一种检测血液中游离乳腺癌细胞标志物的试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测乳腺癌标志物的试剂盒，所述试剂盒组分如下：珠处理液；带有乳腺癌抗体的磁珠；10X缓冲液4.0～5.0μl；dNTPs 4.0～5.0μl；反转录酶2.0～3.0μl；RNA酶抑制剂40u/μl 0.4～0.6μl；10X热启动PCR混合液20.0～30.0μl；ddH

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒及复合检测技术，具体地说是一种准确性高的从乳腺癌患者循环血液中检测乳腺癌细胞(恶性肿瘤细胞)的检测技术和试剂盒，特别是能够分离提取并鉴定放、化疗治疗后残存在患者血液中的游离乳腺癌细胞的检测试剂盒。

背景技术

乳腺癌作为恶性肿瘤的杀手具有明显上升的趋势。乳腺癌的高发对于人类特别是女性危害日益严重。对于乳腺癌早期的诊断和筛查及治疗效果的预后及化疗、放疗后的疗效评估和预测，对于降低乳腺癌的死亡率，提高5年存活率具有非常重大的实际意义。

恶性肿瘤细胞和肿瘤干细胞是一种维持肿瘤生长及可扩散性的恶性肿瘤细胞。尽管许多科学家认为肿瘤细胞具有永生性，即它们可以无限地分裂、生长和繁殖，但是大部分肿瘤细胞在分裂一定次数后还是死亡了。而肿瘤干细胞的假说认为，恶性肿瘤本身可能不会死亡，因其有肿瘤干细胞的不断的补给，而肿瘤干细胞是一小类特别危险的细胞，它们是一群未分化、具有自我更新、分化潜能的细胞。它们甚至在产生出更多细胞构成肿瘤主体的时候，仍能通过分裂而自我更新。更糟糕和可怕的是，肿瘤干细胞，包括乳腺癌肿瘤干细胞都具有化疗抵抗性、放疗抵抗性、缺氧抵抗性、高致瘤性、高侵袭转移性的特征，这也是成为肿瘤难以根除、日后复发的一个重要原因。肿瘤干细胞可能不受大多数现有的肿瘤治疗方案和治疗方法的影响。

众所周知的科学知识告诉大家，恶性肿瘤的患者通常是在经过确诊、手术或其它有效治疗的过程。但往往在经过放、化疗的治疗后，患者通常会发生肿瘤全身转移的状况，发生多个器官的肿瘤细胞的转移。对肿瘤患者医学上通常会用5年存活率的指标来进行评判，很形象的说明了肿瘤严重的威胁了人类生存的状况。从医学的角度来讲，肿瘤的可怕性是在于经过化学疗法和放射疗法后，虽然放化疗常常会摧毁肿瘤的大部分，可是确不能杀死全部的肿瘤细胞，当然也包括没有完全杀死肿瘤干细胞。未被杀死的肿瘤细胞和肿瘤干细胞，将会死灰复燃。由于他们是肿瘤细胞，在他们“身上”具有独特的分子标记或生物标记(biomarker)。

在目前的治疗手段中，通常考虑的是化学与物理治疗的手段为什么能够杀死绝大部分的肿瘤细胞而不能同时杀死全部的肿瘤细胞？这其中涉及到了两个方面的原因。第一、肿瘤细胞方面：由于肿瘤通常是由肿瘤组织细胞和肿瘤组织干细胞组成，在现有的治疗手段中，相对杀死肿瘤组织细胞的概率会较高，对杀死肿瘤组织干细胞的概率会较低，而肿瘤组织干细胞又有较强的分裂能力，实际上我们可以理解为没有从“根上”杀死，所以可以发生“死灰复燃”。另一方面，肿瘤组织细胞和肿瘤组织干细胞具有很强的适应与应变能力，他们将会产生一种“耐药蛋白”来防止化学与物理的手段对他们的损伤。第二、采取的化学与物理手段对肿瘤细胞没有治疗上的特异性。换句话说，就是在杀死肿瘤细胞的同时也在对体内正常的细胞进行杀伤，往往由于追求大剂量才能杀死肿瘤细胞而采用大剂量的治疗，经常会出现肿瘤患者没有死于肿瘤疾病，而是死于化、物疗对机体全身正常组织的毒性，致使机体的正常组织功能衰竭而亡。由此，也经常会出现机体的强烈的防御反应，诸如：恶心呕吐、白细胞的极度低下、甚至直接影响到呼吸和循环组织功能的衰竭等等，迫使患者不得不放弃肿瘤的放化疗的治疗，肿瘤细胞得以泛滥，最终发生肿瘤的广泛转移而影响到生存。简单的总结一下，在目前的肿瘤治疗时刻，面临主要困难和经常遇到的问题有：使用放化疗的剂量、多长时间或是否仍需要持续性的进行放化疗治疗、放化疗后是否还有未被杀死的肿瘤细胞等。就目前开展的工作来看，根据临床的工作经验，研究和检测主要的工作重点是检测血液中的肿瘤标记物(蛋白标记物)，但检测血液中的肿瘤标记物存在着微量检测准确性差、血液中存在着多种蛋白检测的特异性差、检测到后确定量效关系困难、干扰因素多等缺陷，在现有的对已发现的肿瘤标记物的检测使不能解决上述的放化疗存在的不能解决的问题，对肿瘤的治疗的疗效的判断和对正常组织细胞的损伤的判断都是无法通过检测血液中的肿瘤蛋白标记物的检测能够解决，我们现在提出的方法和提供的检测试剂盒主要是针对检测血液中的游离的肿瘤细胞，只有判断出血液中是否还有游离的肿瘤细胞，如果能够得到血液中游离的肿瘤细胞，可以说明体内尚存有未被

含有为使肿瘤的治疗和研究工作进一步的推进，研究人员需要找出一种好方法的把形成肿瘤的细胞分离出来。可是直到前不久，整个工作还是没有突破性的进展。主要原因是因为当时科学家还没有能进行研究的分子工具。不过当20世纪90年代初出现了所需工具后，科学家就在急性髓细胞性白血病中发现了干细胞。研究报告中称，这种细胞只占白血病细胞的百分之一，并且只有它们才能在小鼠体内形成肿瘤。但是当时癌症研究人员并不信服，而且即使承认了这项研究，也仍然怀疑该结果是否也适用于如乳腺、结肠、前列腺或脑部等部位的实体肿瘤。但是在1994年，维哈博士和他的一个同事、现在斯坦福的迈克尔·克拉克发表研究报告称，他们在乳腺癌患者身上发现了癌症干细胞时，情况发生了改变。研究人员目前已经在结肠、头颈、肺、前列腺、脑部和胰腺的恶性肿瘤中发现了癌症干细胞。

干细胞是具有自我更新、无限增殖及多向分化能力的细胞群体。最近越来越多的证据显示，肿瘤组织及肿瘤细胞株中的细胞存在着等级性，即存在着不同分化阶段的细胞，这些细胞在性质及功能上存在着诸多差异，其中有一部分的肿瘤细胞充当干细胞的角色，在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性作用，被命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)。乳腺癌干细胞是一群未分化、具有自我更新、多系分化潜能的细胞。人们采用多种策略成功地分离出乳腺癌干细胞。随着乳腺癌干细胞的成功分离以及体外的成功培养，对其生物学行为的认识也逐渐深入。化疗抵抗性、放疗抵抗性、缺氧抵抗性、高致瘤性、高侵袭转移性是这群细胞的特征，成为肿瘤难以根除、日后复发的一个重要原因。而乳腺癌干细胞相关的“侵袭性”基因信号(“invasiveness”gene signature，IGS)与预后的关系令人瞩目，具有重要的临床指导意义。乳腺癌干细胞的自我更新、分化以及转移等特性受到许多信号转导通路和微环境的调控。如何靶向治疗乳腺癌干细胞，最终根治乳腺癌，正逐渐成为肿瘤靶向治疗研究的一个热点。

目前针对肿瘤标志物的检测试剂盒很多，一般是利用磁珠去检测血液中乳腺癌标志物的含量，以判断被检测者是否患有乳腺癌。但是这种检测方法非常不准确。我们知道肿瘤标记物含量的增加有可能是因为肿瘤细胞的分泌，也有可能是其他应激反应等因素造成该标志物蛋白含量增加，因此即使检测到肿瘤标志物含量增加也不能准确判断血液中是否真的存在肿瘤细胞或肿瘤干细胞。面对这些问题，本领域技术人员通常的做法是将多个肿瘤标志物结合检测，用以增加检测的准确性，但是检测成本非常高，普通患者很难接受。另外即使结合检测，也不能断定该检测就一定准确。

综上所述，目前本领域急需一种能够准确检测外周血中游离肿瘤细胞标志物含量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以准确检测外周血液中游离乳腺癌细胞标志物的试剂盒，该检测结果对乳腺癌治疗方案的选择和预后具有重要指导意义。

本发明的发明思路为：采用RT-PCR，Real-Time PCR以及芯片等分子生物学的方法检测血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，确定药物治疗靶点上的基因，通过检测GA733、Muc-1和Her-2的表达水平，确定乳腺癌发展及转归，对于肿瘤的个性化治疗具有重要的实际意义。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

第一步：从循环血中分离出乳腺癌肿瘤干细胞和肿瘤细胞混合细胞，如图1所示，携带有乳腺癌抗体的磁珠与乳腺癌细胞结合，将其从循环血中分离出来。

第二步：将分离到的乳腺癌肿瘤干细胞和肿瘤细胞分离。

第三步：采用分子生物学的方法，对第二步分离的肿瘤干细胞和肿瘤细胞进行鉴定，确定肿瘤细胞的性质。

一种检测血液中游离乳腺癌细胞标志物的试剂盒，所述试剂盒组分如下：

磁珠处理液；

带有乳腺癌抗体的磁珠；

10X缓冲液4.0～5.0μl；

dNTPs 4.0～5.0μl；

反转录酶2.0～3.0μl；

RNA酶抑制剂40u/μl 0.4～0.6μl；

10X热启动PCR混合液20.0～30.0μl；

ddH₂O 10.0～15.0μl；

乳腺癌标志物引物3.0～5.0μl。

上述试剂盒，所述乳腺癌标志物为GA733-2、Muc-1及Her-2。

所述PCR引物序列为，见表1：

表1

上述试剂盒，所述乳腺癌抗体为：Anti-Epithelial specific antibody(BerEP4)单克隆抗体、抗cytokeratin单克隆抗体及抗HER2单克隆抗体中的一种或多种。

本发明试剂盒主要用途为用于乳腺癌标志物的检测中，具体使用方法为本领域技术人员公知内容。

本发明的优点及有益效果是：

1、本发明为检测血液中残存的乳腺癌肿瘤细胞提供一个非常可靠的方法；本发明首先利用磁珠将乳腺癌肿瘤细胞分离出来，然后针对分离出的肿瘤细胞进行检测，准确性可达100％。

2、本发明为乳腺癌治疗——即化疗和放疗的疗效提供具体的可靠的观察数据。针对检测分离得到的乳腺癌肿瘤细胞标志物的含量来确定所检测的细胞是肿瘤细胞还是肿瘤干细胞。为预后方案的选择和治疗方案的选择提供了有力的数据支持。

3本发明主要针对乳腺癌患者治疗后的监测，为乳腺癌治疗后是否复发及治疗效果如何提供可靠的实验依据。

以上本发明内容部分已对本发明做了充分的说明，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明，本实施方式仅是本发明最佳实施方式，并非对本发明的限定。

附图说明

图1为包被有抗体的磁珠从血液中分离肿瘤细胞的示意图。

图2为采用Agilent生物分析仪对PCR产物进行分析实例。

具体实施方式

实施例1磁珠的制备

抗体免疫磁珠的制备：使用的抗体为抗BerEP4单克隆抗体、抗cytokeratin单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体。本发明采用分别标记上述3种抗体然后将它们混合使用。也可以选择其中的一种或两种抗体进行分别标记混合使用。

方法：采用invitrogen公司生产的Dynabeads Antibody Coupling Kit。标记的方法严格按照生产商的说明书进行。

实施例2乳腺癌细胞的分离

1.样品采集：

采集乳腺癌患者5～7.5ml外周血，EDTA抗凝，4hr之内使用(或4度保存48hr内使用)。

2.选择磁珠：

2.1磁珠的处理：

·混均磁珠，使用移液器轻轻的吹吸，不能用混旋仪；

·采用PBS缓冲液清洗，清洗时，不能碰触微球；

·吸取比所需样品量多一些的磁珠微球加入1.5ml的离心管管中；

·放在磁铁上，1分钟，弃去上清；

·用1ml PBS，清洗3次，用于清除防腐剂；

·移去上清；

·吸取和原有体积相同的100ul含有PBS的微球。

2.2肿瘤细胞的选择

·将5毫升外周血放入15毫升锥形离心管中；

·加入100μL步骤2.1制备的乳腺癌选择磁珠；

·在摇床上孵育15～30分钟。

2.3将15ml的锥形离心管插入磁铁架中，3分钟后收集磁珠到试管中。

2.4去除不要的细胞

·在MPC-L中加磁3分钟；

·用10毫升吸管移去上清。

·加5毫升PBS振摇。

2.5取1毫升带有细胞的PBS，转到1.5毫升管中。

2.6溶解

·去除上清(PBS)；

·取出磁铁；

·加200μl溶解/结合液，用加样器上下吹吸5次以重新混悬；

·在这一步中细胞溶解，mRNA释放到上清中；

·将磁铁放回磁铁架上继续孵育；

·将上清移到新EP管中；

·将含有乳腺癌选择磁珠的管弃去。

2.7乳腺癌选择步骤结束

·接乳腺癌检测部分或-20℃储存mRNA最长1周，长期储存采用-70℃。

实施例3乳腺癌细胞肿瘤标志物的检测

3.1试剂盒准备

·将试管放在室温下；

·将试剂盒中的RNase-free水放室温；

·将试管上述含有上清的离心管管放在冰上；

·准备磁珠。

3.2准备寡核苷酸

·取适量的带有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠(建议不要用混悬仪混匀，手工混悬)；

·转移至1.5ml管中；

·采用裂解/结合缓冲液中冲洗2次。

3.3将mRNA结合磁珠上

·加20μl磁珠在每个细胞溶解样本中；

·孵育10分钟。

3.4纯化mRNA

·采用缓冲液清洗2次；

·再用缓冲液清洗2次磁珠；

·再用100μl Tris-HCl缓冲液清洗一次；

·用29.5μl纯净水悬浮磁珠。

3.5mRNA解链

·50℃水浴中孵育5min；

·冰上放置2min。

3.6反转录，见表2：

表2反转录步骤

反转录实验注意

·采用磁珠和上清做反转录实验；

·在反转录实验步骤时，至少包括一个阴性对照(阴性对照为将应加入样品的体积用纯净水或PCR专用的蒸馏水代替)。

3.7反转录程序

37℃60分钟，93℃5分钟，4℃保存。

3.8反转录结束后

继续进行PCR或储存在-20℃(最长可以保存2周)。

3.9PCR步骤，见表3

表3

3.9PCR：程序

95℃15min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，循环35次；72℃10min；4℃保存。

3.10PCR结束

采用电泳及Agilent生物分析仪分析对PCR产物进行分析。见附图2所示，图2为采用Agilent生物分析仪对PCR产物进行分析实例，图中的Ladder表述的是采用的DNA分子量标准物质；1cell 2cells…10cells，表述的是在空白血浆中加入阳性肿瘤细胞的数量分别为1个细胞、2个细胞至10个细胞；RT control表述的是反转录对照；positive control表述的是阳性对照；negative control表述的是阴性对照。

3.11对照

·内标对照：actin；

·电泳分子量标准；

·PCR阳性对照(样品的阳性对照为从肿瘤细胞中提取的DNA，并保证PCR后有阳性的条带)；

·PCR阴性对照(纯净水)；

·反转录阴性对照。

实施例4结果的确认

·所有患者的样品必须有Actin基因的条带(内标)；

·RT的阴性对照不能有大于80个核苷酸的条带；

·如果产物大于1kb，说明被基因组DNA污染(内含子)；

·如图2所示，在本实验中PCR产物中3个阳性条带中任何一个条带为阳性均可以判定结果为阳性。在PCR结果中，除Actin外的3个PCR产物均存在于肿瘤细胞，而GA733-2的PCR产物与肿瘤干细胞有关。检测结果出现该条带说明在患者的血液中存在肿瘤干细胞。

如图2所示，在PCR结果中，除Actin为每次必须出现的条带外，其他的3个条带可以随机出现。但是采用本方法检测，最低的PCR检出量为2个细胞，即在被测样品中只要存在2个及2个以上的肿瘤细胞或肿瘤干细胞，均可以检测到3个PCR产物中的任何一个。本发明检测方法简便，且检测样本量小，准确率可以达到100％，检测结果可信。

本发明检测结果较之现有技术准确，且本发明主要针对乳腺癌患者治疗后的监测，为医生对乳腺癌患者治疗后是否复发及治疗效果如何提供可靠的实验依据。