繁茂膜海绵原细胞的鉴别、分离纯化和体外培养研究

摘要

海绵是一种重要的海洋药用无脊椎动物.海绵细胞体外培养是解决海绵药物供给不足问题最具希望和富有挑战性的课题.本研究旨在发展一种海绵干细胞体外培养方法,探索利用海绵干细胞体外培养建立海绵细胞系的可能性.论文以大连海域繁茂膜海绵的干细胞-原细胞为对象,研究了原细胞的鉴别、分离纯化及体外培养(增殖和分化)等问题. 首先,考察了繁茂膜海绵主要类型细胞在光、电镜下的形态结构特征.形成了在光镜下鉴别、计数原细胞的方法和标准.并应用BrdU摄取法和PCNA检测法,进一步证明了原细胞作为海绵干细胞所具有的增殖分裂潜力. 第二,建立了一种分离、纯化原细胞的新方法.利用原细胞与其它类型细胞的差异,形成了差速离心、选择性聚集、差速粘附和密度梯度离心四步集成分离方法.有效地实现了原细胞的富集,富集浓度达到了80﹪以上. 第三,比较了原细胞含量不同细胞体系的体外培养增殖特征.初步发现,原细胞具有活跃的增殖能力；高富集度原细胞体外原代培养过程中所显示的增殖和生物量增加能力,显著优于混合细胞和低浓度原细胞培养,首次实现了总细胞的倍增,显示了以原细胞为基础建立传代细胞系的可能性.高富集原细胞连续两次传代培养发现,由于原细胞的分化等原因,其增殖速率明显下降. 论文还研究了上皮和胶原细胞对原细胞分化的影响.初步发现,当该两种细胞与原细胞比例大于2:1混合培养时,所形成的细胞聚集体将分化成功能性小海绵.而高富集度原细胞培养,虽能发生一定分化,但不能发育成小海绵. 最后,本研究分离提取了造骨细胞特异性蛋白-硅聚合酶的抗体,并利用免疫组化方法来标记造骨细胞中的硅聚合酶,从而建立了一种原细胞分化终末细胞-造骨细胞的特异性标记方法.

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1海绵天然产物

1.2药源材料--海绵的获取方法

1.2.1方法一：捕捞野生海绵(Wild-Harvest of Sponges)

1.2.2方法二：海绵的水产养殖(Mariculture)

1.2.3方法三：海绵块的实验室养殖(Ex Situ Sponge Culture)

1.2.4方法四：活性化合物的化学合成及半合成(Chemical Synthesis and Semi-Synthesis)

1.2.5方法五：基因工程技术(Tansgenic production)

1.2.6方法六：微生物发酵(Microbial Fermentation)

1.2.7方法七：海绵细胞团与海绵细胞培养(Primmorph Sponge cell Culture)

1.3海绵细胞生物学研究概况

1.3.1海绵在动物界的位置

1.3.2成年海绵中主要的细胞类型

1.3.3海绵的生殖

1.4海绵细胞体外培养的生物学意义

1.5海绵细胞体外培养研究进展

1.5.1海绵细胞体外培养研究概况

1.5.2海绵细胞体外增殖培养条件的研究

1.6海绵全能干细胞--原细胞研究概况

1.6.1原细胞的生物学特性

1.6.2原细胞分化相关标志研究

1.6.3原细胞的分化及其调控研究

1.6.4原细胞分离纯化方法研究

1.6.5原细胞增殖和分化终末细胞凋亡间的调谐机制

1.6.6原细胞增殖及其潜力的检测方法研究

1.7海绵细胞体外培养的几个主要问题

1.7.1海绵细胞类型的准确鉴别

1.7.2海绵细胞体外培养对象的选择和分离纯化方法

1.7.3海绵细胞体外培养形式

1.7.4海绵细胞间相互作用研究

1.7.5海绵细胞专用培养基的研究

1.7.6海绵细胞与相关微生物的关系

1.7.7海绵胚胎和幼体的发育过程

1.8本课题研究思路

参考文献

第二章繁茂膜海绵原细胞的鉴别

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1海绵细胞形态鉴别

2.2.2海绵细胞增殖活性检测

2.3实验结果与讨论

2.3.1繁茂膜海绵组织结构特征

2.3.2不同类型海绵细胞光镜下特征

2.3.3不同类型海绵细胞电镜下特征

2.3.4海绵细胞摄取BrdU检测

2.3.5海绵细胞表达PCNA检测

2.4小结

参考文献

第三章繁茂膜海绵原细胞的分离纯化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1海绵组织离散--制备混合海绵细胞

3.2.2原细胞的富集

3.2.3原细胞的计数和活性检测

3.2.4 PCNA特异性标记原细胞方法的验证

3.3实验结果与讨论

3.3.1原细胞的富集

3.3.2原细胞含量和活性检测

3.3.3 PCNA标记原细胞方法的初步研究

3.4小结

参考文献

第四章繁茂膜海绵原细胞的体外培养研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1培养基的初筛

4.2.2原细胞含量不同体系的体外培养研究

4.2.3高富集原细胞体外培养及传代培养

4.2.4细胞生长动力学检测方法

4.3结果与讨论

4.3.1不同营养组合对海绵原细胞体外培养的影响

4.3.2细胞培养体系中原细胞含量对体外培养的影响

4.3.3高富集原细胞体外传代培养

4.4小结

参考文献

第五章海绵细胞聚集贴壁和原细胞分化的研究

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1繁茂膜海绵混合细胞、原细胞、上皮细胞和胶原细胞的制备

5.2.2繁茂膜海绵混合细胞和富集原细胞的聚集贴壁

5.2.3上皮细胞、胶原细胞对聚集贴壁的影响

5.2.4原细胞与PC细胞比例为1/2体系的分化过程研究

5.3结果与讨论

5.3.1混合细胞和富集原细胞的聚集

5.3.2上皮、胶原细胞对细胞聚集的影响

5.3.3原细胞与PC细胞比例为1/2聚集体系的分化过程

5.4小结

参考文献

第六章原细胞分化终末细胞--造骨细胞的特异性标记研究

6.1实验材料

6.2实验方法

6.2.1硅聚合酶的分离提取

6.2.2 SDS-PAGE电泳及免疫印记检测

6.2.3硅聚合酶抗体的制备

6.2.4间接酶联免疫吸附实验方法的建立及抗体效价检测

6.2.5竞争抑制性酶联免疫吸附实验方法的建立

6.2.6繁茂膜海绵硅聚合酶抗体与其他两种海绵硅聚合酶的交叉反应检测

6.2.7繁茂膜海绵细胞的制备及其体外培养

6.2.8免疫组化染色标记硅聚合酶和造骨细胞

6.3结果与讨论

6.3.1三种海绵的基本形态结构

6.3.2硅聚合酶的分离提取

6.3.3硅聚合酶的SDS-PAGE电泳及免疫印迹

6.3.4抗繁茂膜海绵硅聚合酶抗体效价的检测

6.3.5繁茂膜海绵硅聚合酶竞争抑制性检测方法的建立

6.3.6繁茂膜海绵硅聚合酶抗体与其他两种海绵硅聚合酶的交叉反应

6.3.7繁茂膜海绵造骨细胞的鉴别

6.4小结

参考文献

第七章结论与后续工作建议

本研究所用培养基和溶液的配制

海绵原细胞光镜下计数的SOP（Standard Operation Protocol）

作者简历和博士期间发表文章目录及专利

致谢