一种采用重组大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法

摘要

一种采用重组大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法，属于纺织生物技术领域。化学合成氧化型PVA水解酶的基因序列(oph)，构建重组质粒pET-20b(+)-oph并转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到分泌表达氧化型PVA水解酶的基因工程菌JM109-oph，应用该菌种可实现氧化型PVA水解酶的生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化型PVA水解酶(oxidized polyvinyl alcohol hydrolase，EC3.7.1.7，简称OPH)的生产方法，特别是一种采用大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法，属于纺织生物技术领域。

背景技术

PVA(全称polyvinyl alcohol)，即聚乙烯醇，是一种人工合成的水溶性的高分子化合物。凭借其在物理性质：黏度、柔韧性、抗拉强度、弹性、pH稳定性等方面的优良特性，PVA可用于生产涂料、粘合剂、纤维浆料、纸品加工剂、乳化剂、分散剂、薄膜等产品，现已广泛应用于纺织、造纸等轻工业领域。

但是伴随着PVA在工业上的大量应用，尤其是纺织工业中，在退浆的时候大量的PVA也随着污水进入到河流当中，其稳定的物理性质使其很难被降解，因此造成很大的污染。目前在纺织工业中，传统的退浆过程是用高温加酸/碱或是用氧化剂来破坏PVA的长链结构使其降解，但是与此同时也对棉纤维造成了较大的损伤，而且十分浪费能源！于是人们寻求运用生物降解的方法来处理PVA，这样做既节约能源又环保。

一般来讲，PVA的生物降解的分两步进行一般来讲，PVA的降解主要是两步反应：①在PVA脱氢酶(PVADH)或者仲醇氧化酶(SAO)的催化作用下，PVA上的羟基被氧化成羰基，形成β-二酮结构，即氧化型PVA(oxidized PVA)；②在β-二酮水解酶(BDH)或者氧化型PVA水解酶(OPH)的催化作用下，将β-二酮键切开形成一分子的羧酸结构和一分子甲基酮结构。

2005年，Wilailak Klomklang等人报道了Sphingopyxis sp.113P3中OPH的基因序列，该序列含有1095bp，编码364个氨基酸残基，其中包括一个信号肽和一个成熟蛋白质(WilailakKlomklang et al，Biochemical and molecular characterization of a periplasmic hydrolase foroxidized polyvinyl alcohol from Sphingomonas sp.strain 113P3)。在进一步的研究发现，OPH为胞外酶，分布在周质空间内，呈组成型表达，底物特异性比较高，仅对氧化型PVA和对硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)有催化效果。OPH的氨基酸序列中有脂肪酶共识学列，而且可以被丝氨酸蛋白特异性抑制剂(PMSF)完全抑制，据此推断OPH为丝氨酸型水解酶。但是在做oph基因克隆表达的时候，重组蛋白却没有催化氧化型PVA和对硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)的活性。而且OPH底物特异性较强，仅对氧化型PVA和PNPA有催化效果。

国外对PVA水解酶的研究主要侧重于其基因报道和降解机理上，而对PVA水解酶酶活的提高以及进一步的工业化生产研究很少，鉴于PVA水解酶广阔的应用前景而且目前PVA酶活较低的现实情况，构建出高产、有效分泌到胞外及诱导方式廉价的基因工程菌是急待解决的问题。

我国对PVA降解的研究主要侧重于发酵优化，即从自然界筛选菌株进而进行发酵优化或者是进行混菌发酵，以此来提高PVA水解酶酶活。但是，几乎没有关于PVA水解酶基因工程菌的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用大肠杆菌生产表达氧化型PVA水解酶(OPH)的方法，其特征在于，化学合成氧化型PVA水解酶的基因序列(oph)，构建重组质粒pET-20b(+)-oph，该基因工程菌为将重组质粒转化入重组大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到分泌表达氧化型PVA水解酶的基因工程菌JM109-oph，发酵培养3-4天。

所述氧化型PVA水解酶的基因(oph)序来源于Sphingopyxis.sp.113P中含oph基因的操纵子(GenBank No.AB190288)，替换掉oph基因中的一个EcoRI限制性内切酶位点，将EcoR I限制性内切酶和Nco I限制性酶切位点分别加在含有氧化型PVA水解酶基因的DNA序列(oph)的5′端及3′端，修饰后的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

SEQ ID NO：1

CCATGGATGTTCAAACCAGTTGTCAAGTCCCGTTCCTCTCGTTCTTTTTGTTACCT

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所述重组质粒pET-20b(+)-oph的构建方法：

将含有修饰后的oph基因的载体和要连接的表达载体进行进行EcoR I和Nco I酶切，连接得到含有氧化型PVA水解酶基因的重组质粒，为了使氧化型PVA水解酶合成基因能在大肠杆菌中高效表达，选用带有T7启动子的大肠杆菌表达载体，所述表达载体优选pET-20b(+)。

所述大肠杆菌JM109-oph的构建方法：

采用CaCl₂法制备感受态细胞，将重组质粒转化入大肠杆菌JM109宿主中，构建成表达氧化型PVA水解酶的大肠杆菌JM109-oph；

本发明采用的含氧化型PVA水解酶合成基因的重组表达质粒pET-20b(+)-oph可以转化大肠杆菌，成为能分泌表达外源氧化型PVA水解酶的功能菌，在外源诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下，T7启动子启动氧化型PVA水解酶合成基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物分泌至胞外；

大肠杆菌的转化常采用CaCl₂转化法，将100μL受体菌和5μL线性化重组表达质粒DNA混匀，37℃培养1.5h，然后筛选重组子。

所述重组子的筛选方法：

重组表达质粒pET-20b(+)-oph上含有氨苄青霉素抗性基因，如果重组质粒在宿主菌里得到成功表达，重组菌株应具有氨苄青霉素抗性，可在一定浓度氨苄青霉素中生长；涂布含10μg/mL的氨苄青霉素平板，挑取阳性转化子，得到重组大肠杆菌，重组菌Escherichia coli(oph)，即为产氧化型PVA水解酶大肠杆菌JM109-oph。

所述大肠杆菌JM109-oph生产氧化型PVA水解酶(OPH)的工艺为：

甘油管：甘油浓度为20％；种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，麦芽浸出物0.05g/L pH 7.0，100μg/mL氨苄青霉素；发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，甘露糖5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾3g/L，麦芽浸出物0.05g/L，pH 7.0，100μg/mL氨苄青霉素；

种子培养：从甘油管中按1％的接种量接入250mL三角瓶，装液量50mL，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h；发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG后迅速转至不同温度的摇床，继续诱导3-4天。

氧化型PVA水解酶酶活测定方法：

在30℃条件下，反应液体系中有100μl 50mM磷酸钾缓冲液(KPB)(pH7.5)，800μl氧化型PVA的溶液和100μl酶液。分别在反应开始与反应30min中后，取100μl反应液，加入100μl 1mol/L碳酸钠缓冲溶液(pH10)和800μl水，混合均匀后在300nm处测吸光值。

酶活定义：在1mL反应体系里，A₃₀₀每分钟降低1个单位所需要的酶量。

有益效果：

本发明通过分子生物学的手段，构建了一株具有氧化型PVA水解酶活性的大肠杆菌基因工程菌，应用该菌种生产氧化型PVA水解酶，具有生产工艺简单、产品产量高等诸多优点，解决了国内外市场氧化型PVA水解酶产品的空白；并且该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，没有形成包涵体。本发明为氧化型PVA水解酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，也PVA的生物法降解提供了新思路。

具体实施方式：

实施例1：氧化型PVA水解酶基因的合成

氧化型PVA水解酶的基因(oph)序来源于Sphingopyxis.sp.113P中含oph基因的操纵子(GenBank No.AB190288)，替换掉oph基因中的一个EcoR I限制性内切酶位点，将EcoR I限制性内切酶和Nco I限制性酶切位点分别加在含有氧化型PVA水解酶基因的DNA序列(oph)的5′端及3′端，修饰后的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

SEQ ID NO：1

CCATGGATGTTCAAACCAGTTGTCAAGTCCCGTTCCTCTCGTTCTTTTTGTTACCT

GGCAGGTTGTCTGGCTATGGTCGCTGCTACTCTGTCCTCTACTGCACAGGCTAAAT

CCGAGTGGGCATGTCCTGAAGGTTTCACTCCAAAGGCTGGCCTGAACACTGACTT

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实施例2：含氧化型PVA水解酶基因表达载体的构建

分别对含有oph基因和表达载体pET-20b(+)进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切体系如下：质粒15μL，10×buffer 2μL，Nco I 1μL，EcoR I 2μL。将上述组分轻轻混匀，于37℃酶切2h后，只需将克隆载体进行琼脂糖凝胶电泳并观察所需条带，然后对目的基因进行胶回收。

将酶切后的表达载体和目的基因oph进行连接，连接反应体系(10μL)：目的基因oph2μL，载体DNA 2μL，10×T4连接酶Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O 4μL。于16℃水浴过夜。(所用酶切试剂盒和DNA连接试剂盒购自宝生物工程有限公司)

实施例3：氧化型PVA水解酶基因工程菌的构建

连接产物转化感受态大肠杆菌JM109。转化方法如下：

(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；

(2)每管加入1-2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；

(3)42℃热休克90s(准确)，不要摇动离心管；

(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；

(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；

(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含Amp的琼脂平板，37℃平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，挑选阳性菌落。

实施例4：重组菌株的筛选

1、酶切验证

于涂布氨苄青霉素平板上挑选6个单菌落分别接入含10mL LB液体培养基中，并加入10μL Amp，摇瓶培养过夜，分别编号为1、2、3、4、5、6，提取转化子质粒。用Nco I单酶切重组质粒(10μL体系)：转化子质粒5ml，Nco I 1μL，Buffer 1μL，ddH₂O 3μL。37℃水浴5h，凝胶电泳筛选。

2、基因的诱导表达

以筛选出来的重组阳性转化子大肠杆菌E.coli JM109(pET22b(+))为对照，接种重组大肠杆菌E.coli JM109(pET22b(+)-oph)单菌落于LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，37℃培养24h，取500μL菌液接种于50mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃培养至对数后期，1mmol/L IPTG诱导培养4h，8000r/min离心10min，上清液即为粗酶可测定胞外酶。

实施例5：重组菌株的培养

甘油管：甘油浓度为20％；种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，麦芽浸出物0.05g/L pH 7.0，100μg/mL氨苄青霉素；发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，甘露糖5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾3g/L，麦芽浸出物0.05g/L，pH 7.0，100μg/mL氨苄青霉素；

种子培养：从甘油管中按1％的接种量接入250mL三角瓶，装液量50mL，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h；发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG后迅速转至不同温度的摇床，继续诱导3-4天，发酵结束酶活力达到20U/mL。

氧化型PVA水解酶酶活测定方法：

在30℃条件下，反应液体系中有100μl 50mM磷酸钾缓冲液(KPB)(pH7.5)，800μl氧化型PVA的溶液和100μl酶液。分别在反应开始与反应30min中后，取100μl反应液，加入100μl 1mol/L碳酸钠缓冲溶液(pH10)和800μl水，混合均匀后在300nm处测吸光值。酶活定义：在1mL反应体系里，A₃₀₀每分钟降低1个单位所需要的酶量。

核苷酸序列表

<110>江南大学

<120>一种采用重组大肠杆菌生产氧化型PVA水解酶的方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1107

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccatggatgt  tcaaaccagt  tgtcaagtcc  cgttcctctc  gttctttttg  ttacctggca    60

ggttgtctgg  ctatggtcgc  tgctactctg  tcctctactg  cacaggctaa  atccgagtgg    120

gcatgtcctg  aaggtttcac  tccaaaggct  ggcctgaaca  ctgactttcc  atccgacggc    180

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gtccctatgg  ttggtaccgt  tgaggctact  aattggaacc  tgaatgtgcc  tcgttctggt    300

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ccaatggttg  tcattacggt  gtggggcggt  gaaaaagatc  tgtgggattg  tggtccacct    840

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