一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法

摘要

本发明公开了一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法。本发明提供的分离粘孢子虫孢子的方法，包括如下步骤：a)从感染粘孢子虫宿主中分离粘孢子虫孢子囊；b)用浓度为10g/l的PBS冲洗步骤a)得到的粘孢子虫孢子囊，得到粘孢子虫孢子溶液；c)将步骤b)得到的粘孢子虫孢子溶液离心、收集沉淀；d)向步骤c)得到的沉淀中加入浓度为10g/l的PBS和10g/l SDS，混合，离心，收集沉淀。本发明的实验证明，用本方法提取的基因组，基因组DNA的纯度高，不含有宿主的基因，而且提取量多。而且本方法可以用于鉴定粘孢子虫孢子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法。

背景技术

粘孢子虫指粘孢子纲(Myxosporea)的一大类原虫，是在海水及淡水鱼类寄生虫中种类最多、最为常见的一类孢子虫。粘孢子虫在发育过程中，无例外地产生种种形状和不同大小的孢子，故称为粘孢子虫。

国内外，粘孢子虫病的流行相当普遍和严重，至今仍未有比较有效的控制方法。常见的防治方法多采用生石灰和石灰氮作器具消毒。在中国各养鱼地区，流行着多种粘孢子虫病，例如鲢碘孢虫流行于浙江杭州地区以及江苏、湖北、湖南等省，它侵入白鲢的神经系统和感觉器官，使病鱼体瘦，尾巴上翘，上下打转，不久即死亡；饼型碘泡虫常大量侵袭草鱼苗的内脏组织和鳃，主要是肠道，严重危害草鱼苗的生产，这种病在中国以广东最为严重；流行于广东和广西的“埋坎病”，其主要病原体是野鲤碘泡虫。常出现在鲤、鲫鱼皮肤上的鲮单极虫，往往使鱼体布满白色点状或块状孢囊，严重影响鱼的生长发育，甚至引起死亡。

每一种粘孢子虫在寄主中有它的寄生部位。在淡水鱼类中，鳃、肠和胆囊是最常被侵袭的器官；海洋鱼类的胆囊和膀胱往往寄生1种或多种粘孢子虫。当粘孢子虫感染鱼体时会形成滋养体，滋养体继续发育，胞核反复多次分裂，形成几个孢母体(sporonts)。孢母体继续生长发育，其胞核也进行几次分裂，形成6～18个子核，最后形成孢子。滋养体继续生长，形成的孢子数目也随之增多。在滋养体周围的寄主组织，因不断受刺激而发生退化和改变，产生一层膜将滋养体包围，出现肉眼可见的白色粘孢子虫孢囊。

粘孢子虫的生活史还不完全清楚。对整个生活周期中核的变化、感染方法以及有无中间寄主等方面，也存在着较多的争论。有研究表明Myxobolus cerebralis、Ceratomyxa shasta的孢子不能直接感染鲑鱼，需要颤蚓科的蠕虫作为中间宿主，但是也存在鱼与鱼之间能够直接感染的粘孢子虫种类，如Enteromyxum等。

从鱼类宿主中分离粘孢子虫孢子并提取纯化基因组DNA是对粘孢子虫分类鉴定研究的基础；同时也是防治孢子虫感染的重要研究基础和发展方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取粘孢子虫基因组DNA方法。

本发明提供的提取粘孢子虫基因组DNA方法，包括如下步骤：

1)将粘孢子虫孢子研磨成粉，加入提取液混匀，得到混合液；

2)向步骤1)的混合液中加入氯仿异戊醇混合液混匀、离心，收集上清液；

3)向步骤2)得到的上清液中加入氯仿异戊醇混合液混匀，离心，收集上清液；

4)向步骤3)得到的上清液中加入异丙醇混匀，静置，收集沉淀；

5)将步骤4)得到的沉淀依次进行漂洗、干燥、溶解、RNA消化，得到消化产物；

6)将步骤5)得到的消化产物依次用酚氯仿异戊醇混合液和氯仿异戊醇混合液进行抽提，离心、收集上清液；

7)向步骤6)得到的上清液中加入3MNaAc水溶液和无水乙醇混匀，静置，离心，收集沉淀，得到DNA。

步骤1)中，所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比为(10ml-50ml)∶(1.5g-2g)，所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比具体为(10ml、40ml或50ml)∶(1.5g、1.8g或2g)；

步骤2)中，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为1∶(1-2)，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1∶1、1∶1.5或1∶2，

步骤3)中，所述步骤2)的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为1∶(1-2)，所述步骤2)的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1∶1、1∶1.5或1∶2，

步骤4)中，所述步骤3)得到的上清液和所述异丙醇的体积比为(1-3)∶(1-2)；所述步骤3)得到的上清液和所述异丙醇的体积比具体为1∶1、3∶2或3∶1；所述异丙醇的温度为-20℃；

步骤5)中，所述漂洗为依次用75％(体积百分含量)乙醇水溶液、75％(体积百分含量)乙醇水溶液和无水乙醇进行漂洗；

所述溶解的方法为用TE缓冲液溶解所述沉淀得到溶液A，

TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述TE缓冲液中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为1mM，用盐酸调PH值至8.0。

所述消化的方法为向所述溶液A中加入RNaseA得到消化产物，RNaseA加入量为20mg/l溶液A；

步骤6)包括如下步骤：

A)将步骤5)得到的消化产物和是其1倍-3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液混匀，离心，收集上清液A，

所述将步骤5)得到的消化产物和是其1倍-3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液具体为将步骤5)得到的消化产物和是其1倍、2倍或3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液；

B)将步骤A得到的上清液A和是其1倍-3倍体积的氯仿异戊醇混合液混匀，离心，收集上清液，

所述将步骤A)得到的上清液A和是其1倍-3倍体积的氯仿异戊醇混合液具体为将步骤A)得到的上清液A和是其1倍、2倍或3倍体积的氯仿异戊醇混合液；

步骤7)中，所述步骤6)得到的上清液、所述3MNaAc水溶液和所述无水乙醇的体积比为：1∶(0.05-0.2)∶(2-3)，具体为1∶(0.005、0.1或0.2)∶(2、2.5或3)。

步骤1)中，所述提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水，所述Tris在所述提取液中的浓度为0.1M-0.5M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0.4M-0.6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度为0.005M-0.015M，；所述SDS在所述提取液中的浓度为10g/l-20g/l；

所述Tri s在所述提取液中的浓度具体为0.1M、0.2M或0.5M，所述NaCl在所述提取液中的浓度具体为0.4M、0.5M或0.6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度具体为0.005M、0.01M或0.015M；所述SDS在所述提取液中的浓度具体为10g/l、15g/l或20g/l；

所述提取液的PH值为7.5；

步骤2)、步骤3)和步骤6)中，所述氯仿异戊醇混合液均由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比均为24∶1；

步骤4)中，所述静置时间为20min-40min，所述静置时间具体为20min、30min或40min；

所述静置的温度为-20℃-4℃，所述静置的温度具体为-20℃、0℃或4℃；

步骤5)中，所述消化的温度为35℃-38℃，所述消化的温度具体为35℃、37℃或38℃，所述消化的时间为0.5h-1.5h，所述消化时间具体为0.5h、1h或1.5h；

步骤6)中，所述离心的温度为0℃-4℃，所述离心的温度具体为0℃、1℃或4℃，所述离心的离心力为10000g-13000g，所述离心的离心力具体为10000g、12000g或13000g，所述离心的时间为5min-15min，所述离心的时间具体为5min、10min或15min；

所述酚氯仿异戊醇混合液由酚、氯仿和异戊醇组成，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1；所述酚氯仿异戊醇混合液的PH值为8.0；

步骤7)中，所述离心的温度为0℃-4℃，所述离心的温度具体为0℃、1℃或4℃，所述离心的离心力为10000g-13000g，所述离心的离心力具体为10000g、12000g或13000g，所述离心的时间为5min-15min，所述离心的时间具体为5min、10min或15min。

步骤1)中，所述研磨为在液氮中研磨；

步骤2)和步骤3)中，所述离心的温度均为0℃-4℃，所述离心的温度均具体为0℃、1℃或4℃，所述离心的离心力均为10000g-13000g，所述离心的离心力均具体为10000g、12000g或13000g，所述离心的时间均为5min-15min，所述离心的时间均具体为5min、10min或15min；

步骤7)中，所述静置时间为20min-60min，所述静置时间具体为20min、30min或60min；所述静置温度为-70℃-20℃，所述静置温度具体为-70℃、0℃、20℃。

所述粘孢子虫为单极虫属、吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。

本发明的另一个目的是提供一种分离粘孢子虫孢子的方法。

本发明提供的分离粘孢子虫孢子的方法，包括如下步骤：

a)用PBS缓冲液冲洗粘孢子虫孢子囊，得到粘孢子虫孢子溶液；

b)将步骤a)得到的粘孢子虫孢子溶液离心、收集沉淀；

c)向步骤b)得到的沉淀中加入PBS缓冲液和SDS水溶液，混合，离心，收集沉淀；

d)向步骤c)得到的沉淀中加入PBS缓冲液和SDS水溶液，混合，离心，收集沉淀，即为粘孢子虫孢子。

步骤b)中，所述离心的离心力为5000g-8000g，具体为5000g、6000g或8000g，所述离心的时间为5min-15min，具体为5min、10min或15min，

步骤c)和步骤d)中，所述PBS缓冲液与所述SDS水溶液的体积比为：10∶0.5。

步骤a)、c)和d)中，所述PBS缓冲液按照如下方法配制：将NaCl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和水混合得到PBS缓冲液，NaCl在PBS缓冲液中的浓度为8g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为2.2g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为0.4g/l；所述PBS缓冲液的PH值均为7.0；

步骤c)和d)中，所述混合的温度均为24℃-28℃，所述混合的温度均具体为24℃、25℃或28℃，所述混合的时间均为5min-15min，所述混合的时间均具体为5min、10min或15min，所述混合的方式均为颠倒混合；所述SDS水溶液的浓度均为200g/l。

步骤c)和d)中，所述离心的离心力均为6000g-10000g，所述离心的离心力均具体为6000g、8000g或10000g，所述离心的时间均为5min-15min，所述离心的时间均具体为5min、10min或15min。

所述粘孢子虫为单极虫属、吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。

所述的方法在粘孢子虫分类鉴定中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，用本方法提取的基因组，经过检测，基因组DNA的纯度高，不含有宿主的基因，而且提取量多，因此可以用来鉴定粘孢子虫孢子。

附图说明

图1为DM3粘孢子虫基因组样品PCR扩增结果

图2为尾孢虫属孢子形态特征

图3为碘泡虫属孢子形态特征

图4为单极虫属孢子形态特征

图5为染色后单极虫属孢子形态特征

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、提取粘孢子虫基因组DNA

方法一：

一、粘孢子虫基因组DNA提取

1、从感染粘孢子虫宿主分离孢子囊

粘孢子虫的感染和孢子囊的生长部位具有很高的特异性，因此在取样时只取同一部位生长的孢子囊。

从感染粘孢子虫的死的鲫鱼(Cyprinus carpio)肠道部位中解剖分离出6个粘孢子虫孢子囊，分别编号为DM1-DM6。

2、从孢子囊中分离粘孢子虫孢子颗粒

用灭菌的PH值为7.0的PBS小心将孢子颗粒从1个孢子囊(DM1)中冲洗出，操作中尽量细致，防止孢子囊壁的组织细胞混入孢子颗粒中，即得到含有粘孢子虫孢子的样品。

将样品转移至50ml离心管4℃保存。

PBS缓冲液按照如下方法配制：将NaCl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和水混合，NaCl在PBS缓冲液中的浓度为8g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为2.2g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为0.4g/l。

3、去除粘孢子虫混有的宿主细胞

将得到的含有粘孢子虫孢子的样品以6000×g离心10min，小心倒掉上清液；向沉淀中加入10ml灭菌PH值为7.0的PBS，再加入0.5ml浓度为200g/l的SDS水溶液，至其终浓度达到10g/l，在25℃处理10min期间颠倒混匀，再以8000×g离心10min小心倒掉上清液；向离心管中加入灭菌PBS，重悬孢子，再重复SDS处理操作两次；操作过程中不断进行镜检，观察孢子沉淀情况及孢子纯度，将得到的粘孢子虫孢子沉淀置于-20℃保存。

4、应用液氮研磨的方法提取基因组DNA

取上述2.0g粘孢子虫孢子沉淀在液氮中迅速研磨成粉；加入10mL提取液，快速振荡混匀；加入等体积的的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1)混匀，以4℃，12,000g，离心10min。上清液再用等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1)抽提一次。以4℃，12,000g，离心10min。取上清液，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇沉淀，混匀，静置约30min。用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中，加入1μlRNaseA(10mg/mL)，37℃下处理1h，得到的消化产物和是其1倍体积酚氯仿异戊醇混合液(pH8.0，酚氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1)混合，以4℃，12,000g，离心10min。取上清液A，将上清液A和是其1倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1混匀，以4℃，12,000g，离心10min。取上清液，加入1/10倍体积的3MNaAc水溶液，2.5倍体积的无水乙醇，-70℃静置沉淀30min。沉淀用75％乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，得到DNA样品，命名为DM1，-20℃保存。

DNA提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水，所述Tris在所述提取液中的浓度为0.2M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0.5M，所述EDTA在所述提取液中的浓度为0.01M；所述SDS在所述提取液中的浓度为15g/l；DNA提取液的pH值为7.5。

TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述Tris碱中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为1mM，用盐酸调PH值至8.0。

方法二：

一、粘孢子虫基因组DNA提取

1、从感染粘孢子虫宿主分离孢子囊

粘孢子虫的感染和孢子囊的生长部位具有很高的特异性，因此在取样时只取同一部位生长的孢子囊。

从感染粘孢子虫的死的鲫鱼(Cyprinus carpio)肠道部位中分离出粘孢子虫孢子囊。

2、从孢子囊中分离粘孢子虫孢子颗粒

用灭菌的PH值为7.0的PBS小心将孢子颗粒从1个孢子囊中冲洗出，操作中尽量细致，防止孢子囊壁的组织细胞混入孢子颗粒中，即得到含有粘孢子虫孢子的样品。

将样品转移至50ml离心管4℃保存。

PBS缓冲液按照如下方法配制：将NaCl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和水混合，NaCl在PBS缓冲液中的浓度为8g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为2.2g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为0.4g/l。

3、去除粘孢子虫混有的宿主细胞

将得到的含有粘孢子虫孢子的样品以5000×g离心5min，小心倒掉上清液；向沉淀中加入10ml灭菌PBS，再加入0.5ml浓度为200g/l的SDS水溶液，至其终浓度达到10g/L，在24℃处理5min期间颠倒混匀，再以6000×g离心5min小心倒掉上清液；向离心管中加入灭菌PBS，重悬孢子，再重复SDS处理操作两次；操作过程中不断进行镜检，观察孢子沉淀情况及孢子纯度，将得到的粘孢子虫孢子沉淀置于-20℃保存。

4、应用液氮研磨的方法提取基因组DNA

取上述1.5g粘孢子虫孢子沉淀在液氮中迅速研磨成粉；加入40mL提取液，快速振荡混匀；加入1.5倍体积氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1)混匀，以0℃，10,000g，离心5min。上清液再用1.5倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1)抽提一次。以0℃，10,000g，离心5min。取上清液，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇沉淀，混匀，静置约20min。用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中，加入1μlRNaseA(10mg/mL)，35℃下处理0.5h。得到的消化产物和是其2倍体积酚氯仿异戊醇混合液(pH8.0，酚氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1)混合，以0℃，10,000g，离心5min。取上清液A，将上清液A和是其2倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1混匀，以0℃，10,000g，离心5min。取上清液，加入0.005倍体积的3MNaAc水溶液，2倍体积的无水乙醇，0℃静置沉淀20min。沉淀用75％乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，得到DNA样品，命名为DM1，-20℃保存。

DNA提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水，所述Tris在所述提取液中的浓度为0.1M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0.4M，所述EDTA在所述提取液中的浓度为0.005M；所述SDS在所述提取液中的浓度为10g/l；DNA提取液的pH值为7.5。

TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述Tris碱中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为1mM，用盐酸调PH值至8.0。

方法三：

一、粘孢子虫基因组DNA提取

1、从感染粘孢子虫宿主分离孢子囊

粘孢子虫的感染和孢子囊的生长部位具有很高的特异性，因此在取样时只取同一部位生长的孢子囊。

从感染粘孢子虫的死的鲫鱼(Cyprinus carpio)肠道部位中分离出粘孢子虫孢子囊。

2、从孢子囊中分离粘孢子虫孢子颗粒

用灭菌的PH值为7.0的PBS小心将孢子颗粒从1个孢子囊中冲洗出，操作中尽量细致，防止孢子囊壁的组织细胞混入孢子颗粒中，即得到含有粘孢子虫孢子的样品。

将样品转移至50ml离心管4℃保存。

PBS缓冲液按照如下方法配制：将NaCl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和水混合，NaCl在PBS缓冲液中的浓度为8g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为2.2g/l，Na₂HPO₄在PBS缓冲液的浓度为0.4g/l。

3、去除粘孢子虫混有的宿主细胞

将得到的含有粘孢子虫孢子的样品以8000×g离心15min，小心倒掉上清液；向沉淀中加入10ml灭菌PBS，再加入0.5ml浓度为200g/l的SDS水溶液，至其终浓度达到10g/l，在28℃处理15min期间颠倒混匀，再以10000×g离心15min小心倒掉上清液；向离心管中加入灭菌PBS，重悬孢子，再重复SDS处理操作两次；操作过程中不断进行镜检，观察孢子沉淀情况及孢子纯度，将得到的粘孢子虫孢子沉淀置于-20℃保存。

4、应用液氮研磨的方法提取基因组DNA

取上述1.8g粘孢子虫孢子沉淀在液氮中迅速研磨成粉；加入50mL提取液，快速振荡混匀；加入2倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1)混匀，以1℃，13,000g，离心15min。上清液再用2倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1)抽提一次。以1℃，13,000g，离心15min。取上清液，加入1/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇沉淀，混匀，静置约40min。用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中，加入1μlRNaseA(10mg/mL)，38℃下处理1.5h，得到的消化产物和是其3倍体积酚氯仿异戊醇混合液(pH8.0，酚氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1)混合，以1℃，13,000g，离心15min。取上清液A，将上清液A和是其3倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为24∶1混匀，以1℃，13,000g，离心15min。取上清液，加入0.2倍体积的3MNaAc水溶液，3倍体积的无水乙醇，20℃静置沉淀60min。沉淀用75％乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，得到DNA样品，命名为DM1，-20℃保存。

DNA提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水，所述Tris在所述提取液中的浓度为0.5M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0.6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度为0.015M；所述SDS在所述提取液中的浓度为20g/l；用盐酸调节PH值为7.5；

TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述Tris碱中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为1mM，用盐酸调PH值至8.0。

检测上述方法一提取DM2、DM3、DM4、DM5和DM6这5个孢囊中孢子的DNA。

二、检测结果

1、检测DNA的含量

用紫外分光法测定方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA的纯度和含量。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。通过检测同一样品的0D260、0D280和0D230，计算其比值来测定样品的纯度。

结果为方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA的0D260/0D280均为1.8(＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染)；

对于方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA样品，通过测定260nm的光吸收值即可算出含量(将样品放入仪器中即可直接读出浓度和纯度的相关数值，Thermo Scientific NanoDrop公司Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪)，实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示：

表1目前获得DNA样品量：

2、应用PCR的方法验证基因组DNA的纯度

设计了两对引物：

Rag1：DNA重组激活基因(Recombination activating genes RAG，genbank号为AY78704)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因，也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的，全长718bp左右，设计引物如下：

Rag1-R：5’-GACACTATGGAGAAAGGGAGGTGGAGTT-3’

Rag1-F：5’-GGGAAGCAGAGGTCGCAGTTGGAGG-3’

S7：核糖体蛋白基因(genbank号为AY103168)，在关系较远的脊椎动物类群中均表现出较高相似性；而且鱼类S7基因明显较两栖类和人类结构紧凑而被用作宿主基因内含子编码功能研究的有效模型，全长900bp，设计引物如下：

S7-R：5’-TGAACTCGTCTGGCTTTTCGCC-3’

S7-F：5’-GCCTCTTCCTTGGCCGTC-3’

以上述方法一提取的粘孢子虫DM3的DNA为模板，分别用Rag1的引物(Rag1-R和Rag1-F)和S7的引物(S7-R和S7-F)，进行PCR扩增，以锦鲤的基因组DNA和鲤鱼的基因组DNA为对照。

结果如图1所示，其中，F为锦鲤基因组DNAPCR扩增结果；L为鲤鱼基因组DNAPCR扩增结果；箭头指示位700bp。从图中看基因，说明提取的粘孢子虫DM3DNA比较纯，没有感染宿主的基因(Rag1和S7)。表明目前出，在F和L中均能检测出Rag1和S7的基因，而在提取的粘孢子虫DNA中没有Rag1和S7的的提取方法可以达到用PCR检测没有宿主基因。

采用同样的方法检测方法一提取DM1、DM2、DM4、DM5和DM6的DNA，结果与DM3无显著差异。

3、测序样品分类

1)、分子鉴定

对测序样品分类地位的分子鉴定是通过对18SrRNA序列分析完成的。18SrRNA序列全长2K左右。比较不同孢子囊来源样品的18SrRNA序列，如果5K左右序列能够完全一致则认为是同一个种的单极虫。

以上述方法一提取的粘孢子虫DNA(DM1)为模板，18SrRNA引物5’-CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT-3’；5’-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3’作为引物进行扩增，得到18SrRNA，将得到的18SrRNA进行测序，结果为18SrRNA的DNA序列如序列表中序列1所示。

将18SrRNA在genbank上进行比对，发现该粘孢子虫的18SrRNA序列与已注册的吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)(GQ396677)具有最高一致性，为99％，可以说明该粘孢子虫为吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。

采用上述方法检测方法一得到的DM2-DM6的粘孢子虫，结果与DM1无显著差异。

2)、宿主种类和寄生部位分析

观察(DM1-DM6)粘孢子虫的寄生宿主和部位，结果为粘孢子虫的宿主种类均为鲫鱼(Cyprinus carpio)、寄生部位均为肠道。

3)、孢子形态特征分析

用显微镜观察粘孢子虫的孢子形态特征，以多涅茨尾孢虫(Henneguya doneciSchulman，1962)(尾孢虫属，记载在四川省鱼类寄生粘孢子虫：IV尾孢虫和单极虫；重庆师范学院学报(自然科学版)；马成伦，董新民，王慈生；16卷，1期，12-15；1999，公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。)和圆形碘泡虫(Myxobolus rotundusNemeczek，1911)(碘泡虫属，记载在圆形碘泡虫孢子发生的超微结构研究；水生生物学报；吴英松，汪建国；25卷，1期；61-69；2001，公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。)为对照，结果见图2-5，其中图2为尾孢虫属(多涅茨尾孢虫Henneguyadoneci Schulman，1962)，图3为碘泡虫属(圆形碘泡虫(Myxobolus rotundusNemeczek，1911)，图4为方法一得到DM1的粘孢子虫的图(放大100倍)，图5为染色后方法一得到DM1的粘孢子虫的图(放大1000倍)；

从图中可以看出：

碘泡虫属：孢子卵形或椭圆形，扁平，前端有2个极囊，等大或不等，孢中质中有1个嗜碘泡。

尾孢虫属：孢子圆形、卵形或纺锤形，极囊2个，由壳片向后部延伸出两条尾突。

粘孢子虫DM1：孢子一般较大，呈梨形或囊形，壳面与缝面宽度相差甚少，故横断面几近圆形。只有1个极囊，一般较大，常为孢子长度的1/2，极丝常呈扭曲的扁带，孢中质中尚有油滴状的发光颗粒，有1个嗜碘泡，这些为单极虫属碘泡虫科的显著特征。因此确定，方法一得到的DM1粘孢子虫为单极虫属。

采用上述方法检测方法一得到的DM2-DM6粘孢子虫，结果与DM1无显著差异。

碘泡虫科主要包括尾孢子虫属、碘泡虫属和单极虫属，其中碘泡虫属孢子虫在国外研究最广泛，其主要感染虹鳟，而吉陶单极虫是典型的肠道寄生虫，即只有吉陶单极虫的包囊生长在肠道部位，其定植部位是肠道粘膜下层的疏松结缔组织，可以直接通过宿主和组织特异性确定，而不需要细致的形态特征鉴定。目前报道显示碘泡虫科的不同属来源的孢子在外形有显著差别。

通过以上实验可以，通过四点证明样品的种属：宿主种类、寄生部位、孢子形态特征、18S序列相似性分析，因此，说明DM1-DM6的粘孢子虫属于碘泡虫科，单极虫属，吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。

采用同样的方法检测方法二和方法三得到的粘孢子虫，结果与方法一无显著差异。