一种用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系

摘要

本发明提供了一种用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系，分子反应体系为：模板DNA50ng，dNTP200μmol/L，10×PCR Buffer2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq酶0.5U，最后加ddH

说明书

背景技术

实蝇科（Tephritidae）是双翅目（Diptera）中最大的类群，世界上已经描述的实蝇种类超过4500余种，有70余种被认为是农业上的重要害虫，已对农林作物生产构成威胁。现阶段，在实蝇的口岸检疫鉴定工作中, 主要以成虫的外部形态特征作为分类依据, 若截获的是幼虫或卵, 则需对其进行室内饲养，待获得成虫后再进行鉴定，造成检疫周期长,不利于检疫性害虫发现与防控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系，总体积为25μl：模板DNA 50ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq 酶0.5U，最后加ddH₂O至25μl；ISSR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；52℃退火45s，72℃延伸90s；共36个循环；最后72℃延伸10min。

1、模板DNA的制备。

所述模板DNA的制备如下：

取实蝇成虫，加入800μl提取缓冲液,于冰浴中充分研磨后移入1.5 ml Eppendorf管中，加0.5mg/ml蛋白酶K，混匀后于65℃水浴1h，加入8mol/L KAc100μl，使其充分混匀，然后冰浴1h，4℃下12000r/min离心20min，取上清液加入800μl预冷的无水乙醇，混匀，冰浴2h，12000r/min离心20min，取沉淀用70%的乙醇洗涤1次，5000r/min离心5min，沉淀于37℃干燥4～6min，最后加入10μl RNA酶和40μl TE溶解，37℃水浴1h,4℃保存备用；所述提取缓冲液配制为：0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L蔗糖，0.05mol/L EDTA，0.5% SDS。

为了得到上述技术方案，本申请人进行了一系列有益的试验：

本发明的分子反应体系从模板浓度、引物浓度、dNTP 浓度和Taq DNA聚合酶用量等影响ISSR 反应的4个主要因素着手，优化了适合于实蝇ISSR-PCR扩增反应的最佳反应条件，进而建立了一套用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系。

（1）ISSR-PCR反应体系的优化

基准反应体系（总体积25 μl）：模板DNA 20 ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.20 μmol/L，Taq酶1 U，最后加ddH₂O 至25μl。

① dNTP 浓度优化：在模板浓度、引物浓度、Taq DNA 聚合酶用量等其它条件不变的情况下，设计100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L 等5个dNTP 浓度梯度，检验dNTP 浓度对ISSR反应的影响，以寻找最适浓度。

②引物浓度优化：在模板浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量等其它条件不变的情况下，设计0.15 μmol/L、0.20 μmol/L、0.25 μmol/L、0.30 μmol/L、0.35 μmol/L 等5个引物浓度梯度，检验引物浓度对ISSR反应的影响，以寻找最适浓度。

③ Taq 酶用量优化：在模板浓度、引物浓度、dNTP 浓度等其它条件不变的情况下，设计0.5 U、0.75 U、1 U、1.25 U、1.5 U等5 个Taq 酶用量梯度，检验Taq酶用量对ISSR反应的影响，以寻找最适用量。

④ 模板浓度优化：在引物浓度、dNTP 浓度、Taq DNA聚合酶用量等其它条件不变的情况下，设计了25、50、75、100、125 ng 等5个DNA模板用量梯度，检验模板DNA浓度对ISSR反应的影响，以寻找最适浓度。

（2）ISSR-PCR扩增产物的检测

以DNA Marker DL 2000为标准分子量，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，电压110V，电泳时间40 min，将胶块放到EB 染色液中染色10 min，再用清水漂洗，BIO-RAD 凝胶成像仪观察，拍照保存。

（3）ISSR-PCR反应体系的建立

通过ISSR-PCR反应体系的优化和ISSR-PCR扩增产物的检测，确定了ISSR-PCR反应体系。根据梯度试验确立实蝇ISSR反应最佳反应体系（总体积25μl）：模板DNA 50ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq 酶0.5U，加ddH₂O至25μl。ISSR一般扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；52℃退火45s；72℃延伸90s；循环36次；最后72℃延伸10min。

本发明的显著优点：

本发明考虑了模板浓度、引物浓度、dNTP 浓度和Taq DNA聚合酶用量等4个主要影响ISSR 反应的因素，探讨了最佳的反应条件，构建了实蝇种群遗传多样性的分子反应体系，能揭示其种群间的遗传多样性，辨析区域间实蝇种群的亲缘关系，并且快速、准确和灵敏地检测出实蝇种类, 弥补了传统方法的不足。本发明在检疫性实蝇的检测鉴别方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实蝇DNA电泳检测图，其中1：桔小实蝇（FZ）2：瓜实蝇（ZZ），3南瓜实蝇（FZ），4南瓜实蝇（FZ）：5：瓜实蝇（FZ）；

图2为不同的ISSR反应条件对ISSR扩增的影响；其中从左到右依次为M（Marker）,不同浓度dNTP，不同浓度引物，不同浓度Taq酶，不同浓度模板对ISSR扩增的影响；

图3为不同地区实蝇的ISSR分析电泳检测图，其中1：桔小实蝇（FZ）2：瓜实蝇（ZZ），3南瓜实蝇（FZ），4南瓜实蝇（FZ）：5：瓜实蝇（FZ）。

具体实施方式

本发明的用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系，总体积为25μl：模板DNA 50ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq 酶0.5U，最后加ddH₂O至25μl；ISSR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；52℃退火45s，72℃延伸90s；共36个循环；最后72℃延伸10min。

其中模板DNA的制备如下：

每个种群取5头实蝇成虫加入800μl提取缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L蔗糖，0.05mol/L EDTA，0.5% SDS）,于冰浴中充分研磨后移入1.5 ml Eppendorf管中，加0.5mg/ml蛋白酶K，混匀后于65℃水浴1h，加入8mol/L KAc100μl，使其充分混匀，然后冰浴1h，4℃下12000r/min离心20min，取上清液加入800μl预冷的无水乙醇，混匀，冰浴2h，12000r/min离心20min，取沉淀用70%的乙醇洗涤1次，5000r/min离心5min，沉淀于37℃干燥4-6min，最后加入10μl RNA酶和40μl TE溶解，37℃水浴1h,4℃保存备用。

实施例1：

试验所用实蝇主要采自福建省漳州地区蔬菜基地诱捕的种群。实验所需的试剂Buffer（10×PCR Buffer）、dNTP、DNAMarker DL 2000、Taq DNA聚合酶等购自上海生物工程有限公司；随机引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；Tris、HCl、EDTA、NaCl、Kac、乙醇等均为国产分析纯试剂。具体内容如下：

1、模板DNA制备及有效性验证

利用本发明改良的DNA提取方法进行了模板DNA的提取，然后用紫外分光光度计和凝胶电泳测定实蝇DNA浓度及纯度，验证模板DNA的有效性。

（1）紫外分光光度计检测

使用WFZ800-D3B 型紫外可见分光光度计，检测DNA的浓度和纯度。取1μl DNA溶液，以超纯水为空白对照，检测DNA样品在260 nm、280 nm的吸光值（OD），由此计算DNA的浓度和纯度：

DNA样品浓度（ng/μl）＝DNA样品的纯度＝OD₂₆₀/OD₂₈₀

其中， OD₂₆₀ 为260 nm 波长处DNA样品的吸光值；OD₂₈₀为280 nm波长处DNA样品的吸光值。

（2）凝胶电泳检测

以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，取5μl 的DNA 样品，电泳缓冲液TBE（45 mmol/L Tris-硼酸、10 mmol/L EDTA），电压110 V，电泳时间约30 min，然后将胶块放到EB染色液中染色约10 min，用清水漂洗后，BIO-RAD 凝胶成像仪观察，拍照保存。

结果表明：所提取的DNA样品的色泽近白色或无色，说明大多数杂质已经被彻底去除。实蝇总DNA琼脂糖电泳图谱见图1 (随机抽取5份供试材料的基因组总DNA)所示。由图1可以看出．基因组DNA电泳得到的条带，比较整齐清晰。分子量较大且基本无降解、断裂，完整性好。取20μlDNA提取原液稀释100倍。在WFZ800-D3B紫外可见光分光光度计上测得DNA的OD₂₆₀及OD₂₈₀。并计算出OD₂₆₀及OD₂₈₀的比值及样液的浓度，结果如表1所示。从表1可以看出：OD₂₆₀／OD₂₈₀的比值为1.81-1.94，说明所提实蝇基因组DNA质量和产量均较高。因此，本发明反应体系中制备的模板DNA是有效的，可达到ISSR反应的要求。

表1  5份实蝇基因组DNA样品的紫外分光光度计分析结果

2、ISSR-PCR反应体系的建立

（1）ISSR-PCR反应体系的优化

① dNTP 浓度优化：dNTP 浓度的高低对PCR反应的特异性及扩增产物的产量有较大的影响。其浓度太高会产生错误掺入，降低了准确率；其浓度太低则会造成产物产率过低，导致条带模糊。试验设计了100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300 μmol/L 5 个dNTP浓度梯度（见图2）。试验结果表明：所设5个梯度中4个有条带产生，但dNTP浓度在200 μmol/L时，扩增出来的条带最多，且比较清晰。可见，25μl 的ISSR反应体系中dNTP浓度设为200 μmol/L。

② 引物浓度优化：在ISSR反应中，引物浓度太低，会导致不能进行扩增反应；浓度太高，则会产生新的扩增带。试验设计了0.15μmol/L、0.20μmol/L、0.25μmol/L、0.30μmol/L、0.35μmol/L 5个引物浓度梯度（见图2）。结果表明：0.25μmol/L的浓度时扩增出来的条带带型稳定、清楚，而随着引物浓度的升高，扩增产物条带逐渐变弱至没有。因此，25 μl 的ISSR 反应体系中随机引物浓度设为0.25μmol/L。

③ Taq酶用量优化：试验采用上海生物工程有限公司的Taq DNA聚合酶。试验设计了0.5U、0.75U、1U、1.25U、1.5 U 5 个Taq 酶用量梯度（见图2），结果表明：0.5 U的Taq酶用量获得的扩增效果最好，条带清晰、稳定。酶量少，会影响扩增产物的产量；酶量过多，有可能产生非特异性扩增，同时考虑到Ex TaqDNA聚合酶的费用。因此，在25 μl 的ISSR 反应体系中Taq酶用量设为0.5 U。

④ 模板浓度优化：试验设计了25 ng、50 ng、75 ng、100 ng、125ng 5个DNA模板用量梯度（见图2）。结果表明：DNA模板为50 ng 时获得的扩增效果最好，条带数最多，且清晰、稳定。同时可看出随着模板浓度的升高，扩增产物的效果反而下降了，可能是因为模板浓度过高导致非特异性反应增加，造成了弥散型产物。因此，25 μ l 的ISSR 反应体系中DNA 模板的用量在50ng左右。

（2）ISSR-PCR扩增产物的检测

（3）ISSR-PCR反应体系的建立

经ISSR-PCR反应体系的优化和ISSR-PCR扩增产物检测，确定了ISSR-PCR反应体系。根据梯度试验确立实蝇ISSR反应最佳反应体系（总体积25μl）：模板DNA 50ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq 酶0.5U，加ddH₂O至25μl。ISSR一般扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；52℃退火45s；72℃延伸90s；循环36次；最后72℃延伸10min。根据该体系，对5份实蝇基因组DNA样品进行ISSR-PCR扩增，结果如图3所示，可见该体系扩增效果好，条带数多，且清晰、稳定，并表现出丰富的多样性。