三聚氰胺结构类似物及其制备方法以及该方法中所用的中间体

摘要

本发明公开了一种三聚氰胺结构类似物及其制备方法以及该方法中所用的中间体。本发明所提供的三聚氰胺结构类似物的结构式如式I所示，中间体的结构式如式9所示。该三聚氰胺结构类似物可用于制备抗三聚氰胺的单克隆抗体。应用式I化合物制备的单克隆抗体，通过间接竞争ELISA方法，可以快速地检测乳制品中三聚氰胺，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测样品量大等优点。此外，与同类检测方法相比，本发明的方法中被检测的液态样品无需前处理，固态样品只需使用磷酸盐缓冲液做适量浓度溶解即可上样检测，操作简单，节省时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种三聚氰胺结构类似物及其制备方法以及该方法中所用的中间体。

背景技术

三聚氰胺(英文名：Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，性状为纯白色单斜棱晶体，无味。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，结构式如下：

三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。但是它被禁止用于食品和宠物饲料中，长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。

2007年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明：掺杂了≤6.6％三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。

目前，三聚氰胺检测已经被列入我国新食品检测标准，并制定三聚氰胺在乳与乳制品中的管理限量值。婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg；液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg；含乳15％以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。现有的检测方法有主要为高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法，这些检测方法涉及到使用大型精密仪器，需要专业人员操作，耗时较长，检测费用高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种三聚氰胺结构类似物及其制备方法。

本发明所提供的三聚氰胺结构类似物的结构式如式I所示：

所述式I化合物的制备方法，依次包括下述的步骤：

1)把4.52mmol NaH和5mL二甲醚加入25mL的两口瓶中，然后依次滴加含7.45mmol丙二腈的二甲醚溶液8mL和含3.77mmol式3所示化合物的二甲醚溶液2mL，然后反应混合液在室温和氮气保护下搅拌过夜；用5％NH₄Cl溶液中止反应，调pH至8，向反应液中加入乙酸乙酯，依次用水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na₂SO₄干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层层析得到式4所示的化合物；

2)把1.98mmol胍的盐酸盐，1.98mmol甲醇钠和5mL无水甲醇加入25mL圆底烧瓶中，反应混合液在氮气保护下搅拌0.5小时；过滤除去反应产生的氯化钠，滤液在减压条件下浓缩，然后逐滴加入含1.8mmol式4所示化合物的二甲基甲酰胺溶液5mL，把反应液加热到80℃在氮气保护下搅拌过夜；把反应液冷却至室温，用1M的盐酸溶液调pH至8，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到式5所示的化合物；

3)向20mL含0.363mmol式5所示化合物的四氢呋喃溶液中依次加入7.12mmol二碳酸二叔丁酯(Boc)₂O，7.83mmol三乙胺和0.712mmol 4-二甲氨基吡啶，反应液在室温和氮气保护下搅拌过夜；用质量含量5％NaHCO₃溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5％NaHCO₃溶液，水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na₂SO₄干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层析得到式6所示的化合物；

4)把0.363mmol式6所示化合物，10mL甲醇和0.0726mmol对甲苯磺酸加入25mL单口圆底烧瓶中，在室温和氮气保护下搅拌2小时；用质量含量5％NaHCO₃溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5％NaHCO₃溶液，水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na₂SO₄干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到式7所示的化合物；

5)向8mL含0.17mmol式7所示合物的二氯甲烷溶液中依次加入0.255mmol N-甲基吗啉-N-氧化物和0.017mmol过钌酸四内胺，反应液在室温下搅拌2小时；用硅胶柱过滤反应液得到式8所示的化合物；

6)把0.174mmol NaClO₂和0.174mmol NaH₂PO₄加入0.14mL水中，然后把上述溶液逐滴加入盛有0.134mmol式8所不的化合物，93μL 2-甲基-2-丁烯和2mL叔丁醇的圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜；向反应体系中加入水中止反应，用乙酸乙酯萃取反应液，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，得到式9所示的化合物；

其中，Boc基团代表叔丁酯；

7)把0.131mmol式9所示的化合物，9.4mL三氟乙酸和0.6mL苯甲醚加入50mL单口圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜；在减压条件下除去三氟乙酸和苯甲醚得到粗品，向粗品中加入乙醚，离心，抽去乙醚得到白色固体，向所述白色固体中重新加入乙醚，离心，重复三次得到式I所示的化合物。

其中，制备式I所示化合物的中间体：式9所示的化合物，也属于本发明的保护范围。

本发明的再一个目的是提供式I所示的化合物的应用。

本发明所提供的式I所示化合物的应用是其在制备抗三聚氰胺的单克隆抗体中的应用。

本发明基于免疫学中抗原与抗体特异性反应的原理，制备出了抗三聚氰胺的单克隆抗体，并应用其建立了一种特异性、快速、简单的检测三聚氰胺的方法。单克隆抗体：通过偶联剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐介导的缩合反应把三聚氰胺的类似物SM(用一个碳原子取代三聚氰胺的含氮杂环中的一个氮原子，并在此碳原子上连接一个带有羧基的侧链)偶联到载体蛋白(匙孔血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA)；用SM-KLH作为免疫抗原，取免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，HAT选择性培养基初步筛选出融合的杂交瘤细胞，间接竞争酶联免疫法筛选出阳性杂交瘤细胞3B11，有限稀释法对3B11细胞进行亚克隆化，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株；采用单层细胞培养法培养细胞株，获得培养上清中的单克隆抗体；也可采用体内诱导法制备细胞株分泌的腹水抗体，然后用Protein A蛋白亲和层析法纯化腹水，得到单克隆个抗体。检测三聚氰胺的方法(间接竞争ELISA)：SM-BSA作为包被抗原被固定在酶标板上；用含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液37℃封闭1小时；每孔分别加大系列浓度的三聚氰胺标准品和抗三聚氰胺抗体的工作液各50μL，37℃孵育0.5小时；每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体工作液，37℃孵育0.5小时；OPD显色系统显色；酶标仪在吸收波长490nm，读出A₄₉₀值；以三聚氰胺标准品浓度为x轴，抑制率(B/B₀值)y轴，绘制标准曲线；同样，用待测样品液代替三聚氰胺标准品溶液，进行间接竞争ELISA，根据标准曲线计算出样品中的三聚氰胺浓度。

应用本发明提供的单克隆抗体和方法，可以快速地检测乳制品中三聚氰胺，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测样品量大等优点。此外，与同类检测方法相比，本发明的方法中被检测的液态样品无需前处理，固态样品只需使用磷酸盐缓冲液做适量浓度溶解即可上样检测，操作简单，节省时间。本发明的单克隆抗体既可用于三聚氰胺的检测，也可用于制备检测三聚氰胺的试剂盒，具有重大的价值。

附图说明

图1为化合物SM的核磁共振氢谱图。

图2为化合物SM的核磁共振碳谱图。

图3为SM-KLH/BSA的结构图。

图4为质谱分析SM与BSA的偶联结果。

图5为SDS-PAGE分析Protein A亲和层析纯化腹水。

图6为单克隆抗体稀释滴度对A₄₉₀值的影响。

图7为SM-BSA浓度对三聚氰胺抑制率的影响。

图8为单克隆抗体与三聚氰胺类似物的交叉反应曲线。

图9为三聚氰胺抑制标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

三聚氰胺、三聚氰胺一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl，EDC)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant，CFA))、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)、石蜡油、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗鼠的IgG均购自sigma公司；HAT、HT、RPMI-1640培养液、胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素均购自Gibco公司；Hitraprprotein A FF column柱购自Amersham公司；6～8周龄的BALB/c纯系鼠购自北京兴隆实验动物中心；鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自ATCC，货号为CRL-1581。其它常规化学试剂均为国产分析纯。液态纯牛奶购自伊利实业集团股份有限公司；脱脂奶粉购自完达山乳业股份有限公司。

酶标仪680(BIO-RED)，二氧化碳培养箱371(themo)，生物安全柜(LABCONCO)倒置生物显微镜XDS-1B(重光)，电泳仪(BIO-RED)，垂直电泳槽(BIO-RED)，台式离心机5810R(eppendorf)，Autoflex II TOF/TOF质谱仪(Bruker Daltonics，北京生命科学研究所蛋白质中心)。

抑制率(B/B₀)＝[(A_490(x)-A₄₉₀₍₀₎)/(A_490(ctl)-A₄₉₀₍₀₎)]×100％；A_490(x)-有三聚氰胺(或有三聚氰胺类似物，或有待测样品)抑制的A₄₉₂值，A_490(ctl)-无三聚氰胺(或无三聚氰胺类似物，或无待测样品)抑制的A₄₉₀值，A₄₀₀₍₀₎-无抗体的空白对照的A₄₉₀值。

实施例1、三聚氰胺结构类似物(SM)的制备

SM的分子式如下：

一、化合物3的制备和表征

1、化合物3的制备

把2，3-二氢吡喃(化合物1)(0.56g，6.63mmol)，6-溴-1-己醇(1g，5.52mmol)和吡啶对甲基苯磺酸盐(0.28g，1.1mmol)溶解在15mL二氯甲烷(DCM)中，反应液在室温下搅拌23小时。用饱和NaHCO₃溶液和饱和食盐水洗涤反应液，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到无色油状液体化合物3(1.4g，收率为96％)。

2、化合物3的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ4.57(m，1H)，3.86(m，1H)，3.74(m，1H)，3.50(m，1H)，3.36-3.43(m，3H)，1.82-1.91(m，3H)，1.71(m，1H)，1.38-1.64(m，10H)。

二、化合物4的制备和表征

1、化合物4的制备

把NaH(规格：活性氢含量95％，银灰色颗粒含量60％)(0.18g，4.52mmol)和二甲醚(DME)(5mL)加入25mL的两口瓶中，然后依次滴加丙二腈(Malononitrile)(0.5g，7.45mmol)的DME(8mL)溶液和化合物3(1g，3.77mmol)的DME(2mL)溶液，然后反应混合液在室温和氮气保护下搅拌过夜。用5％NH₄Cl溶液中止反应，调pH至8，向反应液中加入乙酸乙酯，依次用水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层层析得到无色油状液体化合物4(0.6g，收率为63.8％)。

2、化合物4的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ4.56(m，1H)，3.71-3.86(m，3H)，3.37-3.52(m，2H)，2.01-2.07(m，2H)，1.43-1.82(m，14H)。

三、化合物5的制备和表征

1、化合物5的制备

把胍的盐酸盐(0.19g，1.98mmol)，甲醇钠(0.38mL，1.98mmol，含量28％)和5mL无水甲醇加入25mL圆底烧瓶中，反应混合液在氮气保护下搅拌0.5小时。过滤除去反应产生的氯化钠，滤液在减压条件下浓缩，然后逐滴加入化合物4(0.45g，1.8mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)(5mL)溶液，把反应液加热到80℃在氮气保护下搅拌过夜。把反应液冷却至室温，用1M的盐酸溶液调pH至8，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到黄色固体化合物5(0.54g，97％)。

2、化合物5的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ4.56(m，1H)，3.87(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，1H)，3.38(m，1H)，2.19-2.31(m，2H)，1.36-1.71(m，14H)。

四、化合物6的制备和表征

1、化合物6的制备

向化合物5(0.33g，0.363mmol)的四氢呋喃(THF)(20mL)溶液中依次加入二碳酸二叔丁酯(Boc)₂O(1.55g，7.12mmol)，三乙胺(TEA)(1.09mL，7.83mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(87mg，0.712mmol)。反应液在室温和氮气保护下搅拌过夜。用质量含量5％NaHCO₃溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5％NaHCO₃溶液，水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层析得到化合物6(0.38g，58.5％)。

2、化合物6的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ4.57(t，J＝4Hz，1H)，3.86(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，1H)，3.38(m，1H)，2.29-2.46(m，2H)，1.22-1.59(m，68H)。

五、化合物7的制备和表征

1、化合物7的制备

把化合物6(0.33g，0.363mmol)，甲醇(10mL)和对甲苯磺酸(pTsOH)(0.013g，0.0726mmol)加入25mL单口圆底烧瓶中，在室温和氮气保护下搅拌2小时。用质量含量5％NaHCO₃溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5％NaHCO₃溶液，水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到化合物7(0.25g，83％)。

2、化合物7的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ3.65(m，2H)，2.33-2.45(m，2H)，1.22-1.60(m，62H)。

六、化合物8的制备和表征

1、化合物8的制备

向化合物7(140mg，0.17mmol)的二氯甲烷(DCM)(8mL)溶液中依次加入N-甲基吗啉-N-氧化物(NMO)(34.4mg，0.255mmol)和过钌酸四内胺(TPAP)(6.1mg，0.017mmol)，反应液在室温下搅拌2小时。用一根短硅胶柱过滤反应液得到无色油状液体化合物8(0.12g，83.5％)。

2、化合物8的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ9.77(s，1H)，2.43-2.45(m，4H)，1.39-1.63(m，60H)。

七、化合物9的制备和表征

1、化合物9的制备

把NaClO₂(19.6mg，纯度80％，0.174mmol)和NaH₂PO₄(20.9mg，0.174mmol)加入0.14mL水中，然后把这种配制好的溶液逐滴加入盛有化合物8(0.11g，0.134mmol)，93μL 2-甲基-2-丁烯和2mL叔丁醇的圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜。向反应体系中加入水中止反应，用乙酸乙酯萃取反应液，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，所得粗品不经纯化直接用于下一步反应。

2、化合物9的表征

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ2.44(t，J＝8Hz，2H)，2.35(t，J＝7.6Hz，2H)，1.24-1.66(m，60H)。

八、化合物10的制备和表征

1、化合物10的制备

把化合物9(0.11g，0.131mmol)，9.4mL三氟乙酸(TFA)和0.6mL苯甲醚加入50mL单口圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜。在减压条件下除去三氟乙酸和苯甲醚得到粗品，向粗品中加入乙醚，离心，抽去乙醚得到白色固体，向这种白色固体中重新加入乙醚，离心，重复三次得到化合物10(0.021g，66％(两步总产率))。

2、化合物10的表征

¹HNMR(D₂O，400MHz)δ2.38(t，J＝7.6Hz，2H)，2.35(t，J＝6.8Hz，2H)，1.47-1.63(m，2H)，1.34-1.47(m，4H)。化合物10的氢谱图见图1。

¹³CNMR(D₂O，100MHz)δ179.5，157.8，153.0，86.2，34.1，28.2，26.5，24.7，22.3ppm.化合物10的碳谱图见图2。

由表征数据可知化合物10即为三聚氰胺结构类似物(SM)。

实施例2、抗原的制备

抗原：SM-BSA(SM-KLH)偶联反应物的示意图见图3。

一、SM-BSA(包被抗原)的制备

称取5mg SM和20mg BSA，充分溶解于5ml盐酸酸化的去离子水(pH4.7)中，向混合溶液中加入46mg EDC，4℃搅拌下反应过夜；反应产物4℃透析过夜，外透液为0.01M PBS缓冲溶液(pH7.0)；分别取相同浓度(2mg/mL)的BSA和SM-BSA进行质谱分析，鉴定偶联结果。

质谱检测结果见图4。BSA分子量为66.32KD。SM-BSA的平均分子量为70.57KD，与BSA相比增加了4.25KD。SM的分子量为221D，SM-BSA的形成是通过EDC将SM侧链上的羧基与BSA表面的赖氨酸上游离的氨基脱水形成酰胺健，所以BSA分子每偶联上一个SM分子，分子量就增加203D(221D(SM)-18D(H₂O))。质谱分析结果表明，平均每个BSA分子偶联20个SM分子(4.25KD/203D＝20)。

二、SM-KLH(免疫抗原)的制备

用KLH代替BSA，其它方法同步骤一。

实施例3、单克隆抗体的制备

1、取5只6～8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠皮下注射20μg弗氏完全佐剂乳化的SM-KLH(初次免疫)。

2、每隔15天皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的同剂量的SM-KLH(加强免疫)。

3、第4次免疫10天后眼眶采血，间接ELISA检测抗血清效价，间接竞争ELISA检测抗体相对三聚氰胺的特异性。

5只小鼠抗血清效价均为1∶72000。1^#、2^#、3^#小鼠的抗血清较其它2只小鼠的抗血清更能特异地识别三聚氰胺；加入同等剂量三聚氰胺的情况下，3^#小鼠的抗血清的B/B₀值更小，即抑制现象更明显。

4、取抗血清效价较高并且特异性较好的小鼠(3^#小鼠)在细胞融合前3天进行最后一次加强免疫(腹腔注射20μg SM-KLH)。

二、细胞融合

1、准备工作

①于细胞融合前1天取6～8周龄的BALB/c小鼠拉颈处死，分离腹腔细胞作为饲养细胞，制成HAT的细胞悬液(细胞密度2×10⁵个/mL)加入96孔板，37℃CO₂培养箱培养，备用。

②于细胞融合前两周复苏SP2/0细胞，调整细胞状态至最佳，备用。

③步骤一的4中的3^#小鼠，最后一次加强免疫3天后取脾脏，制备脾细胞悬液，使用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，计数，备用。

2、细胞融合

淋巴细胞与SP2/0细胞按10∶1的数量比混合，滴加1mL 50％PEG融合，离心后加入50mL HAT培养液，接种到含有饲养细胞的96孔培养板内，37℃CO₂培养箱培养；观察细胞的生长情况，确认非杂交细胞死亡后，改用完全RPMI-1640培养液培养。

融合后的细胞共接种6块96孔细胞培养板，HAT选择培养基筛选后，进行显微镜观察，细胞融合率为100％。

三、杂交瘤细胞筛选

1、间接ELISA

用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4℃过夜；洗板4次；含10％FBS的封闭液封闭，37℃温育2h；洗板4次；加入待测杂交瘤细胞培养上清液(以SP2/0细胞的上清液作为阴性对照；以含10％FBS封闭液作为空白对照；37℃温育0.5h；洗板4次；加入HRP标记的羊抗鼠的IgG，37℃温育1h；洗板4次；加入OPD显色液，酶标仪测A₄₉₀值。检测结果以A₄₉₀；(A_样品-A_空白)/(A_阴性对照-A_空白)≥2.1为阳性。

间接ELISA检测结果表明，能够识别SM-BSA的杂交瘤细胞株共10株：1B11、2E10、3A2、3B1、3B3、3B11、4F9、5F3、5H7、6D3。

2、间接竞争ELISA

将步骤1中10株阳性细胞进行如下检测：用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4℃过夜；洗板4次；用含10％FBS的封闭液封闭，37℃温育2h；洗板4次；每孔加入待测杂交瘤细胞培养上清液和浓度为1μg/ml的游离三聚氰胺各50μL(对照孔用等体积的PBS代替三聚氰胺溶液)，37℃温育0.5h；洗板4次；加入HRP标记的羊抗鼠的IgG，37℃温育1h；洗板4次；加入OPD显色液，酶标仪测A₄₉₀值。如果试验孔的A₄₉₀值比对照孔的A₄₉₀值小，表明加入到该孔内的杂交瘤细胞培养上清液中含有抗三聚氰胺的特异性抗体。

间接竞争ELISA结果表明，只有3B11细胞株分泌的单克隆抗体在加入游离的三聚氰胺时有抑制反应，即能够特异性识别三聚氰胺。

四、杂交瘤细胞的克隆化和冻存

将3B11杂交瘤细胞吹散，取0.1mL的细胞悬液加入含0.9mL HAT培养液的24孔板的第1个孔，混匀后加入第2孔，同法稀释第3、4孔；对第1孔进行记数，计算后从相应的孔中取100个细胞，加入10mL的完全RPMI-1640培养液；接种含小鼠巨噬细胞的96孔板，0.1mL/孔，37℃CO₂培养箱培养；第8～9d时，应用间接ELISA进行抗体检测，克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养。

最后获得稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11，该细胞株已于2009年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No.3237。

稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11扩大培养后离心收集，用冻存液(70％小牛血清，20％不完全培养液，10％DMSO)将细胞悬浮，移入冻存管内，-70℃保存。

五、单克隆抗体的制备

1、体外直接培养

将三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11进行扩大培养，所用的培养基为RPMI-1640培养基添加10％的胎牛血清，置于37℃和5％CO₂孵箱中培养，待细胞浓度大于10⁵/ml时停止换液，持续孵育至细胞全部死亡。收集培养上清液，1500-2000×g，离心10分钟，上清液含有高水平的单克隆抗体(体外培养单克隆抗体)，-20℃保存备用。

2、体内诱导

每只小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，1周后每只小鼠腹腔注射1×10⁶个3B11杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显膨大到一定程度时，用9号针头抽取腹水，反复收集数次；腹水经13,000r/min离心15min后，取上清分装，置-20℃冰箱保存备用。

用20mm的PBS(pH7.0)对腹水进行2倍稀释，再用0.45μm孔径的过滤器过滤，滤出液逐滴加入已经平衡的Hitrap rprotein A FF柱内，5倍柱体积的20Mm的PBS(pH7.0)洗涤后，用0.1M的柠檬酸钠(pH3.0)溶液进行洗脱，分管收集洗脱液并用碳酸盐缓冲液(pH9.0)调节pH至中性，得到纯化的单克隆抗体(体内培养单克隆抗体)。

纯化单克隆抗体的纯度用SDS-PAGE进行鉴定。SDS-PAGE结果(见图5)表明，纯化后的抗体已经达到电泳纯。

实施例4、间接ELISA测定单克隆抗体的效价

一、体外培养单克隆抗体的效价测定

1、用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4℃放置过夜；每孔用含0.05％Tween20的磷酸盐洗涤缓冲液(PBST)注满，放置5min，连续洗涤4次；

2、每孔加入100μL封闭液(含有10％小牛血清的PBST)，37℃温育2h；洗涤4次；

3、用抗体稀释液将体外培养单克隆抗体进行梯度稀释，分别加入酶标板的不同孔(每孔加入100μL)，以细胞培养液为阴性对照，抗体稀释液为空白对照，每个处理设置两个复孔；37℃放置1h；洗涤4次；

4、加入按1∶5000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃放置1h；洗涤4次；

5、每孔加入OPD显色液100μL，室温闭光放置显色(可根据每孔的颜色变化决定显色时间)；

6、每孔加入100μL 2mol/L硫酸终止反应；

7、酶标仪在吸收波长490nm，读出A₄₉₀值；取2孔的平均值。效价以抗血清的稀释度表示，检测结果以A₄₉₀；(A_样品-A_空白)/(A_阴性对照-A_空白)≥2.1为阳性，以阳性孔相应的最高稀释倍数为效价。

体外培养单克隆抗体的效价为1∶250。

二、体内培养单克隆抗体的效价测定

用体内培养单克隆抗体代替体外培养单克隆抗体，阴性对照为同种方法制备的Sp2/0细胞的BALB/c小鼠腹水，空白对照为抗体稀释液。其它同步骤一。

体外培养单克隆抗体的效价为1∶80,000。

实施例5、最佳抗原抗体反应浓度的确定

一、试剂配制

包被液：15.9g无水碳酸钠(Na₂CO₃)，2.93g碳酸氢钠(NaHCO₃)，调整pH至9.6，加双蒸水定容至1000mL；

洗涤缓冲液(PBST)：0.2g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，2.9g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，8g氯化钠(NaCL)，0.2g氯化钾(KCL)，500mL Tween20，调整pH至7.2，加双蒸水定容至1000mL；

封闭液：含有10％小牛血清的洗涤缓冲液；

样品稀释液(PBST)：同洗涤缓冲液；

显色液：A液：19.2g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，加双蒸水定容至1000mL；B液：71.7g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，加双蒸水定容至1000mL；使用前取4.86mL A液，5.14mL B液，4.00mg邻苯二胺(OPD)，15mL 30％过氧化氢(H₂O₂)；

终止液：2mol/L硫酸(H₂SO₄)。

二、应用棋盘滴定法进行最佳抗原抗体反应浓度的确定

1、包被抗原为SM-BSA，包被浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；洗板4次；

2、用含10％FBS的封闭液封闭，37℃温育2h；洗板4次；

3、用样品稀释液将体外培养单克隆抗体分别进行10、20、100、200倍稀释，每孔加入50μL，同时每孔再加入50μL三聚氰胺溶液(1μg/μL)或PBST，37℃温育0.5h，洗涤；

4、加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1∶5000)，37℃温育1h，洗涤；

5、加OPD底物显色，加终止液终止反应后，读取A₄₉₀值；以上操作同时做两块酶标板的平行实验，A₄₉₀值取两板相对应的平行孔的平均值。

①以包被抗原的浓度为横坐标，以无三聚氰胺竞争情况下孵育不同稀释度抗体时的A₄₉₀值为纵坐标，绘制标准曲线，分析最适的抗体工作量，结果见图6和表1。

表1抗体滴度对A₄₉₀值的影响

结果表明，当包被抗原浓度从0.2μg/mL变化到5μg/mL，单克隆抗体按1∶10倍稀释时所得到的A₄₉₀值始终接近1.0，故单克隆抗体的最适稀释滴度(稀释度)为1∶10。

②计算B/B₀值，以包被抗原浓度为横坐标，以B/B₀值为纵坐标，绘制标准曲线，分析包被抗原的最适工作浓度，结果见图7和表2。

表2SM-BSA包被抗原浓度对三聚氰胺抑制率的影响

结果表明，无论对抗体进行多少倍稀释，包被抗原SM-BSA的浓度为0.2μg/mL，B/B₀值始终最小，即游离三聚氰胺的抑制现象最明显，故包被抗原SM-BSA的最适浓度是0.2μg/mL。

实施例6、单克隆抗体的交叉反应试验

1、用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4℃过夜；洗板4次；

2、用含10％FBS的封闭液封闭，37℃温育2h；洗板4次；

3、每孔分别加入不同浓度梯度的三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺或三聚氰胺二酰胺50μL(对照孔加入等量的PBS)，再加入最适抗体工作液50μL(稀释度为1∶10的体外培养单克隆抗体)，37℃温育0.5h；洗板4次；

4、加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1∶5000)，37℃温育1h；用洗涤缓冲液连续洗涤4次；

5、加入OPD显色液(根据每孔的颜色变化决定显色时间)；

6、每孔加入50μL 2mol/L硫酸，终止反应；

7、酶标仪测A₄₉₀值。

计算IC₅₀和交叉反应率(CR％)。IC₅₀为最大A₄₉₀值降低到50％时对应的竞争反应物的浓度；CR％＝(三聚氰胺的IC₅₀/类似物IC₅₀)×100％。结果见表3。

表33B11单克隆抗体与不同竞争反应物的IC₅₀和CR％

B/B₀值见图8。三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺作为竞争反应物，B/B₀值基本接近1.0，表明单克隆抗体对这三种结构类似物不识别。

实施例7、应用单克隆抗体通过竞争ELISA检测三聚氰胺

一、试剂配制

包被液：15.9g无水碳酸钠(Na₂CO₃)，2.93g碳酸氢钠(NaHCO₃)，调整pH至9.6，加双蒸水定容至1000mL；

洗涤缓冲液(PBST)：0.2g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，2.9g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，8g氯化钠(NaCL)，0.2g氯化钾(KCL)，500mL Tween20，调整pH至7.2，加双蒸水定容至1000mL；

封闭液：含有10％小牛血清的洗涤缓冲液；

样品稀释液(PBST)：同洗涤缓冲液；

显色液：A液：19.2g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，加双蒸水定容至1000mL；B液：71.7g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，加双蒸水定容至1000mL；使用前取4.86mL A液，5.14mL B液，4.00mg OPD，15mL 30％过氧化氢(H₂O₂)；

终止液：2mol/L硫酸(H₂SO₄)。

二、通过竞争ELISA检测三聚氰胺

1、包被

SM-BSA包被酶标板(包被抗原浓度为0.2μg/mL)，100μL/孔，4℃过夜；

2、洗涤

每孔注入200μL洗涤缓冲液，放置5min，连续洗涤4次；

3、封闭

每孔加入100μL封闭液，37℃温育2h，连续洗涤4次；

4、竞争反应

取三聚氰胺标准品，添加到液态奶中，得到三聚氰胺浓度为240μg/mL的溶液A1；用样品稀释液梯度稀释溶液A1。用样品稀释液溶解奶粉得到奶粉质量百分含量为20％的溶液B0，取三聚氰胺标准品，添加到溶液B0中，得到三聚氰胺浓度为240μg/mL的溶液B1；用样品稀释液梯度稀释溶液B1。取三聚氰胺标准品，添加到样品稀释液中，得到三聚氰胺浓度为240μg/mL的溶液C1；用样品稀释液梯度稀释溶液C1。

分别以三种样本(A1、B1和C1)及其梯度稀释液中的三聚氰胺与包被抗原SM-BSA去竞争抗体，50μL/孔，每个样本的每个体系中三聚氰胺的终浓度分别为120、30、3、0.3、0.03、0.003、0μg/mL，同时每孔再加入50μL最佳稀释滴度的抗体工作液(稀释度为1∶10的体外培养单克隆抗体)，每个样品做2个重复孔，37℃温育0.5h，连续洗涤4次；

5、加入II抗

HRP标记的羊抗鼠的IgG(1∶5000)，37℃温育1h，温育1h，连续洗涤4次；

6、显色

显色前3～5min内配制好显色液，每孔100μL，室温闭光放置显色(可根据每孔的颜色变化决定显色时间)；

7、终止

每孔加入100μL 2mol/L硫酸；

8、读值

酶标仪在吸收波长490nm，读出A₄₉₀值。

9、绘制标准曲线

计算B/B₀值，以包被抗原浓度为横坐标，以B/B₀值为纵坐标，绘制标准曲线。

检测结果如图9所示，液态奶、奶粉和标准样品稀释液三个体系中的三聚氰胺对包被抗原SM-BSA与抗体的结合都产生抑制作用，并且三个体系中三聚氰胺的最低检测量均在0.3μg/mL～0.03μg/mL之间。

结果表明，本发明的方法可灵敏地检测到三聚氰胺。