C基因型恩替卡韦耐药突变HBV稳定复制表达细胞系

摘要

本发明构建了一种乙型肝炎病毒稳定复制表达细胞系，病毒来源于中国流行的C基因型HBV株，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷类似物恩替卡韦耐药突变位点。本发明通过筛选方法使病毒基因组整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞染色体上，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。本细胞系抗原分泌稳定，病毒复制活跃，技术参数稳定，可为抗HBV药物的评价及新药研发提供稳定可靠的细胞模型，为临床治疗提供指导依据。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)稳定复制表达细胞系，特别是所含病毒来源于我国C基因型HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷类似物恩替卡韦(ETV)耐药突变位点的病毒稳定复制表达细胞系。

背景技术：

建立某种病毒的稳定复制细胞模型，产生具有完整的病毒生命周期并能长期持续分泌病毒颗粒，是进行体外抗病毒药物筛选以及研究抗病毒机制的必需工具。特别是在需要标准化的实验，如对抗病毒药物敏感性实验中，稳定复制病毒表达细胞系的建立及应用尤其重要。

由于乙型肝炎病毒(HBV)基因组不同的读码框架及调控序列之间相互重叠，需要携带大于一个完整3.2kb基因组序列的载体才能在转染的细胞系里建立稳定的HBV复制状态，保证3.5kb前基因组RNA的有效转录。已有的研究证实从1.05拷贝至4.0拷贝质粒均可产生稳定复制细胞系。国内外学者经过不同的尝试，建立了数株HBV复制细胞系，如目前公认并广泛应用的整合了D基因型/ayw亚型野生HBV株的HepG2.2.15细胞【Sells MA，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84：1005-1009】，可被四环素调控表达的HepAD38细胞【Ladner SK，et al.Antimicrob.Agents Chemother，1997，41：1715-1720】以及Huh7.93细胞、HepG2.117细胞等【Sun DX，et al.J Hepatol，2006，45：636-645】。

已知HBV至少分为A-H等8个不同的基因型和若干基因亚型，不同基因型的HBV复制表达细胞系具有不同的病毒学特点，对疾病进展、临床转归，特别是抗HBV药物的敏感度有较大影响。而上述建立的HBV复制细胞株所整合的HBV DNA是A基因型和D基因型HBV株，而中国流行的HBV株主要为C基因型及B基因型，尤其是北方地区84％的HBV感染患者为C基因型【Li X，et al.J Clin Microbiol，2010，48，doi：10.1128/JCM.01518-10.】。因此，已有的成熟细胞株并不适用于针对我国流行HBV的抗病毒药物的研究。

此外，随着抗HBV药物核苷和核苷酸类似物种类增加及在临床长期广泛应用，HBV耐药变异株逐渐出现并成为临床抗病毒治疗失败或疗效不佳的主要原因。为满足耐药突变株的病毒学特性研究以及一些新研发的抗病毒药物的药效评价，耐药突变HBV稳定复制细胞株也相继在一些实验室建立。如Ladner等在1998年率先建立了拉米夫定耐药突变(rtM204V/I)稳定复制细胞株【Ladner SK，et al.Antimicrob Agents Chemother，1998，42：2128-2131】，Delaney等利用定点突变方法先后建立了拉米夫定耐药突变(rtL180M±rtM204V/I)，阿德福韦酯耐药突变(rtA181V/T±rtN236T)细胞株【Delaney WE，et al.Antimicrob Agents Chemother，2001，45：1705-1713】，Seifer等也人为突变野生D基因型病毒，产生8株不同含拉米夫定耐药突变(rtL180M+rtM204V/I)、阿德福韦酯耐药突变(rtN236T+rtA181V)、替诺福韦酯耐药突变(rtA194T)及替比夫定耐药突变(rtL80I/rtM204I)稳定复制细胞株【Seifer M，et al.Antiviral Research，2009，81：147-155】，分析评价药物的抗HBV活性。

但是，以上这些耐药突变株都是通过定点突变技术人为产生的，得到的仅为非自然存在的突变株，如果细胞模型的病毒来源并非从患者血清直接分离得到的，这种非自然存在的突变可能影响到整个病毒的表型。通常情况下，HBV在产生耐药变异的同时会产生补偿性突变来恢复自身的复制能力，人为突变会修改病毒的某些自然遗传特征，不能完全反映耐药株的表型特征。

恩替卡韦(Entecavir，简称ETV)是目前抗HBV效力最强、耐药率最低的核苷类似物，对以前未使用过核苷类或核苷酸类药物的初治患者6年累积耐药发生率仅为1.2％，但随着应用时间的延长和治疗个体的不断扩大，尤其是针对拉米夫定治疗失败的患者，ETV挽救治疗后耐药率显著增加(6年累积耐药率达59％)，这与耐药种群的产生密切相关。在LAM耐药(rtL180M+rtM204V/I)基础上出现rtT184/rtS202/rtM250任意一个位点的氨基酸替换突变即为ETV耐药。研究发现，在中国慢性HBV感染患者中ETV基因型耐药突变形式以rtL180M+rtT184L+rtM204V最多见【刘妍，等.解放军医学杂志，2010，35：621-624】。

如果能够直接从长期用ETV治疗的中国乙肝患者血清分离克隆含有ETV耐药突变位点的HBV全长基因组序列，建立中国流行的C基因型稳定复制细胞模型，对于抗C基因型耐药HBV的防治和新药药效评价具有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的是从来源于中国流行的C基因型HBV株中构建一种HBV稳定复制表达细胞系，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有ETV耐药突变位点。该ETV耐药细胞系能用于各种核苷和核苷酸类似物的耐药表型分析，可为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。

本发明进行了如下工作：

1、从中国慢性乙肝患者血清中分离C基因型HBV全长基因组，挑选存在典型ETV耐药突变位点克隆序列，构建含1.1倍长HBV基因组的真核细胞表达质粒。

2、建立了能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗粒的肝癌细胞系。所建的细胞系具有SEQ ID NO：5所示的DNA序列。

3、通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组化方法检测病毒抗原表达，通过对细胞质内HBV复制中间体中核心颗粒DNA、细胞核内共价闭合环状cccDNA、培养上清中分泌的病毒DNA载量进行实时荧光定量PCR测定，以透射电镜观察浓缩的培养上清中HBV颗粒，评估稳定细胞克隆的复制表达情况。

4、以四种核苷和核苷酸类抗病毒药物用于体外表型分析，证实该细胞系的耐药表型特征。将拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF)分别作用于该细胞系，计算并比较其核心颗粒DNA的荧光定量PCR及Southern杂交的结果。结果证明对ETV和LAM高度耐药，对ADV和TDF敏感(见实施例4)。

本发明的有益效果是：

本发明建立了自主复制HBV的肝癌细胞系，能够持续复制并产生特异性抗原和分泌型病毒颗粒，病毒来源于中国流行的C基因病毒株，含有典型的ETV耐药突变位点，为研究中国流行HBV的生物特性和药物筛选提供实用工具。

附图说明：

图1是重组载体pTriEx-1.1-HBV结构示意图；

图2是HepG2.A64细胞各代HBsAg和HBeAg抗原表达情况；

图3是HepG2.A64细胞、HepG2.2.15细胞和HepG2细胞内HBsAg和HBcAg免疫组化染色结果；

图4是HepG2.A64细胞分泌上清中HBV全长PCR电泳图；

图5是Southern Blot检测HepG2.A64细胞内不同形式病毒复制DNA结果；

图6是浓缩HepG2.A64细胞培养上清病毒颗粒电镜结果，图中：A：42nm Dane颗粒B：20nm小球状表面抗原颗粒(×200,000；bar＝50nm)；

图7是HepG2.A64细胞4种药物定量PCR表型分析结果，图中：A：LAM B：ETV C：ADVD：TDF；

图8是HepG2.A64细胞4种药物作用的Dot Blot结果；

图9是HepG2.A64细胞TDF作用的Southern Blot结果。

具体实施方式

实施例中所使用的试剂和材料来源如下：

Taq DNA聚合酶及限制性内切酶均购自TaKaRa公司；

JM109感受态细胞购自Promega公司；

DNA凝胶回收试剂及转染级质粒提取试剂盒均购自Qiagen公司；

DMEM、无血清培养基购自Gibco公司；

转染试剂FuGENE HD及地高辛标记dUTP等Southern杂交试剂均购自Roche公司；

荧光定量PCR试剂SYBR green I PCR kit购自杭州博日公司；

HBsAg和HBeAg定性检测ELISA试剂盒购自北京科卫公司。

HBsAg定量检测由302医院临检中心完成。

其他生化试剂购自Sigma公司。免疫组化抗体和显色试剂为中杉公司产品。

引物由上海生工公司合成，克隆测序由北京天一辉远生物科技公司完成。

人肝癌细胞系HepG2细胞及表达neo基因抗性的质粒pSV2-neo由解放军302医院病毒性肝炎研究室保存；

支持病毒复制的载体pTriEx-mod由法国里昂大学Fabien Zoulim教授馈赠。

血清S1145取自2007年12月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者，男，35岁，排除其他因素所致肝功能损害。分离扩增全长HBV基因组并克隆于pGEM-Teasy载体中，进行全基因组测序，确定为C基因型。逆转录酶区核苷(酸)类似物耐药相关的氨基酸突变：rtL180M，rtT184L，rtM204V。

实施例1  1.1倍长HBV表达载体构建

(1)全长环状HBV模板的制备  将克隆于pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组(S1145)用BspQI/ScaI双酶切，纯化回收3.2kb片段，取10μL酶切产物用T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物备用。

(2)双HBV片段扩增  参照S1145测序结果，根据文献【蒋林彬，等.解放军医学杂志，2010，35：635-638】设计合成两对用于扩增HBV的引物(表1)。取5μl环化的HBV DNA产物作为PCR模板，以A/B引物对扩增得到2735bp HBV部分基因组片段，以C/D引物对扩增得到643bp HBV部分基因组片段，分别将AB和CD片段克隆于pGEM-Teasy载体中。

表1  用于PCR扩增的引物序列及位置

(3)重组载体构建及鉴定pTriEx-mod载体含异源 (鸡肌动蛋白)启动子，能在体外高效启动HBV基因表达。以NotI/XhoI酶切pTriEx-mod载体，以NotI/NcoI及NcoI/SalI分别消化AB和CD两个片段，回收纯化AB、CD及载体大片段，同一体系中以T4 DNA连接酶连接，构建出包含1.1倍HBV基因组长度重组载体pTriEx-1.1-HBV。1.1倍长HBV重组片段始于前C蛋白N端止于polyA尾，含有DR1、DR2、polyA等病毒转录复制所需的元件(图1)。在HBV序列内部合成5条引物进行全长测序鉴定，结果与原序列完全一致，逆转录酶区含有ETV典型耐药突变位点L180M、T184L、M204V。

实施例2  稳定细胞系筛选

(1)质粒DNA转染和细胞克隆筛选  提取转染级重组质粒pTriEx-1.1-HBV，紫外分光光度计定量浓度。在37℃、含有5％CO2、10％FBS的DMEM完全培养基中培养HepG2细胞。转染前将细胞接种到24孔板培养过夜，细胞融合达到80％时更换无血清和抗生素的DMEM，用FuGENE HD脂质体导入DNA，具体方法按操作手册进行。转染后6h补入FBS至10％。设置未转染孔为阴性对照。48h细胞培养皿内加入G418(终浓度600μg/ml)筛选，每隔2d换液，待对照组细胞完全死亡后换为维持浓度G418(300μg/ml)继续筛选，2～3周时形成细胞克隆。挑取细胞克隆至96孔板，以维持浓度的G418继续培养至大面积融合，定量检测上清分泌的抗原蛋白和HBV DNA，保留高表达株扩大培养。

(2)亚克隆  将其中一株高表达细胞克隆进行有限稀释，具体方法：制备细胞悬液5×10³个细胞/ml，倍比稀释50倍并调整悬液浓度为10个细胞/ml，接种于96孔板中，100μl/孔，每孔再补充100μl适应性培养基。细胞培养约1周左右，孔中形成较大克隆达到50％孔底面积时，转入48孔板并加入600μg/ml G418筛选。持续检测HBV抗原和HBV DNA，保留稳定高表达复制细胞一株命名为HepG2.A64，扩大培养，每3天传一代，稳定传代50代以上(＞6个月)，批量冻存。

实施例3  对本发明所构建细胞系的检测：

1、HBV主要抗原表达

(1)ELISA检测  收集HepG2.A64细胞株第5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60代细胞培养上清液，ELISA(双抗体夹心法)检测HBsAg、HBeAg的表达，波长设为450nm。随细胞传代代数增加，抗原表达量逐渐增加并趋于稳定，平均OD值HBsAg：0.67±0.42，HBeAg：2.03±0.61(图2)。

(2)免疫组化  多聚赖氨酸处理的玻片置于6孔板内，加入HepG2.A64细胞5×10⁵/孔，各2孔使细胞爬片72h，细胞固定后采用二步法进行免疫组化染色，一抗为兔抗HBs/抗HBc，1∶100稀释使用；PV-9000替代传统二抗分子直接放大结合信号，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多聚体；AEC液显色。结果显示细胞浆内有红染的阳性信号，HBsAg为浆型分布，HBcAg以核型分布为主，结果类似于HepG2.2.15细胞，阴性对照HepG2细胞未见染色(图3)。

2、稳定传代50代后HBV DNA检测

(1)上清全长HBV基因组扩增  提取培养细胞分泌上清中的病毒DNA，根据Gunther的方法以引物PF(CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA)和PR(CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG)扩增全长基因组【Gunther S，et al.J Virol，1995，69：5437-5444】，3.2Kb处可见单一扩增条带，PCR产物全长测序结果与原病毒序列完全一致，提示细胞产生了分泌性的完整病毒(图4)。

(2)上清及细胞内HBV DNA定量检测  细胞传代3d后，先后经NP-40裂解，DNase/RNase和蛋白酶K消化后，用酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇漂洗后，分别提取细胞裂解液中的HBV核心颗粒DNA(HBV复制中间体)和分泌上清中的HBV DNA。采用SYBR Green I嵌合荧光法进行绝对定量PCR反应，根据已设定的标准曲线计算样本DNA量。分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA分别为1.12×10⁵和3.48×10⁷拷贝/ml。而相应的HepG2.2.15细胞分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA分别为3.42×10⁵和4.23×10⁷拷贝/ml。可见，新建立的HepG2.A64细胞株能够稳定支持HBV抗原分泌和DNA复制，与2215细胞相当。

(3)Southern印记检测  取25μL HBV核心颗粒溶液用Southern杂交检测病毒复制中间体。1％琼脂糖凝胶，50V电压电泳3～4h，0.3A的电流转膜20min，80℃固定2h。DIG EasyHyb 42℃预杂交30min，用含变性随机引物探针的DIG Easy Hyb 42℃杂交过夜。化学发光法显色，压片拍照。结果显示病毒复制中间体的rcDNA、dsDNA和ssDNA三条清晰显影带，提示细胞中有完整病毒复制(图5)。

(4)细胞内cccDNA检测：以本课题组前期建立的滚环扩增法检测肝细胞内HBV共价闭合环状cccDNA【任晓强，等.解放军医学杂志，2009，34：675-678】。Qiagen试剂盒提取约5×10⁵个细胞的全部DNA，以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后进行滚环扩增反应，再以其为模板用跨缺口引物和Taqman探针介导进行实时荧光定量PCR反应，用β-actin作为内参校正实际细胞数，量化结果显示，HepG2.A64细胞株每个细胞内平均含有22个拷贝cccDNA分子。

3、电镜检测病毒颗粒

大量培养HepG2.A64细胞，取20ml病毒分泌上清3000rpm离心30min，0.22μm滤膜过滤。另外将HBV表面抗体阳性健康献血员血清4ml，1∶5PBS稀释，0.22μm滤膜过滤。病毒上清液与健康抗血清1∶1混匀，4℃过夜，12000rpm 4℃离心30min，弃上清，沉淀物用100μl细胞培养液重悬，滴于有支持膜的铜网上，2％的磷钨酸负染，透射电镜下观察可见到42nm左右大颗粒和20nm左右小球型颗粒(图6)。结果提示：新建立的HepG2.A64细胞株能够分泌完整HBV颗粒。

实施例4  细胞株用于4种抗病毒药物的体外表型分析

获得的稳定细胞株HepG2.A64用目前常见核苷(酸)类似物：拉米夫定(LAM)、恩替卡韦(ETV)、阿德福韦酯(ADV)及替诺福韦酯(TDV)四种药物进行药物敏感性实验，评价该细胞株实际应用效果。

细胞以7×10⁴/ml密度接种在24孔板中，12h后更换为含5％FBS的DMEM培养基，加入上述四种药物，浓度分别设定为LAM：0、0.01、0.1、1、10、100μM；ETV：0、0.0032、0.016、0.08、0.4、2μM；ADV：0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μM；TDF：0、0.02、0.2、2、20、200μM，连续更新5天含相同浓度药物的培养基。随后提取细胞核心颗粒，用于DNA的荧光定量PCR检测和Dot blot实验，计算每种药物处理的50％病毒抑制率(IC50)。

结果一  不同药物处理HepG2.A64细胞的荧光定量PCR分析：LAM、ETV、ADV及TDF的IC50分别为130μM、0.94μM、0.53μM、0.053μM，分别是文献报道野生型病毒IC50的325倍、313倍、1.8倍和2.8倍，说明该细胞株对ETV具有高水平的耐药性，同时存在LAM交叉耐药，而对ADV和TDF仍然敏感(图7)。

结果二  不同药物作用HepG2.A64细胞的Dot blot及southern blot分析：细胞对4类药物的反应趋势与定量PCR结果一致，随着药物浓度增加LAM和ETV处理组病毒DNA没有明显下降，而ADV和TDF处理组HBV随加药剂量增加而降低(图8)。Southern杂交也可看出细胞株对TDF敏感，细胞内以rcDNA降低为主(图9)。

总之，本发明所述HBV稳定复制细胞系为中国流行C基因型病毒株，含有恩替卡韦典型耐药突变，对目前常用核苷和核苷酸类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性，能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌。本发明细胞系在中国HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有很好的应用前景。