轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明涉及一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)采集轮叶黑藻茎段；(2)脱毒：将轮叶黑藻茎段进行消毒；(3)诱导培养：将轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；(4)增殖培养：将轮叶黑藻不定芽接种在增殖培养基上进行增殖培养，进一步培养出大量的不定芽；(5)生根培养：将经增殖培养后得到的不定芽接种在生根培养基上进行生根培养；(6)将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下进行炼苗，取出培养瓶内的组培苗，洗净，转至池塘中养殖。本发明为生态修复净化水体、渔业养殖、有机肥堆制等提供需要，做到全年、可持续、大规模供应轮叶黑藻组培苗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养快速繁殖方法，尤其是一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，属于生物技术领域。

背景技术

轮叶黑藻(Hydrilla verticillata)是水鳌科(Hydrocharitaceae)的一种多年生沉水草本植物，普遍生长在我国各处水域中，其耐污性强，对水体的富营养化有较强的适应能力，在受污染严重的水体中也能生长，能够起到净化水体的作用，另外，该植物普遍种植于鱼塘中，为虾类、鱼类、家禽等提供饵料，大规模、大面积种植此水生植物为农业堆制有机肥提供有机质。

目前市场上对轮叶黑藻种苗需求量很大，有关轮叶黑藻的研究很少，仅集中在净化水体、鱼虾养殖应用等方面。所需的轮叶黑藻一般打捞来自于自然环境的，打捞过程中容易破坏轮叶黑藻分布，以及原有的野生环境，而且自然分布的轮叶黑藻有限，难以满足工程上的大量需求。对轮叶黑藻的快速、大量繁殖技术极为需要。目前关于轮叶黑藻的报道仅有一篇，而选用的培养成份基较为单一，获得的增殖系数较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，获得大量室内无菌的轮叶黑藻工程苗，为生态修复净化水体、渔业养殖、有机肥堆制等提供需要，做到全年、可持续、大规模供应轮叶黑藻组培苗。

按照本发明提供的技术方案，所述轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗2～4h后，除去杂质，放入无菌水中浸泡20～30min，再经无菌水冲洗3～5次，备用；

(2)脱毒：将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度70％～75％的酒精消毒4～8s，再用无菌水冲洗4～6次后，放入浓度为0.1％～0.15％的升汞中灭菌3～5min后用无菌水冲洗4～6次，置于无菌纸上晾干，切割成1～2cm；

(3)诱导培养：将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25～30天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1200～1600Lux，光照周期为10～12h/d；

(4)增殖培养：将轮叶黑藻不定芽切成成1～2cm后，接种在增殖培养基上进行增殖培养25～35d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1200～1600Lux，光照周期为10～12h/d；

(5)生根培养：将经增殖培养后得到的不定芽切割成1～2cm，并带有2～3个小节段，接种在生根培养基上进行生根培养30～35d；培养室温度为25±2℃，光照强度为1200～1600Lux，光照周期为10～12h/d；

(6)将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下2～3d进行炼苗，炼苗温度在10～30℃，室内光照强度为1000～1200Lux，取出培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。

其中的h是小时，d是天。

所述诱导培养基为1/2MS培养基中加入0.1～0.3mg/L的6-BA或0.1～0.3mg/L的NAA；所述增殖培养基为MS培养基加入0.5～1.0mg/L的6-BA与0.1～0.3mg/L的NAA；所述生根培养基为MS培养基加入0.2～0.4mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA和0.2～0.4mg/L的IBA；所述MS培养基的成分由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、蔗糖和琼脂组成。

所述MS培养基的成分包括：

所述大量元素为：(1)NH₄NO₃，1650gm/L；(2)KNO₃，1900mg/L；(3)CaCl·2H₂O，440mg/L；(4)MgSO₄·7H₂O，370mg/L；(5)KH₂PO₄，170mg/L；

所述微量元素为：(1)MnSO₄·H₂O，22.3mg/L；(2)ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；(3)CoCl·6H₂O，0.025mg/L；(4)CuSO₄·5H₂O，0.02mg/L；(5)H₃BO₃，6.2mg/L；(6)Na₂MO₄·2H₂O，0.25mg/L；(7)KI，0.83mg/L；

所述有机成分为：(1)烟酸，0.5mg/L；(2)盐酸吡哆醇，0.5mg/L；(3)盐酸硫胺素，0.1mg/L；(4)肌醇，100mg/L；(5)甘氨酸，2mg/L；

所述铁盐为：(1)FeSO₄·7H₂O，28.7mg/L；(2)Na₂-EDTA，37.3mg/L；

所述蔗糖为30000mg/L；

所述琼脂为5800～6200mg/L。

所述1/2MS培养基的成分是MS培养基的一半。

所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基在温度为120～121℃、压力为0.103～0.105MPa的条件下灭菌18～20min。

本发明利用植物组织培养技术，获得大量室内无菌的轮叶黑藻工程苗，为生态修复净化水体、渔业养殖、有机肥堆制等提供需要，做到全年、可持续、大规模供应轮叶黑藻组培苗；本发明改进了轮叶黑藻初代培养时灭菌方式，降低了初代培养时的污染，提高初代诱导的成活率，使成活率达70％以上，并且改良了基本培养基，以及在培养基中加入不同的激素，添加一定浓度的激素使得在培养过程中诱导不定芽更多，在增殖培养时，每个小芽可以诱导16个芽以上，在生根培养中添加不同激素的一定浓度，使得生根过程中，生根数增更多，每个芽生根在10条以上，而且根粗壮。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明使用的诱导培养基为1/2MS培养基中加入0.1～0.3mg/L的6-BA或0.1～0.3mg/L的NAA；增殖培养基为MS培养基加入0.5～1.0mg/L的6-BA与0.1～0.3mg/L的NAA；生根培养基为MS培养基加入0.2～0.4mg/L的6-BA、0.1～0.3mg/L的NAA和0.2～0.4mg/L的IBA；所述MS培养基的成分由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、蔗糖和琼脂组成。

所述MS培养基的成分包括：

所述大量元素为：(1)NH₄NO₃，1650gm/L；(2)KNO₃，1900mg/L；(3)CaCl·2H₂O，440mg/L；(4)MgSO₄·7H₂O，370mg/L；(5)KH₂PO₄，170mg/L；

所述微量元素为：(1)MnSO₄·H₂O，22.3mg/L；(2)ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；(3)CoCl·6H₂O，0.025mg/L；(4)CuSO₄·5H₂O，0.02mg/L；(5)H₃BO₃，6.2mg/L；(6)Na₂MO₄·2H₂O，0.25mg/L；(7)KI，0.83mg/L；

所述有机成分为：(1)烟酸，0.5mg/L；(2)盐酸吡哆醇，0.5mg/L；(3)盐酸硫胺素，0.1mg/L；(4)肌醇，100mg/L；(5)甘氨酸，2mg/L；

所述铁盐为：(1)FeSO₄·7H₂O，28.7mg/L；(2)Na₂-EDTA，37.3mg/L；

所述蔗糖为30000mg/L；

所述琼脂为5800～6200mg/L。

所述1/2MS培养基的成分是MS培养基的一半。

所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基均在温度为120～121℃、压力为0.103～0.105MPa的条件下灭菌18～20min。

实例一：一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗2h后，除去杂质，放入无菌水中浸泡20min，再经无菌水冲洗3次，备用；

(2)脱毒：将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度70％的酒精消毒4s，再用无菌水冲洗4次后，放入浓度为0.1％的升汞中灭菌3min后用无菌水冲洗4次，置于无菌纸上晾干，切割成1cm；

(3)诱导培养：将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1200Lux，光照周期为10h/d；污染率在10％以内，初代诱导诱导率达80％以上；

(4)增殖培养：将轮叶黑藻不定芽切成成1cm后，接种在增殖培养基上进行增殖培养25d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1200Lux，光照周期为10h/d；

(5)生根培养：将经增殖培养后得到的不定芽切割成1cm，并带有2～3个小节段，接种在生根培养基上进行生根培养30d；培养室温度为25±2℃，光照强度为1200Lux，光照周期为10h/d；

(6)轮叶黑藻茎段经生根培养出大量的根，生根在10个以上根系发达，而且长势也比较好，轮叶黑藻长度在5cm左右，将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下2d进行炼苗，炼苗温度在10℃，室内光照强度为1000Lux；取出培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。

实例二：一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗4h后，除去杂质，放入无菌水中浸泡30min，再经无菌水冲洗5次，备用；

(2)脱毒：将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度75％的酒精消毒8s，再用无菌水冲洗6次后，放入浓度为0.15％的升汞中灭菌5min后用无菌水冲洗6次，置于无菌纸上晾干，切割成2cm；

(3)诱导培养：将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养30天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1600Lux，光照周期为12h/d；污染率在20％以内，初代诱导诱导率达90％以上；

(4)增殖培养：将轮叶黑藻不定芽切成成2cm后，接种在增殖培养基上进行增殖培养35d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1600Lux，光照周期为12h/d；

(5)生根培养：将经增殖培养后得到的不定芽切割成2cm，并带有3个小节段，接种在生根培养基上进行生根培养35d；培养室温度为25±2℃，光照强度为1600Lux，光照周期为12h/d；

(6)轮叶黑藻茎段经生根培养出大量的根，生根在10个以上根系发达，而且长势也比较好，轮叶黑藻长度在5cm左右，将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下3d进行炼苗，炼苗温度在30℃，室内光照强度为1200Lux；取出培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。

实例三：一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗3h后，除去杂质，放入无菌水中浸泡25min，再经无菌水冲洗4次，备用；

(2)脱毒：将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度75％的酒精消毒6s，再用无菌水冲洗5次后，放入浓度为0.15％的升汞中灭菌4min后用无菌水冲洗5次，置于无菌纸上晾干，切割成1～2cm；

(3)诱导培养：将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1500Lux，光照周期为12h/d；污染率在15％以内，初代诱导诱导率达85％以上；

(4)增殖培养：将轮叶黑藻不定芽切成成1～2cm后，接种在增殖培养基上进行增殖培养30d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25±2℃，光照强度为1400Lux，光照周期为12h/d；

(5)生根培养：将经增殖培养后得到的不定芽切割成1～2cm，并带有2～3个小节段，接种在生根培养基上进行生根培养30d；培养室温度为25±2℃，光照强度为1400Lux，光照周期为12h/d；

(6)轮叶黑藻茎段经生根培养出大量的根，生根在10个以上根系发达，而且长势也比较好，轮叶黑藻长度在5cm左右，将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下3d进行炼苗，炼苗温度在20℃，室内光照强度为1200Lux；取出培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。