一个水稻PHD-finger家族蛋白基因KT496在提高植物耐逆性能上的应用

摘要

本发明公开了一个来源于水稻的与耐逆性相关的PHD-finger家族转录因子基因KT496。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对低温、高盐和干旱胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域，特别涉及来源于水稻的与抗逆相关的KT496基因在提高植物耐高盐、低温和干旱中的应用。

背景技术

水稻、玉米和小麦是我国重要的粮食作物，三大作物的产量、品质对于我国的粮食生产和粮食安全都至关重要。干旱、盐碱、高温和冻害等非生物逆境会直接影响粮食作物的正常生长和产量。利用现代农业生物技术，如转基因技术培育具有耐逆性和广泛适应性的农作物新品种，可以使农作物在逆境条件下保持稳定高产。随着转基因研究的深入，已经陆续分离克隆了一些与抗逆相关的基因，包括代谢过程中的关键调控基因，渗透调节蛋白、小分子物质，还有参与调控各种逆境应答途径的转录因子等。

PHD-finger是一类特征为Cys4-His-Cys3的锌指蛋白结构域，长约50～80个氨基酸，大小及氨基酸的排列方式均与RING-fnger(Cys3-His-Cys4)和LIM结构域(Cys-His-Cys)相似，而蛋白质3D结构差别却较大，其中PHD-finger和RING以交替支持捆绑方式结合2个锌原子，即2个锌原子结合位点分别由第1、第3对和第2、第4对金属配基组成；而LIM采用连续锌原子结合方式，即2个锌原子结合位点依此由第1、第2对与第3、第4对金属配基形成。此外，PHD-finger的疏水中心比RING多1个保守的色氨酸残基。

Schindler等最早观察拟南芥同源域蛋白(Homeodomain)HAT3和玉米Zmhoxl蛋白中均有一富含半胱氨酸的结构域，并将其命名为PHD-finger。随后证明PHD-finger并非植物特有，它也广泛存在于酵母、线虫与哺乳动物中，亦称白血病关联蛋白(Leukemia associated protein，LAP)。PHD-finger具有重要的生物学功能，主要存在于两类蛋白中：1)转录调节蛋白，如：激活子、抑制子或协因子(cofactors)等；2)染色质调节复合物(chromatin modulating complexes)相关蛋白或包含乙酰转移酶的复合物蛋白，如：p300或CBP，它可能是蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA或蛋白质与RNA相互作用区。已发现数种具PHD-finger的拟南芥蛋白质，如：参与抗病相关基因表达调控的PRHA蛋白；花粉成熟的核信号分子MS1蛋白；发育和减数分裂过程中基因表达调控的SHL和MMD1蛋白等，并克隆了它们的编码基因。

研究发现，从水稻幼胚cDNA文库中克隆的PHD-finger家族蛋白基因HAZ1具有标识球形 +胚径向轴分化的作用。从水稻中分离克隆PHD-finger家族蛋白基因，并研究其在水稻生长发育和逆境信号传导途径中的作用，直接为农作物的性状改良提供了重要的基因资源，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一个与耐逆性相关的水稻PHD-finger家族转录因子及其基因KT496，以用于提高植物的耐逆性能。

发明所提供的与耐逆性相关的KT496基因，来源于稻属水稻(Oryza sativa L.)，编码具有下述氨基酸序列的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

序列表中的SEQ ID NO：1由689个氨基酸残基组成，为蛋白KT496。

本发明中水稻与耐逆性相关的KT496的编码基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组DNA序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的编码基因可以具有序列表中SEQ IDNO：2的核苷酸序列。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增KT496任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。

本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的基因导入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。

在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的KT496基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明水稻与耐逆性相关KT496基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin系列载体(如 pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、GatewayTW系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明中水稻与耐逆性相关的KT496基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM_118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，本发明以pCAMBIA1300为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐逆性相关的KT496基因的植物表达载体命名为pCactF-KT496。携带有本发明水稻与耐逆性相关的KT496基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的KT496基因或其同源序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了一个与耐逆性相关的PHD-finger蛋白转录因子家族基因KT496。实验证明，将本发明的基因转化水稻可提高水稻对高盐、干旱和低温逆境胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1KT496基因的逆境表达谱分析。“CK”为对照；“D1”为干旱处理至叶片微卷时；“D2”为干旱处理至叶片半卷时；“D3”为干旱处理至叶片全卷时；“S1”为盐处理至叶片微卷；“S2”为盐处理至叶片半卷；“S3”为盐处理至叶片全卷；Actin为水稻内参基因。

图2表达载体pCactF的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的启动子；T35S表示35S基因的终止子；pAct表示Actin基因的启动子；3flag表示3倍的flag标签序列；OCS表示ocs基因的终止子；HindIII、KpnI、SpeI、XbaI、SalI和PstI分别表示限制性内切酶的酶切位点。

图3KT496转基因株系的耐旱性分析及存活率统计。A：旱处理前苗生长状态；B：复水前苗生长状态；C：复水一周后苗生长状态；D：旱处理后的存活率统计。

图4KT496转基因株系的耐盐性分析及存活率统计。A：盐处理前苗生长状态；B：盐处理后苗生长状态；C：正常培养一周后苗生长状态；D：盐处理后的存活率统计。

图5KT496转基因株系的耐低温分析及存活率统计。A：低温处理前苗生长状态；B：低温处理后苗生长状态；C：正常培养一周后苗生长状态；D：低温处理后的存活率统计。

图6KT496转基因株系的表达分析。“1”为质粒对照；“2”为野生型日本晴对照；“3”为转空载体对照；“4-8”为KT496转基因株系；“KT496”为KT496基因的扩增产物；“Actin”为水稻内参基因Actin的扩增产物。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。

1、KT496基因的表达谱分析

1.1植物材料及处理

选取两叶期的日本晴材料进行逆境处理。其中干旱处理的材料和样品在以下阶段收集：期1(D1)：叶轻微卷，相对含水量(RWC)在90％-95％；期2(D2)：叶半卷，相对含水量(RWC)在80％-85％；期3(D3)：叶完全卷，相对含水量在70％-75％。D1、D2和D3代表干旱处理的三个阶段。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃。

200mM高盐处理的材料和样品也分以上三个时期进行收集和保存。

KT496基因的RT-PCR分析

KT496基因的RT-PCR检测引物：

引物1：5’-gtcgacATGAATGTCTTGTGTGAAGTG-3’

引物2：5’-ctgcagCTAAAGCATCGATAACTTCGTATC-3’

KT496基因的RT-PCR扩增片段是基因全长2067bp。

Actin基因的RT-PCR引物：

引物3：5’-TGTTCCTGCCATGTATGT-3’

引物4：5’-ATGTCCCTCACAATTTCC-3’

ACTIN基因的RT-PCR扩增片段是252bp。

以上引物分别以经过步骤1.1处理后的水稻幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正常生长的中花11幼苗cDNA，检测这些基因在盐处理和干旱处理中的表达变化，PCR检测体系 和程序为：

10×buffer         2

10mM dNTP          0.4

10M引物F           0.4

10M引物R           0.4

Taq polymerase     0.4

cDNA               1

ddH2O              15.4

PCR反应条件为：

预变性：95℃，5分钟；

变性：94℃，30秒，，退火：55℃，30秒，延伸：72℃，2min，28个循环；

72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图1，其中：D表示干旱处理；S表示盐处理；字母后的数字1、2和3分别指干旱处理和盐处理的三个程度。KT496指该基因的扩增产物；Actin指水稻actin基因的扩增产物。可见，KT496基因在水稻幼苗中呈干旱和高盐诱导性。

2、KT496基因的分离

从基因的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码处设计3’端引物：

引物5：5’gtcgacATGAATGTCTTGTGTGAAGTG 3’

引物6：5’ctgcagCTAAAGCATCGATAACTTCGTATC 3’

引物1中gtcgac序列为限制性内切酶SalI的酶切位点，下划线标识的序列为KT471基因的编码序列；引物2中ctgcag序列为限制性内切酶PstI的酶切位点，下划线标识的序列为KT496基因的编码序列。

提取幼苗期的日本晴水稻的总RNA，通过反转录得到cDNA，RT-PCR方法，用以上引物扩增得到全长基因，基因长度为2067bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

具体反应为：取约2μg的总RNA，加入1μl 10×DNase buffer，1μl的DNase，补DEPC处理过的水至10μl体系，混匀，37℃温育30min后，加入1μl的RQ DNase stop solution，65℃温育10min以终止反应后，加入2μl Oligo(dT)18primer(0.1μg/μl)，4μl 5×First-strand buffer，1μl Ribonuclease inhibitor(40U/μl)，2μl 4×dNTP(各10mM)，1μl MMLV Reverse Transcriptase (200U/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后90℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA稀释10倍，取1μl作为PCR反应的模板，上、下游引物(10μM)各1μl，LATaq酶(5U/μl)0.5μl，4×dNTPs(各10mM)1μl，2×GC buffer(Mg2+)25μl，H2O 20.5μl。PCR反应条件为预热95℃5min，变性94℃1min，退火56℃30sec，延伸72℃2min10sec，34个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小与预期结果相符的DNA片段。回收并纯化上述片段，将其连接入载体pEASY-T1(全式金公司)中，通过热激法转化大肠杆菌(E.coli)TOP10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，得到含有目的片段的重组质粒，测序验证正确后，用SalI和PstI双酶切，切下目的片段，连入同样进行双酶切的pCactF植物表达载体，得到pCactF-KT496，挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落进行测序验证。植物表达载体pCactF的T-DNA区图谱如图2所示。

3、KT496转基因水稻的获得

用农杆菌介导法将按具体实施方式2获得的与耐逆性相关的基因KT496转化水稻，具体方法如下：

利用热激法将上述重组载体pCactF-KT496转入农杆菌AGL0菌株(中国科学院遗传所赠送)，利用农杆菌对水稻进行共转化。

将获得的水稻转基因植株的部分叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’和反向引物5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’的引导下，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1009bp DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了转化有pCactF-KT496的转基因水稻。

4、KT496转基因植株的耐旱性鉴定

收获KT496T1代转基因水稻种子，选取5个系进行干旱胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的KT496的T1转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期时(第3片叶完全舒展)，进行急性干旱处理。旱筛前将苗根部洗净，选生长状态(粗细、株高)一致的苗(图3A)，用吸水纸将根部水吸干，放入干燥的新三角瓶中。每瓶详细记录干旱起始时间，筛选至对照茎秆部分九成干或以上。 旱筛过程大约9个小时左右(视表型而定)，然后复水，三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。干旱处理后的苗生长状态如图3B所示，复水正常培养一周后苗恢复状态如图3C所示。最后统计各株系的苗存活率，如图3D的柱形图所示，CK的存活率为16.7％，而转KT496基因的株系的存活率均在65％及以上，存活率远高于对照。

在获得KT496转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐旱性实验，结果与上述实验结果相一致。此实验说明KT496基因具有增强水稻耐旱性的作用。

5、KT496转基因植株耐盐性鉴定

收获KT496T1代转基因水稻种子，选取5个系进行盐胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的KT496的T1转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，其生长状态如图4A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约3天左右，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷时(图4B)，洗去盐溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次盐溶液。复水第二天再更换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。一周后照相(图4C)，统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图4D(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)。实验结果显示，T1代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，KT496转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，转空载体的中花11对照(CK)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(图4C)。

在获得KT496转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐盐性实验，结果与上述实验结果相一致。此实验说明KT496基因具有增强水稻耐盐性的作用。

6、KT496转基因植株耐低温性鉴定

收获KT496 T1代转基因水稻种子，选取5个系进行低温胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的KT496的T1转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，其生长状态如图5A。开始4 ℃冷筛，当对照新叶、老叶全卷后1至2天(图5B)，重新正常培养，期间三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。低温筛选结果如图5C所示，转空载体对照株系大部分都已发黄、萎蔫、死亡，而转基因植株表现出很强的低温耐受力和恢复能力，恢复一周后的存活率统计如图5D，转基因株系的存货率均比对照要低。

在获得KT496转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐低温性实验，结果与上述实验结果相一致。此实验说明KT496基因具有增强水稻耐受低温的能力。

7、KT496转基因植株的表达分析

KT496基因的RT-PCR检测引物：

引物7：5′GATAAAGTCGAGGGGGGGCC 3′

引物8：5′CACTTGCGAAATGCTTA 3′

KT496基因的RT-PCR扩增片段是381bp。

以上引物分别以水稻KT496转基因各株系的幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正常生长的日本晴幼苗cDNA，检测KT496基因在转基因水稻中的表达情况，PCR检测体系和程序为：

10×buffer        2

10mM dNTP         0.4

10M引物F          0.4

10M引物R          0.4

Taq polymerase    0.4

cDNA              1

ddH2O             15.4

PCR反应条件为：

预变性：95℃，5分钟；

变性：94℃，30秒，，退火：55℃，30秒，延伸：72℃，2min，28个循环；

72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图6，其中，KT496指该基因的扩增产物；Actin指水稻actin基因的扩增产物。可见，KT496基因在转基因水稻幼苗中均有不同程度的表达。