从钩藤中提取钩藤碱单体的提取工艺

摘要

本发明涉及从钩藤中分离提取纯化钩藤碱单体的工艺，所述工艺包括低级醇水冷浸超声法对钩藤药材的预处理、制备粗提物；以两种有机试剂与氨水一定比例为洗脱液，硅胶柱层析法分离粗提物中钩藤碱；洗脱馏分经萃取和纯化等步骤最终获得钩藤碱单体。本发明安全、高效、低成本，钩藤碱单体产率高，每公斤药材可获得0.27g钩藤碱单体，且纯度高于90％，有利于工业化大规模生产，为钩藤碱作为新药进一步开发提供了途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物的提取工艺，特别涉及一种从钩藤中提取钩藤碱单体的提取工艺。

背景技术

钩藤[Uncariar rhynchophylla(Miq)Jacks]是我国传统中药，属茜草科植物，种类繁多，包括钩藤[Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks]、大叶钩藤[Uncaria macrophylla Wall]、毛钩藤[Uncaria hirsuta Havil]、华钩藤[Uncaria sinensis(Oliv.)Havil]或无柄果钩藤[Uncaria sessilifructus Roxb]等15种，其带钩茎枝入药，性凉味苦甘，具有清热平肝、息风定惊的功效。现代研究表明钩藤具有显著的降压、抗心律失常、镇静和治疗老年痴呆症等功效，且安全性较高。

钩藤有效成分为吲哚类生物碱，主要有钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和柯诺辛碱B等，其中钩藤碱含量较高，为主要药效成份，其分子式为C₂₂H₂₈N₂O₄，分子量为384.47。现代中药药理研究表明，钩藤碱主要作用于心血管系统和中枢神经系统，包括降压、心动过缓和保护脑缺血、镇静等作用。焦虑等精神表现除了明显的神经递质的改变外，还表现为大脑神经元和胶质细胞的减少、衰老以及脑源性神经营养因子等异常，即是大脑的可塑性发生改变，这也是焦虑等精神异常常使脑功能受损继发表现的原因。钩藤碱对NMDA型离子型谷氨酸受体具有非竞争性拮抗作用，对局部缺血导致的大鼠神经元损伤的保护作用是通过阻断局部缺血过程中NMDA、毒覃碱M₁和5HT₂受体介导的神经毒性实现的。钩藤碱对多种神经细胞死亡有保护功能。我们以往的研究也证实钩藤碱对中枢神经系统功能具有抑制作用，降低苯丙胺依赖大鼠脑内兴奋性氨基酸含量和增加抑制性氨基酸含量，恢复神经核团杏仁核和伏核中NMDA受体2B蛋白和mRNA表达的异常，且钩藤碱本身无药物依赖性。钩藤碱还影响不同脑区中5HT、多巴胺和去甲肾上腺素的释放。钩藤碱可减少小鼠自发性运动和增强戊巴比妥钠的镇静催眠作用，这可能与其调节大鼠纹状体和海马内单胺类神经递质及代谢物的含量有关。这些研究提示钩藤碱可用于多种中枢神经系统疾病的治疗。

目前提取钩藤初步提取物的方法主要有水煮法、醇水渗漉法等，钩藤总生物碱的有柱层析法分离钩藤总碱等，这些方法步骤繁杂，提取率较低。钩藤碱单体的提取纯化主要有微生物发酵、碱化苯提取以及制备色谱法等方法，这些方法操作繁琐，成本高，而且难以重复。

发明内容

本发明目的是提供一种从钩藤中提取钩藤碱单体的提取工艺，所述工艺安全、高效、成本低，钩藤碱单体产率高，有利于工业化大规模生产，为钩藤碱作为新药进一步开发提供了途径。

本发明所述从钩藤中提取钩藤碱单体的提取工艺，有以下步骤：

(1)取40目钩藤粉，按照每重量份钩藤粉加入5～10体积份的低级醇水溶液配置成钩藤液，于4℃下保存8～16h，得到钩藤冷浸液；

(2)将步骤(1)所述的钩藤冷浸液于室温超声30～60min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液(层析柱规格：5×100cm)，其洗脱液为丙酮石油醚氨水，洗脱速度为每小时200～250mL，收集馏分段，收集时间为14～16h；

(4)将步骤(3)所得馏分用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为8～9，离心收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水反复洗涤脱色3次，-80℃冻干，即得纯度＞90％的钩藤碱单体。

上述制备工艺中所述重量份为克、千克等，对应的体积份为毫升、升等，即步骤(1)中若重量份用克，则体积份则对应为毫升；若重量份用千克，则体积份则对应为升。

步骤(1)中所述低级醇水溶液为甲醇或乙醇或丙醇的水溶液。

步骤(1)中所述的低级醇与蒸馏水的混合比例为5～9∶10。

步骤(3)中所述的洗脱液中丙酮∶石油醚∶氨水的体积比为1∶2∶0.2。

步骤(3)中所述柱层析法为硅胶柱层析法。

步骤(4)中所述盐酸的浓度为0.5％～16％。

与现有工艺方法相比，本发明具有以下优点：

1.以钩藤碱含量为指标，对不同产地钩藤药材进行了筛选，确定了钩藤碱含量最高的药材，解决了由药材原因造成的钩藤碱产率低的问题，使钩藤碱单体的产率最大化；

2.药材预处理及粗提物制备方法简便，易于操作，应用乙醇水溶液作为冷浸液，无毒环保，得到粗提物钩藤碱含量显著高于现有报道工艺；

3.粗提物的分离采用硅胶柱层析法，方法重复性好，且易于放大，有利于工业化大生产；

4.萃取、纯化步骤简单，得到钩藤碱单体纯度较高，最终产率0.27g/kg药材。

本发明方法过程环保，易于操作，成本较低，钩藤碱单体产率显著高于现有的提取工艺，可以实现工业化大生产，为钩藤碱的药理药效作用的进一步研究奠定了基础。

本发明对钩藤碱定性定量方法建立及提取条件的优化过程加以如下描述：

1.钩藤碱定性定量方法建立

薄层色谱法定性：硅胶板(青岛海洋化工厂分厂)：厚度0.2～0.25mm，规格：25×40mm；

展开剂：丙酮∶石油醚∶氨水＝1∶2∶0.2；

显色剂：改良的碘化铋钾：取2g碘化铋钾，加冰乙酸2mL，用水定容至50mL。再取上述溶液1mL，加入0.6mol/L的盐酸2mL，加水至10mL，即得；

点样量为10μL，展开时间为5min，展开吹干后，以显色剂均匀喷在板上，可显示钩藤碱及其它生物碱橙色斑点。该法快速，准确，钩藤碱与其同分异构生物碱(异钩藤碱、柯诺辛碱等)分离度高，可以作为钩藤碱的定性方法。

高效液相色谱法定量：采用Waters色谱分析系统，色谱条件为Platisil ODS(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相及梯度：乙腈：0.01mol/L磷酸二氢钾(KOH调pH8.0)0～40min内比例由30∶70递增至60∶40，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长：245nm，进样量：20μL，此色谱条件下，钩藤碱出峰时间为31.5min左右，能够与其同分异构生物碱及其它杂质完全分离(参见图1)；

以甲醇溶解纯度98％钩藤碱(购自南昌贝塔生物技术有限公司)，配制浓度0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0μg/mL标准工作液，进样分析，绘制标准曲线，结果回归方程为y＝5.22×10⁴x+4.96×10³(r＝0.9999)，线性良好；分析方法通过加标回收试验、重复性试验、稳定性试验验证，结果相对回收率为95.95％～114.40％，重复性试验RSD为6.50％(n＝9)，稳定性试验钩藤碱高、中、低浓度溶液室温5d内RSD为4.62％、2.65％和4.58％。试验结果表明，本方法准确可靠，重复性好，可做作为钩藤碱的定量方法。

2.钩藤药材提取条件优化

采用湖南产钩藤，考察了现有文献报道的多种钩藤药材初步提取方法，如水煮法、乙醇回流、乙醇渗漉，结果钩藤碱提取率较低，无法重复报道结果；乙醚回流法得到了一定量的钩藤碱，但样品杂质较多，操作步骤复杂，且经考察发现钩藤碱在乙醚中易转化为其同分异构体柯诺辛碱B，导致了提取率降低；而甲醇冷浸超声法虽然提取率较高，但涉及有毒试剂甲醇，不易于工业化大生产。采用本发明所述工艺，具有更加环保，提取率高于甲醇冷浸法的优点。通过进一步考察影响钩藤碱提取率因素，确定了药材质量与冷浸液体积比(物料比)、乙醇百分比、超声时间这三个主要影响因素，通过3因素3水平正交试验，确定了物料比1∶5，80％乙醇，超声时间30min为最佳提取条件，此条件下获得钩藤粗提物中钩藤碱提取率为0.48g/kg药材。

表1不同提取方法钩藤粗提物中钩藤碱提取率

附图说明

图1a为HPLC测定钩藤药材色谱图，图1b为HPLC测定钩藤碱标准品色谱图；

图2为粗提物色谱图；

图3为柱层析钩藤碱段馏分色谱图；

图4为纯化后钩藤碱单体色谱图；

图5为单体样品质谱检测图；

图6为单体样品核磁检测结果。

具体实施方式

实施例1钩藤药材粗提物制备

取干燥钩藤带钩茎枝(湖南产双钩藤)，以粉碎机粉碎后过40目筛，称取1kg于大烧杯内，加入80％乙醇水溶液5L，混匀后以保鲜膜封口，保存于4℃冰箱内；12小时后将药材冷浸液取出，于室温、频率50kHz条件下超声30min，期间每隔10min振摇一次，保证溶液与药粉充分作用；超声结束后静置10min，先以纱布将药材残渣滤去，收集滤液后再经滤纸抽滤得到初步提取液，颜色为浅褐色；将初步提取液分3次于旋转蒸发器内减压蒸干，每次控制温度35℃左右，真空度0.08Mpa，回收乙醇，之后调节温度为50℃，真空度不变，将残余水溶液蒸发至体积约20mL时，取下蒸发烧瓶，于超声机内超声5min，期间不断震荡，使粘附在瓶壁的固体充分洗脱，之后将残液转移至小烧杯内，置于真空干燥箱内，控制在温度80℃、真空度0.08Mpa条件下干燥；6小时后，取出已成浸膏状样品，称重，得到60g钩藤粗提物，准确称取0.322g该粗提物，以甲醇充分超声溶解后定容于100mL容量瓶，经HPLC检测，钩藤碱含量为26.04μg/mL(参见图2)，则粗提物中钩藤碱含量为26.04×100×10^-3/0.322＝8.087mg/g。

实施例2钩藤粗提物经柱层析分离钩藤碱

柱层析洗脱液为丙酮∶石油醚∶氨水(1∶2∶0.2)，常压层析柱(层析柱规格：5×100cm)安装后加入洗脱液少量，于底部填充少量粗硅胶(80～100目)，约3cm高，始终保持液面在硅胶层之上，自然沉降15min，以蠕动泵随时补加洗脱液；称量柱层析用细硅胶(200～300目)600g，加入1500mL洗脱液，充分搅匀后一次性倾入柱内，自然沉降6小时，下端流速约为500mL/h，流出洗脱液反复利用，沉降之后硅胶层约70cm高，于细硅胶层之上铺一层粗硅胶作为上样层，约2cm高，继续沉降30min；称取钩藤粗提物浸膏10g，加入丙酮100mL充分超声溶解，重复3次，合并上层清液，于通风橱内水浴40℃挥干至体积约为10mL；硅胶上层液面高为1cm左右时，上下端同时断流，用胶头滴管沿柱壁缓慢加入浓缩后样品液，均匀上样，饱和10min后开始收集馏分，控制下端流速为200～250mL/h；以薄层色谱法检测馏分中成分，14～16h内含钩藤碱，收集此段馏分，体积约为700ml，HPLC测定该馏分，钩藤碱浓度为85.62μg/mL，杂质较少(参见图3)，即10g粗提物中分离出钩藤碱共约60mg。

实施例3钩藤碱单体纯化制备

将柱层析分离出钩藤碱馏分500mL移入1L分液漏斗中，加入2％HCl 4mL，剧烈震荡3min，静置15min，收集下层酸液，再次加入2％HCl 4mL，重复萃取3次，合并酸液，移入100mL分液漏斗中；向酸液中加入2mL氯仿，充分振荡3min，萃取酸液中杂质及有机相，静置30min后除去下层有机相，再次加入2mL氯仿，重复萃取3次；向萃取后酸液中滴加氨水，调节pH8～9，可见浅黄色沉淀析出，3000r/min离心10min，弃去上清液，向沉淀中加入超纯水2mL，混旋震荡1min，洗脱钩藤碱中少量有色杂质，3000r/min离心5min，重复操作3次，将沉淀置于真空冻干机内，-80℃、0.08Mpa条件下5h后取出，得到白色粉末状固体，称重为32.6mg，相当于0.27g/kg药材。准确称量该固体6.23mg，以甲醇溶解并定容于50mL容量瓶，经HPLC检测，最高样品峰保留时间与钩藤碱对照品一致，确定其为钩藤碱峰，浓度为113.95μg/mL(参见图4)，则制备得到钩藤碱单体纯度为113.95×50×10^-3/6.23＝91.45％。

所得单体样品通过质谱检测，测得分子量为384.23，与钩藤碱一致(参见图5)；经核磁共振检测，化学结构与钩藤碱一致(参见图6)。

结论：采用本发明所述工艺从钩藤中提取钩藤碱单体，钩藤碱单体产率高，每公斤药材可获得0.27g钩藤碱单体，所得单体为91.45％的钩藤碱单体。

采用本发明所述工艺，用其它产地的钩藤中提取钩藤碱单体，同样可以得到单体≥90％的钩藤碱单体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。