一种利用程序温度调控的繁茂膜海绵组织人工培养的方法

摘要

本发明涉及一种利用程序温度调控的繁茂膜海绵组织人工培养的方法，通过人工构建温控系统，打破了海绵生长受季节温度变化的影响，将海绵在自然海域的季节性增长模式变为人工可控条件下的连续增长模式，考察了海绵在生长周期内的生物量变化，组织形态变化和内部结构变化。本发明为海绵外植体反应器培养提供了一套完整的温度调控方法，为进一步通过可控条件下的代谢调控让海绵体内活性物质过量表达成为可能，为海绵外植体反应器培养和细胞生产生物硅质材料的研究提供了新颖而全面的对象体系。

说明书

技术领域

本发明涉及繁茂膜海绵的采集、养殖及生长周期的研究。具体地说是一种利用程序温度调控的繁茂膜海绵(Hymeniacidon per/evis)组织人工培养的方法，通过人工构建温控系统，打破了繁茂膜海绵生长受季节温度变化的影响，将海绵在自然海域的季节性增长模式变为人工可控条件下的连续增长模式。本发明为海绵外植体反应器培养提供了一套完整的程序温度调控方法，可在实验室的条件下人工调控海绵的生长周期，不同时期的海绵组织可用于不同的研究目的。

背景技术

海绵是最低等的多细胞动物，体内含有多种结构新颖功效独特的活性化合物，具有广阔的药物开发前景。但是在海绵药物的开发过程中，一个不容忽视的问题是：海绵体内的活性物质含量非常低。上个世纪，科学家们已经开始研究海绵外植体的反应器培养，希望在可控的条件下通过打破海绵生长的限制性因素，促进海绵外植体的快速增长，将海绵在自然海域的季节性增长模式变为人工可控条件下的连续增长模式，并通过可控条件下的代谢调控让海绵体内活性物质过量表达，从而达到人工可控条件下连续大量生产海绵活性物质的目的。所以，海绵外植体反应器培养被认为是较有希望的解决海绵“药源供给不足问题”的方法。另外，硅质海绵动物的骨针具有独特结构和良好光纤特性，在纳米生物技术仿生合成领域具有广泛的应用价值。

目前为止，海绵外植体反应器培养获得大量海绵生物量还没有取得成功，人工培养时海绵的存活和生长会受到很多因素的限制。此类研究的重要前提是明确海绵在反应器中需要的营养、光照、温度、压力等最佳条件。由于海绵的生长受季节温度变化的影响，呈现出旺盛生长、缓慢生长甚至衰退的现象，可控条件下培养，需要找到海绵快速生长的适宜温度范围，才能够在人工条件下打破海绵在自然条件下生长的限制，使海绵持续快速增长。

迄今为止，海绵外植体反应器培养获得大量海绵生物量还没有取得成功，利用程序温度调控繁茂膜海绵生长周期的方法，也未见相关报导。上述方法的建立，具有理论研究和实际应用的重要价值和迫切性。

发明内容

本发明的目的在于为海绵外植体反应器培养提供一套完整的程序温度调控方法。利用这种方法可以在实验室的条件下人工调控海绵的生长周期，使海绵在2个月左右的时间里走完原本在大自然中需要1年才能完成的生长周期，不同时期的海绵组织可用于不同的研究目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用程序温度调控繁茂膜海绵组织人工培养的方法，可按如下步骤操作，

(1)繁茂膜海绵的预处理：取处于复苏期的繁茂膜海绵，将海绵表面泥沙和附着生物除去、洗净后，室温条件下，放入海绵缸中预养，暂养过程使用沙滤天然海水，暂养7-10天，每3-4天换水1次；

(2)繁茂膜海绵的固定和基本培养条件：选取质量在1-4g的健康洁净的海绵组织，采用“十字法”用细线将海绵组织固定在玻璃培养皿的表面；将固定好的海绵放入玻璃缸中，沙滤天然海水养殖，每10升的沙滤天然海水中可放置总质量为10-20g的海绵组织，通过气泵充空气，喂食金藻，无阳光直射的自然光照条件下，一周换水2-3次；

程序温度调控方法：从开始培养时起将沙滤天然海水的温度设定为15-17℃，每隔两天上调0.8-1.2℃，直至24-26℃后维持8-12天；之后每隔两天下调0.8-1.2℃，一直降到15-17℃；之后每天降1.8-2.2℃，一直降到0-2℃，完成了繁茂膜海绵的一个自然条件下一年的生长周期。

在上述实验室的条件下人工调控海绵一年的生长周期，可随时采集不同时期的海绵组织用于生产或研究。

步骤(1)中所述复苏期的繁茂膜海绵是，于三月中旬海绵开始处于复苏期时，去大连凌水桥潮间带地区野外采集的海绵；采集时，选择表面污泥较少、颜色较鲜艳，体表相对平坦的海绵，将海绵从礁石上剥离后，立即放入盛有天然海水的小桶内，带回实验室；步骤(1)中所述将海绵表面泥沙和附着生物除去过程为，海绵组织采集回来后在1L沙滤天然海水中加一支2ml的硫酸庆大霉素注射液，浸泡海绵组织，用镊子轻轻地除去海绵表面的赃物。

步骤(2)中气泵的充气强度为1-2L air/L sea water/min；步骤(2)中每10升的沙滤天然海水中每天喂食1ml的金藻藻液，折合成金藻藻粉为0.02-0.04g；步骤(2)中所述玻璃缸里放置加热棒，玻璃缸外是冷水循环系统；用温度计显示玻璃缸中沙滤天然海水的水温。

本发明的优点如下：

1.通过人工构建温控系统，打破了海绵生长受季节温度变化的影响，将海绵在自然海域的季节性增长模式变为人工可控条件下的连续增长模式。本发明创新性地利用构建的温控系统，使海绵在将近2个月左右的时间里走完原本在大自然中需要1年才能完成的生长周期。

2.方法完整。原本对海绵的生长周期的考察得去野外实地考察，耗时长，受外界环境条件的影响大，不利于进行原位跟踪研究。而本发明构建的系统，很好地重复出了海绵在大自然的生长周期，能方便地考察海绵在不同的生长阶段的一些生理上的变化，为人工促进海绵胚胎的成熟提供了一种好的途径，为进一步诱导海绵幼虫的释放提供了可能。

附图说明

图1为本发明的海绵组织培养的温控系统结构示意图；

图2为温控系统培养下单位质量海绵比增长和培养温度的变化图；

图3为海绵组织在整个培养过程中的外貌形态变化图；

图4为海绵组织在整个培养过程中的石蜡切片图。

具体实施方式

实施例

本发明涉及一种利用程序温度调控的繁茂膜海绵组织人工培养的方法，通过人工构建温控系统，打破了海绵生长受季节温度变化的影响，将海绵在自然海域的季节性增长模式变为人工可控条件下的连续增长模式，考察了海绵在生长周期内的生物量变化，组织形态变化和内部结构变化。本发明为海绵外植体反应器培养提供了一套完整的温度调控方法，为进一步通过可控条件下的代谢调控让海绵体内活性物质过量表达成为可能，为海绵外植体反应器培养和细胞生产生物硅质材料的研究提供了新颖而全面的对象体系。

参考文献：张卫，曹旭鹏，虞星炬，金美芳，反应器培养海绵或其细胞生产生物硅质材料的方法及装置，申请号200610047416.7，申请日期2006-8-23；

本发明的海绵组织培养的温控系统结构示意图如图1所示：A冷水机，B泡沫箱，C玻璃缸，D加热棒，E电子温度计，F繁茂膜海绵；

程序温度设定的依据主要是繁茂膜海绵在大自然中的生长周期。繁茂膜海绵是一种季节性生长的海绵，在一年中的春季(大概3、4月份)开始复苏，这个时期海绵颜色灰暗，表面覆盖着薄薄的一层藻类和泥沙开始慢慢地掉落，开始慢慢地变得光亮，海绵主要还是独个呈块状分散生长；这个时期的海水温度在8-14℃。从6月份开始，海绵进入生长旺盛期，一直可以维持到9月份。这个时期的海绵颜色鲜艳，以橙黄和橙红色为主；海绵的厚度可达1cm以上，同时表面出现大量的被称为“乳突”的突起；海绵在礁石壁上大片地连在一起生长；这个时期的海水温度在18℃以上，最高可以达到25℃左右。从10月份开始，海绵进入衰退期，生物量开始减少，逐渐萎缩。12月份到来年的2月份，海绵处于冬眠期，这个时期的海绵生物量非常的少，但是基本保持不变，海绵的表面被覆盖上一层泥沙；这个时期的海水温度最低可以达到0℃左右。

基于以上考察统计的结果，结合实验目的，本发明采用的基本方案为：

(1)繁茂膜海绵的采集和预处理：三月中旬海绵开始处于复苏期，去野外采集海绵。实验所用的繁茂膜海绵采自大连凌水桥潮间带地区，选择表面污泥较少、颜色较鲜艳，体表相对平坦的海绵，将海绵从礁石上剥离后，立即放入盛有天然海水的小桶内，带回实验室。将海绵表面泥沙和附着生物除去、洗净后，室温条件下，放入海绵缸中暂养7天，暂养过程使用沙滤天然海水，一周换水2次。

(2)繁茂膜海绵的固定和基本培养条件：选取10块质量在2g左右的健康洁净的海绵组织，采用“十字法”用细线将海绵组织固定在玻璃培养皿的表面。将固定好的海绵放入12L的玻璃缸中，每个缸5块海绵，共两个缸。沙滤天然海水养殖，通过气泵充气，喂食金藻，自然光照条件，无阳光直射。一周换3次。

特点为：

繁茂膜海绵组织的选择标准：无异味、表面污泥少、海绵组织内部几乎不嵌入如石块的杂物，颜色鲜艳。

气泵的充气强度为1.5L air/L sea water/min。此充气强度能形成温和的水流，并能够给12L的海绵缸中的5块海绵组织提供充足的氧气。

每个玻璃缸每天喂食1ml的金藻藻液，藻液经冷冻干燥后，称量计算，折合成藻粉为0.03g左右。

(3)程序温度调控方法：从第0天开始，将温度设定为16℃，每两天上调1℃；至25℃，维持10天；之后每两天降1℃，一直降到16℃；之后每天降2℃，一直降到2℃。玻璃缸里放置加热棒，玻璃缸外是冷水循环系统。用温度计显示培养系统的水温。

特点为：

第一阶段为温度程序上升：从16℃开始。这个温度和海绵在自然条件下复苏期快结束时的温度相当。目的是唤醒海绵的生长潜力，促使它进入生长期。每两天上调1℃，因为海绵组织对外界的条件刺激本身会有一个适应的过程，所以，温度上升的速率不能太快。温度一直上升到25℃，这个温度基本达到大连夏天海水的最高温度。

第二阶段为最高温度的恒定：25℃，维持10天。这个温度使海绵保持在生长旺盛期，目的是使海绵快速大量地生长，并刺激海绵的胚胎成熟，希望海绵组织能在温度的刺激下释放幼虫。

第三阶段为温度程序下降：从25℃开始，每两天降1℃，一直降到16℃；使海绵组织从快速生长的阶段缓慢地过渡到生物量下降、组织萎缩期。从16℃开始，之后每天降2℃，一直降到2℃。使海绵组织从衰退期过渡到冬眠期，当温度下降到一定的程度后，海绵组织的生物量会保持在一个较低的水平。

(4)海绵组织取样和处理：

A、因为在整个海绵组织的培养过程中，需要测定生物量的变化，所以，第6n天(n＝0、1、2……)，这里采用的是湿重测量的方法。

具体为：将玻璃平皿连同海绵组织取出水面，用吸水纸擦净除组织外的其余部分水滴并清除附着的污物，并保证海绵组织表面无可滴落的水滴，在空气中放置大约5分钟的时间后，用电子天平进行称量。

B、因为在整个海绵组织的培养过程中，需要考察海绵组织形态的变化，所以，第6n天(n＝0、1、2……)，这里采用的是数码相机对海绵组织的外貌形态进行拍照。

C、因为在整个海绵组织的培养过程中，需要考察海绵组织内部结构变化。所以，第12n天(n＝0、1、2……)，这里采用的是制作组织切片的方法。

具体为：有选择性地从海绵个体上切下小块组织，放入用过滤海水配制的4％的甲醛中；再用氢氟酸脱去骨针后，送医院作组织切片。

结果：如图2-4所示

图2为温控系统培养下单位质量海绵比增长和培养温度的变化图：从图中可以看出海绵的生物量呈规律性变化，基本上是经由缓慢增长、快速增长、保持稳定、缓慢下降、快速下降、持稳定的顺序变化。在培养过程中取样可引起生物量变化的波动，但总体变化趋势不大，不影响海绵的正常生长，和海绵在大自然环境下的生物量的季节性变化规律相吻合。

图3为海绵组织在整个培养过程中的外貌形态变化图：从图中可以看出在整个培养过程中，海绵组织的形态发生了有规则的变化，基本上和大自然条件下一年四季的变化相符合。刚采集回来的海绵处于复苏期，表面有一层薄薄的黑色污泥，可以零星看到几个大小不一的出水孔。预养一周后，海绵的外表颜色变得干净，光亮，开始温控实验，定为第0天的海绵块；第6天，海绵块的周围已经能观察到向外铺展的细胞(箭形指示)，乳突开始变长(燕尾箭头指示)；第12天，海绵块的形态已经有了明显的变化，表面乳突变多，变长，变粗；一个新生的乳突(燕尾箭头指示)；海绵块的周边有大量的新生细胞铺展开来(箭形指示)。第12天取样，从海绵块上切除了一块(三角指示)。第18天，铺展的新生组织变得厚实，边缘变得光滑(箭形指示)；上次取样留下的伤口已经恢复得很好(三角指示)；乳突保持一定的长度和数量，变化不大。第24天，周围铺展的细胞开始减少，趋于萎缩。第30天，铺展的细胞基本萎缩消失，只剩下厚实的新生组织(箭形指示)。第36天，海绵块的主体组织慢慢消亡，表面部分黑色的组织掉落，出现一个小孔(虚圈指示)，新生组织还是保持者良好的状态，颜色鲜艳。第42天，原来的老组织基本上消亡殆尽，主要剩下的是新生组织和部分乳突，新生的组织部分出现细胞向外铺展(箭形指示)。第46天和第52天基本和第42天情况相似，新生的组织保持一定的生物量，减少的并不明显。第60天，可以看到海绵块基本上剩下的都是新生组织了，颜色虽然还是很鲜艳，但是组织的厚度明显下降，而且出现褶皱(箭形指示)，基本上是很薄的一层，剩下几个乳突。(比例尺＝500μm)

说明：第0、12、24、36、48、60天从海绵块取样用于相关实验总结，第0天到第6天，海绵组织处于复苏期，海绵组织在适应温控系统的环境后，开始慢慢地生长加快。第6天到第36天，海绵组织处于旺盛生长期，海绵快速增长。第36天到第54天，海绵组织处于生物量下降的衰退期。第60天，海绵的生物量基本上处于最低的水平，而且基本保持不变，处于休眠期。所以，从外观水平来看，繁茂膜海绵组织在人工构建的温控系统中，较好地吻合了大自然环境下的季节性的变化规律。

图4为海绵组织在整个培养过程中的石蜡切片图：从图中可以看出温控系统下培养的海绵组织水沟系和领细胞室发生了明显的变化。刚采集回来的海绵块，大部分的水沟系不是很发达(箭形指示)，领细胞室小，少(燕尾箭头指示)。第0天的海绵组织因为只是在室温的条件下暂养了一周，所以并没有留样，水沟系和领细胞室不会发生很大的变化。第12天，海绵的水沟变得发达了不少，变多(箭形指示)，领细胞室变大，变多(燕尾箭头指示)。第24天和第36天，水沟系变得很发达(箭形指示)，领细胞很大(燕尾箭头指示)而且多，说明海绵生理活动旺盛。第48天，大部分的水沟系收缩得很明显(箭形指示)，领细胞变小、数量减少(燕尾箭头指示)。第60天，水沟系收缩到一定程度，变化不是很明显(箭形指示)，领细胞很小，很少，很难观察到(燕尾箭头指示)。

(注：第36天的两张图的比例尺＝50μm，其余的图的比例尺＝100μm)。

海绵组织的应用：取上述实施培养20-30天，处于生长旺盛时期的海绵组织，参照专利200610047516.7，进行海绵硅质骨针的生产，其结果显示有大量的新生骨针产生。