一种集胞藻PCC6803表达外源基因的方法

摘要

一种集胞藻PCC6803表达外源基因的方法，包括：1)分别将集胞藻6803的rbcL启动子(Prbc，1.3kb)和终止序列rbc terminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壮观霉素抗性标记基因Ω，以及报告基因lacZ构建于一个集胞藻6803基因组整合质粒平台，得到已经包含报告基因的用于集胞藻6803表达外源基因并可以基因组整合的平台质粒pFQ20；2)pFQ20转化集胞藻6803藻株，经壮观霉素抗性筛选得到转化子，用特异引物PCR鉴定基因型后，测定转化了表达平台和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，以验证集胞藻6803外源基因表达平台的表达效率。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种蓝细菌集胞藻PCC6803高效表达外源基因的方法。

背景技术

蓝细菌，又称蓝藻，是一种可以进行光合作用的原核微生物，可以直接利用太阳能、二氧化碳和水进行生长，具有生长速度快、光合作用效率高等优点。因此，蓝细菌作为一种基因工程的模式宿主微生物，在生物能源和生物制药领域具有广泛的应用前景。

蓝细菌具有特殊的遗传操作背景，国内外许多科研团队对蓝细菌的外源基因表达进行了研究，但是和传统的基因工程宿主大肠杆菌相比，蓝细菌对外源基因的表达效率仍然非常低。如何使目的基因在蓝藻中得到高效表达仍然是一个难题。因此，开发在蓝细菌中高效表达外源基因的平台技术非常重要。

蓝细菌中的基因表达平台是指一种表达载体，按照载体在蓝细菌体内的存在形式，又分为穿梭质粒载体和基因组整合质粒载体两种。两种类型的表达载体都可以主要借助于自然转化(主要是单细胞蓝藻)或者接合转移的方法将目的基因导入蓝细菌体内。穿梭质粒载体可以通过接合转移导入蓝细菌，在细胞质中自主复制。基因组整合载体可以将目的基因乃至整个操纵子通过同源整合的方式整合到蓝藻基因组中，它的优点是表达稳定，可以克服自主复制质粒不稳定的缺点。

启动子的选择对于基因表达至关重要。rbc(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase gene)启动子是蓝细菌体内的强启动子，其产物1，5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶(RuBisCO)是蓝细菌体内主要的可溶性蛋白，在光合作用中起重要作用。rbc启动子具备在蓝细菌体内高效表达基因的能力，被成功应用在多种蓝细菌菌株中表达基因，其中包括聚球藻6301(Synechococcus PCC 6301)，鱼腥藻7120(Anabaena sp.strain PCC7120)，聚球藻7002(Synechococcus PCC 7002)，聚球藻7942(Synechococcussp.strain PCC 7942)等。

集胞藻6803(Synechocystis PCC6803)是蓝细菌中的模式菌株，其基因组序列已经于1996年被测定，并且遗传操作方法相对成熟，适合作为一株模式藻株进行转基因研究。集胞藻6803是单细胞蓝藻，可以利用自然转化接受外源DNA，也可通过接合转移的方法进行遗传操作。在集胞藻6803(Synechocystis PCC6803)中，Doron Amichay和Ruth Levitz等的研究中提到rbc启动子并且推断出了集胞藻6803中rbc启动子的具体信息，rbc操纵子中包括启动子元件和rbcL、rbcX和rbcS基因，整个操纵子在rbcL基因上游250bp处开始，并且推断在rbcS终止密码子下游有一段40bp反向互补序列为终止序列，Amichay等通过测序和分析认为在rbcL上游-15～-10区有类似SD序列，并且在翻译起始密码子上游60bp处发现两处类似-10区和-35区的序列[参见(Construction of a Synechocystis PCC6803mutant suitable for thestudy of variant hexadecameric ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenaseenzymes，Doron Amichay，Ruth Levitz and Michael Gurevitz，Plant MolecularBiology 23：465-476，1993.)]。

日本的Yasunobu Takeshima等人在聚球藻6301(也称做巢状倒囊蓝细菌Anacystis nidulans 6301)中利用本身rbc启动子表达人类超氧化物歧化酶基因hSOD，最终在突变藻株中人类超氧化物歧化酶的含量达到可溶性蛋白总量的3％。在该实验中，启动子长度为rbc基因上游343bp的序列，并在hSOD基因下游添加了294bp的rbc终止序列。Yasunobu Takeshima等人同时研究了聚球藻6301rbc启动子元件中SD序列和ATG之间的距离对基因的表达效率的影响，证明通过改变SD序列以及其与ATG之间的距离都会使表达产物hSOD的酶活性发生变动。其成果发表在美国科学院院刊上(High-levelexpression of human superoxide dismutase in the cyanobacterium Anacystisnidulans 6301，YASUNOBU TAKESHIMA^*，NOBORUTAKATSUGU^*，Proc.Nadl.Acad.Sci.USA，Vol.91，pp.9685-9689，1994)。

加拿大多伦多大学的Ming-de Deng和John R.Coleman在聚球藻7942(Synechococcus sp.strain PCC 7942)中利用自身的rbc启动子表达pdc和adh两个基因产生乙醇。其采用的启动子长度在361bp，在目的基因pdc的下游同样添加了pdc自身27bp的终止序列。并且在他们的研究中，应用了一种翻译融合策略，该策略可以使得ATG和SD序列之间的距离保持不变，使得pdc基因的表达量提高了近2倍[(Ethanol Synthesis by Genetic

Engineering in Cyanobacteria，MING-DE DENG AND JOHN R.COLEMAN，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，p.523-528，Vol.65，No.2，1999)]。

发明内容

本发明的目的在于提供一种集胞藻PCC6803表达外源基因的方法。

为实现上述目的，本发明提供的集胞藻PCC6803表达外源基因的方法，主要过程包括：

1)分别将集胞藻6803的rbcL启动子(Prbc，1.3kb)和终止序列rbcterminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壮观霉素抗性标记基因Ω，以及报告基因lacZ构建于一个集胞藻6803基因组整合质粒平台，得到已经包含报告基因的用于集胞藻6803表达外源基因并可以基因组整合的平台质粒pFQ20；

2)pFQ20转化集胞藻6803藻株，经壮观霉素抗性筛选得到转化子，用特异引物PCR鉴定基因型后，测定转化了表达平台和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，以验证集胞藻6803外源基因表达平台的表达效率。

所述的方法中，集胞藻6803的rbcL启动子(Prbc，1.3kb)和终止序列rbc terminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壮观霉素抗性标记基因Ω，以及报告基因lacZ是通过克隆获得。

所述的方法中，集胞藻6803基因组整合质粒平台是利用EcoRI酶切pKW1188，去除C.K2片段后自连，得到pKW1188SL。

本发明建立了一种运用集胞藻6803自身rbc强启动子、SD序列、rbc终止子的外源基因高效表达方法。

通过参考不同藻株来源的启动子的克隆实验，比对其他藻种中rbcL强启动子元件序列，最终克隆该基因上游1300bp作为启动子，克隆rbcS终止密码子TAA下游200bp作为终止序列，并且保证了SD序列以及SD序列和ATG之间的距离与野生型相同。本发明中同时提供了一种在单细胞蓝细菌集胞藻6803中高效表达外源基因平台的基因组整合载体。

本发明的构建策略，不仅适用于rbc启动子，同样适用于其他类型的启动子，完成对目的基因在蓝细菌中的高效表达。

本发明的构建策略，不仅可以用来表达lacZ基因，同样可以表达其他外源基因。

本发明中提出的构建策略，不仅可以应用于集胞藻，同样适用于其他类型的蓝藻。

本发明中构建的基因表达元件，可以应用于其他任何类型的蓝藻表达载体，包括其他穿梭表达载体和其他基因组整合载体。

本发明通过lacZ基因作为报告基因检测了外源基因的表达效率。

附图说明

图1为质粒pFQ1的基本结构，Prbc(0.3kb)克隆于pMD18T载体，基因片段两端带有SalI和XbaI位点；

图2为质粒pFQ2的基本结构，Trbc克隆于pMD18T载体，基因片段两端带有SmaI和SacI位点；

图3为质粒pQL4的基本结构，壮观抗性基因Ω克隆于pMD18T载体，基因两端含有SphI和SalI酶切位点；

图4为质粒pFQ6的基本结构，Prbc和Trbc串联克隆于pMD18T载体，基因片段两端带有SalI和SacI位点；

图5为质粒pKW1188SL的基本结构，内含slr0168Nterminal和slr0168C terminal，是slr0168基因的N端和C端，两者之间酶切位点是EcoRI；

图6为质粒pFQ15的基本结构，包含插入位点EcoRI，该质粒中的SmaI位点已经去除；

图7为质粒pFQ9Forward的基本结构，Ω、Prbc和Trbc串联克隆于pFQ15载体，XbaI和SmaI位点为外源基因插入位点；

图8为质粒pQL12的基本结构，lacZ基因克隆于pMD18T载体，基因两端为XbaI和SmaI位点；

图9为质粒pFQ19的基本结构，lacZ基因克隆于载体pFQ9Forward，基因两端为XbaI和SmaI位点；

图10为质粒pFQ20的基本结构，Prbc(1.3kb)替换载体pFQ19内的Prbc(0.3kb)，两端带有SalI和XbaI酶切位点；

图11为质粒pLY2的基本结构，壮观抗性基因Ω片段克隆于pKW1188SL质粒；

图12为质粒pHB 1567的基本结构，Ω片段、PpetE和lacZ基因反向插入到克隆于pKW1188SL质粒。

具体实施方式

本发明的目的是通过如下措施来达到：

1)分别将克隆所获得的集胞藻6803的rbcL启动子(Prbc，1.3kb)和终止序列rbc terminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壮观霉素抗性标记基因Ω，以及报告基因lacZ，构建于一个集胞藻6803基因组整合质粒平台(利用EcoRI酶切pKW1188，去除C.K2片段后自连，得到pKW1188SL)，得到已经包含报告基因的用于集胞藻6803表达外源基因并可以基因组整合的平台质粒pFQ20。

2)pFQ20转化集胞藻6803藻株，经壮观霉素抗性筛选得到转化子，用特异引物PCR鉴定基因型无误后，测定转化了高效表达平台和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，进而验证了本发明所构建的集胞藻6803外源基因表达平台的表达效率。

下面以具体实例来进一步说明本发明。

实施例1：分别将lacZ基因、Prbc、Trbc克隆于pMD18T载体上

1)从集胞藻6803中PCR克隆Prbc和Trbc片段；质粒pFQ1是Prbc连接到到pMD18T载体而得到的；质粒pFQ2是Trbc连接到到pMD18T载体而得到的。从大肠杆菌E.coli(BL21DE3)的克隆lacZ基因(3.1kb)，插入到pUC19质粒中。得到质粒pQL12。

2)所有的质粒都经测序鉴定目的片段的核苷酸序列无误。

实施例2：将壮观抗性基因Ω、和Prbc、Trbc分别串联克隆于同一个pMD18T载体上

1)pQL4是含有壮观抗性基因Ω的以pMD18T为来源构建的载体。以XbaI和SalI酶切质粒pQL4，回收线性片段pQL4EH；同样以XbaI和SalI酶切质粒pFQ1，回收线性DNA片段Prbc；将pQL4EH片段和片段Prbc用T4连接酶相连接，转化大肠杆菌，用壮观霉素和氨苄霉素双抗筛选转化子，再通过提质粒酶切筛选鉴定无误后，即得到质粒pFQ5；

2)同样方法，以SmaI-SacI酶切pFQ2，胶回收200bp的Trbc片段；同时以SmaI-SacI酶切pFQ5，用PCR产物纯化试剂盒纯化后得到双酶切片段pFQ5EH；利用T4连接酶将Trbc插入到pFQ5的下游，转化大肠杆菌，用壮观霉素和氨苄霉素双抗筛选转化子，再通过提质粒酶切筛选鉴定无误后，即得到质粒pFQ6；pFQ6中包含了Ω、和Prbc、Trbc片段；

实施例3：将壮观抗性基因Ω、和Prbc、Trbc和lacZ基因串联到蓝藻表达载体上

1)表达载体的构建和处理过程：pKW1188是一个用于集胞藻6803基因组整合的质粒平台。利用EcoRI酶切pKW1188，去除CK2片段后自连，得到pKW1188SL。pKW1188SL去除SmaI位点后得到质粒pFQ15。

2)目的基因的处理：用HindIII-SacI酶切pFQ6胶回收获得Ω、和Prbc、Trbc片段，利用T4聚合酶37℃补平30min，得到补平后的片段用PCR产物纯化试剂盒纯化；表达载体pFQ15用EcoRI切开后用同样方法补平并且纯化；补平后的Ω、和Prbc、Trbc片段和补平后的pFQ15片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌，得到的转化子利用特异引物PCR鉴定串联片段的插入方向，筛选到目的片段正向插入的克隆，最后提取质粒酶切鉴定无误后命名为pFQ9Forward。

3)将用XbaI和SmaI酶切pQL12，胶回收lacZ基因片段，插入到pFQ9Forward中，转化大肠杆菌，得转化子用特异引物PCR鉴定lacZ片段，最后提取质粒酶切鉴定无误后命名为pFQ19。PCR扩增1.3kb的Prbc，利用相同位点SalI和XbaI，将0.3kb的Prbc替换掉，得到pFQ20。

实施例4：表达载体向集胞藻6803的转化、基因型鉴定以及检测基因表达产物β-半乳糖苷酶的活性。

1)将pFQ20利用自然转化的方法转化集胞藻6803野生型细胞。大约1周后转化子长出，将转化子在具有壮观霉素的BG11液体中扩大培养1周后收获藻液，提取基因组。利用特异引物PCR鉴定转化子中是否含有目的基因lacZ。鉴定无误后的突变藻株命名为SynechocystisPCC6803(FQ20)。

2)待Synechocystis PCC6803(FQ20)在液体中培养至生长期后，收获藻液并测定β半乳糖苷酶活性。以Synechocystis PCC6803野生型作为阴性对照1，以Synechocystis PCC6803(LY2)作为阴性对照2，以SynechocystisPCC6803(QL15)作为阴性对照2。以被报道有半乳糖苷酶表达活性的一株藻株Synechocystis PCC6803(HB1567)作为阳性对照。其中SynechocystisPCC6803(LY2)系基因组整合有抗性基因Ω的藻株。

3)结果表明，本发明所构建的基因工程集胞藻6803FQ20的半乳糖苷酶活性，在相同条件下，超过已报道阳性对照，而所有阴性对照都未能检测到活性。

生物材料样品保藏信息

本发明涉及的生物材料样品为所构建的1个质粒(pFQ20；图10)和对应的1株大肠杆菌菌株(Escherichia coli DH5α)FQ20及1株集胞藻(Synechocystis PCC6803)FQ20；以上菌株和藻株均保藏在中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

保藏编号(以下格式为“CGMCC编号菌株号宿主菌拉丁文(质粒号)”)：

3458 FQ20 Escherichia coli DH5α(pFQ20)

3462 FQ20 Synechocystis PCC6803(pFQ20)