用肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法

摘要

用肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法，涉及一种生物酶取液氮保藏的菌株阴沟肠杆菌SY-8，接入装有LB培养基的三角瓶中振荡培养使菌株复苏；将复苏后的菌液转接入发酵罐中发酵培养，加入诱导剂诱导培养后，得发酵液，离心，获得菌体，再重悬于磷酸缓冲液制得含菌体菌悬液，再将菌悬液破碎，然后通过离心去除细胞碎片，收集上清液，即为铁型超氧化物歧化酶粗酶液，再将铁型超氧化物歧化酶粗酶液经硫酸氨分级沉淀，得沉淀物再用磷酸缓冲液重悬后用丙酮沉淀，得纯化的铁型超氧化物歧化酶。铁型超氧化物歧化酶可清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，即延缓衰老和脂褐素沉淀的出现。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物酶，尤其是涉及一种用阴沟肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的重要物质。1930年，由Keilin和Mann发现SOD。当时，他们仅认为是一种蛋白质，并命名为血铜蛋白。1968年，美国生化专家Fridovich和Mccord从牛红细胞中提取出SOD，并报告SOD有清除自由基的作用。罗伯·佛契哥特、费瑞·慕拉德和路伊格纳洛3位美国科学家共同发现自由基所引起的各种分子结构和性质的改变，并指出SOD是以自由基为底物的生物酶，是人体内重要的自由基清除剂。因此1998年度的诺贝尔生理医学奖授予他们。现人们已从动物、植物和微生物等各种生物体内分离得到SOD。按所含金属种类不同SOD可分为Cu，Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD4种。

现在市场上出售的SOD大多都从血液中提取，属于Cu，Zn-SOD。其分子由两个亚基组成，每个亚基含有一个铜离子和一个锌离子，分子量在32000左右。由于从动物血液中提取SOD，难以消除各种病毒及外源污染，因此从动物血液中提取Cu，Zn-SOD有很大的风险。欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD用于人类。尽管目前欧盟之外的国家和地区尚无类似规定，但用其他更安全的、更经济的提取或合成方法取代从动物血液中提取SOD，将是一个趋势。从植物中提取SOD也有其明显的局限性，如植物生长周期长，植物的栽培受到季节和地域限制也很大，因此从微生物中获得SOD的研究在国内外兴起。

目前，美国、日本和加拿大等国已经开始采用微生物菌种及基因重组等生物工程技术来获得SOD。我国也有从微生物提取SOD的报道。例如，王岁楼等(王岁楼.等，工业微生物，1997，27(2)：45-47)报道用甲笨破壁法从耐高温酒精活性干酵母中提取SOD，在初步优化的提取条件下SOD产量可达1097U/g。杨明琰等(杨明琰.等，食品科学，2005，26(2)：159-161)从酿酒酵母BUV094发酵液中提取得到的SOD，其比活为1015U/mg。从当前报道看，微生物生产SOD产量都不高，这不利于工业化生产，因此获得高产的菌种及其稳定培养的方法是工业化大生产的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用阴沟肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法。

本发明所采用的菌株是从福建省武夷山保护区土壤中分离出的革兰氏阴性细菌，该菌为革兰阴性粗短杆菌，宽约0.6～1.1μm，长约1.2～3.0μm，周身鞭毛，无芽孢无荚膜，兼性厌氧，在LB培养基上就能生长形成大而湿润的黏液状菌落。鉴定该菌株为阴沟肠杆菌SY-8(Enterobacter cloacae SY-8)，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年02月28日，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4622。

所述用阴沟肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法包括以下步骤：

1)取液氮保藏的菌株阴沟肠杆菌SY-8，接入装有LB培养基的三角瓶中振荡培养，使菌株复苏；

在步骤1)中，所述菌株与LB培养基的体积比可为1∶(10～200)，最好为1∶100；所述LB培养基的组成为每升LB培养基中含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH＝7.2；所述振荡培养的条件可为：温度为28～37℃，最好为30℃，置于150～240r/min，最好为200r/min的摇床中振荡培养。

2)将复苏后的菌液转接入发酵罐中的LB培养基中发酵培养，并加入诱导剂，诱导培养后，即可获得发酵液；

在步骤2)中，所述复苏后的菌液的体积百分比用量可为LB培养基的1％～10％；所述发酵培养的温度可为28～37℃，发酵培养的时间可为16～24h；所述诱导剂可采用Fe3+或H2O2，所述Fe3+的浓度可为100～500mg/L，所述H2O2的体积比可为1％～5％；所述诱导培养的时间可为24～48h。

3)将发酵液离心，获得菌体，将菌体重悬于磷酸缓冲液(PBS buffer)制得含菌体菌悬液，再将菌悬液破碎，然后通过离心去除细胞碎片，收集上清液，即为铁型超氧化物歧化酶粗酶液，再将铁型超氧化物歧化酶粗酶液经硫酸氨分级沉淀，得到的沉淀物再用磷酸缓冲液(PBS buffer)重悬后用丙酮沉淀，即可得到纯化的铁型超氧化物歧化酶。

在步骤3)中，所制得的含菌体菌悬液中含有菌体10％(w/v)；所述将菌悬液破碎可通过高压细胞破碎方法破碎；所述硫酸氨分级沉淀中硫酸氨的浓度可为35％～80％(W/V)，在硫酸氨65％的浓度中可以获得90％的酶活性；所述丙酮沉淀中丙酮的用量按体积百分比可为磷酸缓冲液重悬液的30％～50％，最好为36％。

通过上述方法获得的超氧化物歧化酶经ICP-AES分析，发现每毫克蛋白含Fe²⁺，Cu²⁺/Zn²⁺，Mn²⁺，Ni²⁺金属离子的含量分别为2.3μg，0.01/0.008μg，0.005μg，0.006μg。说明该酶是铁型的超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。变性与非变蛋白质电泳分析(SDS-PAGE)证明，每个酶分子为有含有两个相同的亚基。经计算可知每个蛋白质亚基中含1个二价铁离子。

铁型超氧化物歧化酶可以清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，即延缓衰老和脂褐素沉淀的出现。因此，该酶可以添加到化妆品中，也可以制成喷雾型制剂用于保养皮肤。铁型超氧化物歧化酶可以提高人体因自由基诱发的疾病的抵抗力，包括对炎症、肿瘤、白内障和自身免疫疾病等有明显的作用。因此，它也可作为食品添加剂使用。

具体实施方式

实施例1肠杆菌SY-8在5L发酵罐生产SOD

1.菌种的复苏

取液氮保藏的种子菌，按1∶100比例接入装有300ml液体培养基(pH 7～8)的1000ml三角瓶中，在好氧、常压、30℃条件下将其置于200转/分钟摇床中振荡培养过夜使菌种复苏。

2.肠杆菌SY-8在5L发酵罐生产SOD

将复苏后的菌种按照菌液与培养基1∶20的比例转接入装有3L培养基的5L发酵罐中。发酵培养24h之后，加入200mg/L的Fe³⁺或体积比为2％H₂O₂为诱导剂，诱导培养36h之后收集菌体进行SOD提取。结果表明：用200mg/L的Fe³⁺作为诱导剂时，每升发酵液可生提取出3000IU/mg的铁型超氧化物歧化酶2.16g；用2％的H₂O₂作为诱导剂时，每升发酵液可生提取出3000IU/mg的铁型超氧化物歧化酶为2.032g。

实施例2不同浓度Fe³⁺和H₂O₂诱导培养对产量的影响

按实施例1的方案在不同Fe³⁺和H₂O₂浓度诱导培养对产量的影响。不同浓度Fe³⁺和H₂O₂对产量的影响结果如表1所示。

表1不同浓度Fe³⁺和H₂O₂对产量的影响

备注：H₂O₂的含量为体积比(v/v)；SOD产量是指每升发酵液提取SOD蛋白质的量

实施例3发酵温度对产量的影响

1.菌种的复苏

菌种的复苏按实施例1中的方法进行。

2.不同温度对产量的影响

取复苏后的肠杆菌SY-8，按1∶20比例接入5个装有3.5L液体培养基(pH 7～8)的5L种子罐，5个发酵罐分别在28、30、34、35和37℃条件下培养24h，每罐分别加入200mg/L的Fe³⁺作为诱导剂，诱导培养36h。用同一工业提取产物，结果表明30℃产量最高，产量为2.01g每升发酵液。

实施例4接种量对产量的影响

1.菌种的复苏

菌种的复苏按实施例1中的方法进行。

2.不同接种量对产量的影响

取复苏后的肠杆菌SY-8，按体积比为1％、3％、5％、8％、10％比例接入5个装有3.5L液体培养基(pH 7～8)的5L种子罐，在30条件下培养24h，每罐分别加入200mg/L的Fe³⁺作为诱导剂，诱导培养36h。用同一工艺提取产物，结果表明5％(V/V)产量最高，产量为2.05g每升发酵液。

实施例5接种量对产量的影响

1.菌种的复苏

菌种的复苏按实施例1中的方法进行。

2.不同接种量对产量的影响

取复苏后的肠杆菌SY-8，按体积比为5％的比例接入3个装有3.5L液体培养基(pH 7～8)的5L种子罐，在30条件下培养24h，每罐分别加入200mg/L的Fe³⁺作为诱导剂，诱导培养分别为24，36和48h。用同一工艺提取产物，结果表明诱导36h产量最高。

实施例6硫酸氨分级沉淀

通过上述方法获得的发酵液，通过高压细胞破碎，获得粗铁型超氧化物歧化酶液，粗酶液经硫酸氨分级沉淀，硫酸氨浓度从35％，50％，65％，80％逐级增加。结果表明在硫酸氨的35％，50％之前除去大部分为杂蛋白。当硫酸氨浓度增加到65％时，可以获得70％的酶活性物质。

实施例7丙酮二次沉淀

用实施例5所述的方法获得的目的产物，用PBS缓冲液重悬，再用丙酮二次沉淀，沉淀时丙酮的用量(V/V)为30％，36％，42％，50％。结果表明丙酮的用量36％。

实施例8肠杆菌SY-8在50L发酵罐基生产SOD

1.菌种的复苏

菌种的复苏按实施例1中的方法进行。

2.在5L种子罐培养种子

取复苏后的肠杆菌SY-8，按体积比5％的比例接入装有35L液体培养基(pH 7～8)的5L种子罐，在通气、30℃条件下培养24h，作为种子用于50L发酵罐生产。8.3肠杆菌SY-8在50L发酵罐生产SOD

将种子罐中的肠杆菌SY-8按照菌液与培养基5％(V/V)的比例转接入装有35升培养基的50L发酵罐中。发酵培养24h之后，加入200mg/L的Fe³⁺为诱导剂，诱导培养36h之后收集菌体进行SOD提取。结果表明每升发酵液可生提取出3000IU/mg的铁型超氧化物歧化酶2.08g。在50L发酵罐中每次可生产SOD约为100g。

实施例9肠杆菌SY-8在1000L发酵罐基生产SOD

用50L的发酵罐按实施例8的方法培养出种子35L，将35L种子全部接种于装有700L培养基的1000L发酵罐中。发酵培养24h之后，加入200mg/L的Fe³⁺为诱导剂，诱导培养36h之后收集菌体进行SOD提取。结果表明每升发酵液可生提取出3000IU/mg的铁型超氧化物歧化酶2.03g。在1000L发酵罐中每次可生产SOD约为1.4kg。