大豆离体生长点基因枪转化方法

摘要

一种生物工程技术领域的大豆离体生长点基因枪转化方法，通过用包含目的基因载体制成子弹，装到基因枪上，然后轰击无菌苗，经过接种诱导，得T0代植株；然后将把T0代植株经诱导生根和开瓶炼苗后经诱导其开花结实，得到T1代种子；最后将T1代种子移载到人工气候室或大田中，得到T2代植株及其纯合阳性转化子。本发明利用了大豆离体生长点植株再生比较容易的特性，可显著提高转化效率。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的方法，具体是一种大豆离体生长点基因枪转化方法。

背景技术

大豆是当今世界上第五大作物，仅次于小麦、水稻、玉米和大麦。我国既是大豆生产大国，也是消费大国，每年都要进口大量转基因大豆。与发达国家相比，我国大豆科技水平相对落后，大豆品质缺乏国际竞争力。加强转基因大豆的自主研究和利用，是我国今后在大豆产业应该坚持的发展方向。目前制约我国大豆转基因技术进一步发展的主要因素是，农杆菌介导的大豆子叶节、下胚轴，愈伤组织等转基因受体植株再生系统的不完善，多数再生植株畸形，不能伸长、生根，最后死亡，导致转基因效率低下。

经对现有技术文献的检索发现，王萍等在《大豆科学》上发表了“基因枪法将GmDREB基因导入大豆的研究”，获得了4个阳性转化子。该文章中使用的转基因受体为体细胞胚。体细胞胚诱导受基因型的限制，目前只有少数几个品种诱导成功。另外体细胞胚的植株再生频率也很低，所以转化效率很低。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种大豆离体生长点基因枪转化方法，以数量足够多的，暴露在外面的大豆离体生长点为受体，通过基因枪将目的基因导入其中，然后在后代种子中筛选得到阳性纯合转化子。由于大豆离体生长点植株再生比较容易，可以显著提高转化效率。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过用包含目的基因载体制成子弹，装到基因枪上，然后轰击无菌苗，经过接种诱导，得T0代植株；然后将把T0代植株经诱导生根和开瓶炼苗后经诱导其开花结实，得到T1代种子；最后将T1代种子移载到人工气候室或大田中，得到T2代植株及其纯合阳性转化子，具体包括如下步骤：

步骤一，用氯气对大豆种子表面进行消毒，然后接种到种子萌发培养基中，得到无菌苗；

所述的大豆种子的种皮完整且健康无病斑。

步骤二，剥离足够多的生长点，铺满到一个玻璃培养皿中；

所述的生长点是指选取带有4-6片叶原基且长度为0.4-0.6厘米的无菌苗，扒开叶原基使生长点暴露在无菌苗外部。

步骤三，用包含目的基因载体制成子弹，装到基因枪上，然后轰击培养皿的中央部位3-4次；

所述的子弹是指：包裹目标DNA的直径为1.5μm的黄金颗粒，60μg金粉包被1μg DNA。

所述的基因枪采用BD81-GJ-1000型气体加速枪，该基因枪将包被外源DNA的金属微粒加速，使其穿过细胞壁而进入细胞内，将外源DNA分子送进细胞核或细胞器中，整合到染色体或细胞基因组上，从而实现外源DNA的转移。

所述的包含目的基因载体，为植物表达载体PBI221；

步骤四，将基因枪轰击后的生长点接种到成苗培养基，诱导成苗，得到T0代植株；

所述的成苗培养基为添加0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤的MS培养基。

所述的成苗培养基为添加1.0mg/L赤霉素的1/2MS培养基。

所述的MS培养基采用Murashige和Skoog(1962)公开的培养基，MS培养基在现有

的生物以及农业等领域有着广泛的应用。具体成分如下：

所述的1/2MS培养基为大量元素减半的MS培养基。

步骤五，把T0代植株转入生根用的培养瓶中诱导生根；

所述的生根用的培养瓶为，20厘米高，直径8厘米的桶状瓶，用可降解的聚内交酯制成，该培养瓶内充有生根培养基；

所述的生根培养基为添加0.3mg/L吲哚丁酸1/2MS培养基；

步骤六，T0代生根植株开瓶炼苗3-5天后，移载到人工气候室中，并诱导其开花结实，得到T1代种子；

所述的炼苗是指：打开培养瓶让幼苗在人工气候室中锻炼，使其尽快适应自然环境。

步骤七，T1代种子移载到人工气候室或大田中，得到T2代植株；

所述的移载到人工气候室是指：将T0代植株连同可降解培养瓶，一起移载到人工气候室的土壤中。

步骤八，对T2代植株进行分子鉴定和转基因功能验证，从而得到纯合阳性转化子。

与现有技术相比，本发明具有的优点为：1.生长点作为转化受体对受体材料的影响小，具有很高的植株再生频率，可以提高转化效率；2.省去了农杆菌浸泡，共培养，除菌等步骤，操作简便，可控度高。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本实施例的大豆种子来自本实验室。

本实施例包括如下步骤：

步骤一，用75ml次氯酸钠和25ml浓盐酸反应生成的氯气对大豆种子表面消毒1小时，然后接种到添加0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤的MS的种子萌发培养基(即MS+0.5mg/L 6-BA)中，得到无菌苗；

步骤二，剥离足够多的带4-6片叶原基，长度为0.4-0.6厘米的生长点，扒开叶原基使生长点暴露在外面，然后将这些生长点放到一个直径为5-6厘米的玻璃培养皿中，铺满整个皿底。

步骤三，用包含目的基因的载体包裹到子弹上，装到基因枪上，然后轰击培养皿的中央部位3-4次；

步骤四，将基因枪轰击后的生长点接种到添加1.0mg/L赤霉素的1/2MS成苗培养基(即1/2MS+1.0mg/L GA₃)中，诱导成苗，得到T0代植株；

步骤五，把T0代植株转入添加0.3mg/L吲哚丁酸1/2MS的生根培养基(即1/2MS+0.3mg/L IBA)中，诱导生根，培养瓶用可降解材料聚内交酯制成；

步骤六，T0代生根植株开瓶炼苗3-5天后，连同可降解培养瓶一起移载到人工气候室中，并诱导其开花结实，得到T1代种子；

步骤七，T1代种子播种在人工气候室中，得到T2代植株；

步骤八，对T2代植株进行PCR和Northern检测和转基因功能验证，从而得到纯合阳性转化子。

本实施例对100粒大豆种子进行了消毒，得到无菌苗后显微镜下剥离得到带4片叶原基，长度为0.4-0.6厘米的生长点。基因枪转化后得到了10个纯合阳性转化子。