甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用

摘要

本发明涉及甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用，具体提供了一种转基因植物非预期毒性的分析预测方法，其检测方法为1、获得转基因植株甲基化敏感多态性差异片段；2、转基因植株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序；3、利用转基因植株甲基化差异DNA片段分析转基因植株的非预期毒性。本发明将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物的非预期毒性，建立了分析转基因植株中是否具有非预期毒性的技术体系，有助于转基因植株的监测和推广应用，具有重要的经济效益和社会效益。

说明书

(一)技术领域

本发明将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物的非预期毒性，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

新一代转基因植物中常导入多个外源基因，为复合性状转基因植物。外源基因之间、外源基因与野生型(受体)植物内源基因之间可能存在互作，使一些在野生型(受体)植株中甲基化的DNA序列在新一代转基因植株中去甲基化，进而使这些DNA序列中的基因在新一代转基因植株中表达，使新一代转基因植物中出现非预期的毒性，所以有必要建立转基因植物非预期毒性的分析预测方法。甲基化敏感扩增片多态性技术是在1995年Zabeau等发明的扩增片段长度多态性技术基础上改进的。自1999年该技术被Xiong等证明是一种可靠的检测植物DNA甲基化方法以来，甲基化敏感扩增多态性技术已被广泛用于水稻、棉花等多种植物的研究。但是，目前国内外尚未将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物是否具有非预期毒性。

本发明人将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物的非预期毒性，建立了分析转基因植株中是否具有非预期毒性的技术体系，有助于转基因植物的监测和推广应用，具有重要的经济效益和社会效益。

(三)发明内容

本发明涉及甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用，具体提供了一种转基因植物非预期毒性的分析预测方法，该方法包括以下步骤：

1、获得转基因植株甲基化敏感多态性差异片段

分别提取转基因植株以及野生型(受体)的基因组DNA。对基因组DNA进行酶切并连接接头后，进行预扩增。以预扩增产物为模板，进行选择性PCR扩增，并对选择性PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在变性聚丙烯酰胺凝胶上挖取转基因植株的甲基化差异DNA片段。

2、转基因植株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序

3、利用转基因植株甲基化差异DNA片段分析转基因植株的非预期毒性

根据测序结果，利用KEGG数据库分析这些差异片段所涉及的代谢途径，分析转基因植株中是否具有非预期毒性。

根据上述技术体系，提取转基因植株以及野生型(受体)的基因组DNA后，能够分析转基因植株中是否具有非预期毒性，有助于转基因植株的监测和推广应用，具有重要的经济效益和社会效益。

(四)附图说明

图1是转基因植株甲基化敏感多态性片段在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离后拍摄的部分图片：

H1代表转基因植株基因组DNA经EcoR I+Hpa II双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，

M1代表转基因植株基因组DNA经EcoR I+Msp I双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，

H2代表非转基因植株基因组DNA经EcoR I+Hpa II双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，

M2代表非转基因植株基因组DNA经EcoR I+Msp I双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，

箭头所指为部分甲基化敏感多态性差异片段，

S4、S6、S7、S12、S13、S15、S17、S23为部分甲基化敏感多态性差异片段名称。

图2是部分转基因植株甲基化敏感多态性差异片段从变性聚丙烯酰胺凝胶回收后再扩增的结果：

S4、S6、S7、S12、S13、S15、S17、S23为部分甲基化敏感多态性差异片段，

M为DNA分子量标记。

(五)具体发明实施方式

实施例1：转基因植株甲基化敏感性多态性差异片段的获得

1、转基因植株基因组DNA的提取

在相同栽培条件下，培养转fhy3、GUS基因拟南芥以及野生型拟南芥幼苗，采用传统的CTAB法分别提取其基因组DNA。

2、转基因植株基因组DNA的酶切及连接

委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物序列：EcoR I接头1(5’-CTCGTAGACTGC GTACC-3’)、EcoR I接头2(5’-AATTGGTACGCAGTC-3’)、MspI/Hpa II接头1(5’-GATCATGAGTC CTGCT-3’)、Msp I/Hpa II接头2(5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’)。将EcoR I接头1与EcoR I接头2用蒸馏水溶解并混匀后，置于95℃5min，然后在室温冷却，制得5pmol EcoR I接头。将Msp I/Hpa II接头1与MspI/Hpa II接头2用蒸馏水溶解混匀后，置于95℃5min，然后在室温冷却，制得50pmol MspI/Hpa II接头。选取两个对甲基化敏感的同位酶Hpa II/Msp I分别与限制性内切酶EcoR I进行组合，对转fhy3、GUS基因拟南芥以及野生型拟南芥基因组DNA在37℃双酶切6h。25μl酶切体系包括：1×buffer，1μg模板基因组DNA，1U EcoR I，1U Hpa II/Msp I。把基因组DNA酶切片段与10μl连接混合物混匀后，在16℃连接过夜，然后在65℃保温15min终止反应。10μl连接混合物包括：5pmol EcoR I接头，50pmol Hpa II/Msp I接头，1U T4 DNA ligase，1×buffer for T4 DNA ligase。

3、预扩增

分别以转基因拟南芥和野生型拟南芥基因组DNA的酶切连接产物为模板，利用EcoR I预扩增引物(5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’)和Hpa II/Msp I预扩增引物(5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’)进行预扩增。25μl反应体系包括1×PCR buffer，0.4mMdNTP，1.2mM MgCl₂，2μl酶切连接产物，50ng EcoR I预扩增引物，50ng Hpa II/Msp I预扩增引物，1U Taq聚合酶。预扩增条件为：94℃变性2min后，按以下参数扩增30个循环：94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 60sec，最后72℃延伸10min。用TE buffer按1∶10的比例稀释预扩增产物。

4、选择性PCR扩增

以稀释的预扩增产物为模板，利用EcoR I选择性扩增引物(在序列5’-GACTGCGTACCAATTCA-3，的3’端增加2-3个碱基)和Hpa II/Msp I选择性扩增引物(在序列5，-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’的3’端增加2-4个碱基)进行选择性PCR扩增。25μl反应体系包括1×PCR buffer，0.4mM dNTP，1.2mM MgCl₂，4μl预扩增产物，50ng EcoR I选择性扩增引物，50ng Hpa II/Msp I选择性扩增引物，1U Taq聚合酶。按下列参数PCR循环：在94℃变性2min后，按以下参数先扩增13轮循环：94℃ 30sec，65℃ 30sec(每轮循环温度递减0.7℃)，72℃ 60sec；最后按下列参数扩增23轮循环：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃60sec。

5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

使用Bio-Rad公司的测序电泳装置(Sequi-Gen GT)，对选择性PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。上样6μl，恒功率70W电泳3h。电泳结束后，进行银染。对酶切片段进行MSAP分析能够反应酶切位点的甲基化状态及程度，将EcoR I+Hpa II和EcoR I+Msp I酶切产物的扩增条带划分为4种类型：类型I，EcoR I+Hpa II和EcoR I+Msp I两条泳道均有带，无甲基化发生；类型II，EcoR I+Hpa II泳道有带而EcoR I+Msp I泳道无带，单链DNA外部甲基化；类型III，EcoR I+Hpa II泳道无带而EcoR I+Msp I泳道有带，双链DNA内部甲基化；类型IV，EcoR I+Hpa II和EcoR I+Msp I两条泳道均无带，双链DNA的外部甲基化。比较转基因拟南芥和野生型拟南芥EcoR I+Hpa II和EcoR I+Msp I双泳道的带型，重点分析转基因拟南芥中无甲基化、野生型拟南芥中甲基化的DNA差异片段，用一次性手术刀片从聚丙烯酰胺凝胶挖取转基因植株甲基化敏感多态性差异片段。

实施例2：转基因植株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序

1、甲基化差异DNA片段的回收

将挖取的转基因植株甲基化敏感多态性差异片段置于30μl双蒸水中，煮沸5min。缓慢降至室温后离心，回收上清液。取4μl上清液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件与预扩增PCR反应一致。按照DNA回收纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)说明书对PCR产物回收纯化。

2、甲基化差异DNA片段的克隆

按照连接试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)说明书，将回收纯化的PCR产物连接到pUCm-T载体，转化大肠杆菌菌株DH5α。

3、甲基化差异DNA片段的测序

本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。

实施例3：转基因植株非预期毒性的分析

1、打开KEGG数据库，输入转基因拟南芥中无甲基化、而野生型拟南芥中甲基化的DNA序列，分析该序列所涉及的代谢途径是否与毒性物质的合成有关。若序列所涉及的代谢途径与毒性物质的合成有关，说明转基因植株可能具有非预期毒性。

2、Southern杂交验证

采用传统的CTAB法，分别提取转基因拟南芥、野生型拟南芥基因组DNA。若转基因植株甲基化差异DNA片段的序列所涉及的代谢途径与毒性物质的合成有关，将该序列按照地高辛标记与检测试剂盒(Roche公司产品)说明书标记成探针后，分别与转基因拟南芥、野生型拟南芥基因组DNA进行杂交。若杂交结果呈阳性，说明转基因植株甲基化差异DNA片段是PCR扩增的特异性产物，转基因植株具有非预期毒性。