BamH I和Sma I双酶切得到的线性化的pCAMBIA1301-220质粒，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6构建成功。

将NsAGL6基因的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，方法如下：(1)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化；(2)拟南芥花序浸染及种子筛选；(3)PCR鉴定及植物形态观察。

本发明的有益效果：

1.本发明提供的睡莲花器官发育基因NsAGL6基因是一个新的花发育基因，该基因可调控植物开花和花器官发育。

2.本发明构建的睡莲花器官发育基因NsAGL6基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，改良植物花型和花期。

附图说明

图1NsAGL6琼脂糖凝胶电泳分析：

M：DNAMarker(2Kb/1.5Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.3Kb/0.1Kb)

1：NsAGL6开放阅读框扩增；

2：pMD 19-T Simple-NsAGL6质粒Sma I和BamH I双酶切；

3：pCAMBIA 1301-220-NsAGL6表达载体Sma I和BamH I双酶切检测图

图2植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建过程示意图。

图3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定。

图4植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6导致拟南芥提前开花。

图5植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6导致拟南芥花瓣排列的改变。

具体实施方式

实施例1植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建

1.NsAGL6的克隆：

选用睡莲栽培种‘黄公主’(Nymphaea sp.cv.‘Yellow Prince’)作为材料，提取花蕾总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照睡莲NsAGL6序列信息(NCBI登录号：AB495345)，经PrimerPremier 5软件分析设计引物扩增NsAGL6；

上游引物NsAGL6-F：5′-CGCGGATCCCTTTGAGTGATCATCGCAAGA-3′(SEQ ID NO.2)

下游引物NsAGL6-R：5′-TCCCCCGGGATGGTATGGATTACAGGACCC-3′(SEQ ID NO.3)

以花蕾cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×RCR Bμffer 5.0μL，NsAGL6-F、NsAGL6-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.8μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，反应33个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，测定序列为SEQ ID NO.1。

2.植物表达载体pCAMBIA 1301-220-Ns4GL6的构建

提取含有目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA 1301-220质粒DNA并双酶切，酶切体系为：10×bμffer K 2.5μl，Sma I 2.0μl，BamH I 2.0μl，质粒DNA 10μl，ddH₂O μp to50μl，37℃过夜充分酶切。将含有NsAGL6完整开放阅读框的片段和pCAMBIA 1301-220线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接。连接反应体系为：T4 Bμffer 2.0μl，T4连接酶1.0μl，载体回收液1.0μl，目的基因回收液4.0μl，dd H₂O μp to 20μl，4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-220-NsAGL6转化TOP10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。

实施例2植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6转化拟南芥及花发育特性观察

1、农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

从YEB(50mg/L利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50mg/L利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。

取10μL pCAMBIA 1301-220-NsAGL6载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。

2、拟南芥花序浸染及种子筛选

将阳性单克隆接到50mL的YEB(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200μL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。

种子消毒与播种：将野生型和转基因拟南芥种子分别放入1.5mL的离心管中，加入1mL 75％酒精，添加0.1％的Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95％的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(1/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。

3、PCR鉴定及植物形态观察。

以经抗生素筛选的抗性植株总DNA为模板，以未转基因菊花苗为阴性对照进行PCR反应(如图3)。反应体系见实施例1。

将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播到栽培基质中，人工培养条件为：相对湿度80％，光照强度80-200μmol/M2/S，温光周期为16h光照，22℃/8h黑暗，17℃。记录每株开花的时间，并用体式显微镜观察花器官的变化。转基因苗相比野生型拟南芥，开花提前了6、9、10天(图4)；花瓣的排列也发生了变化，野生型的拟南芥花瓣呈辐射对称，而转基因的花瓣却不再是辐射对称(图5)。

综上所述，本发明构建了含有睡莲花器官发育基因的植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6，其中NsAGL6首次报道。所构建的植物表达载体可导入多种植物中，使之提前开花并改变植物花型。