采用组合疗法的眼病和过度血管新生的治疗

摘要

本发明关于通过涉及给予细胞和中断VEGF-信号传导的化合物的组合疗法治疗或预防眼病以及与血管发生有关疾病的方法。

说明书

技术领域

本发明关于通过涉及给予细胞和中断VEGF-信号传导(signalling)的化合物的组合疗法来治疗或预防眼病，以及与血管发生相关的疾病的方法。

背景技术

血管发生

血管发生(或血管新生，新血管形成)是新血管的形成和分化。在健康的成年人或成熟组织中一般不存在。然而，在复原伤口和恢复受伤或损伤之后的组织血流的健康身体内则会出现血管发生。在女性中，血管发生也出现在每月的生殖周期和怀孕期间。在这些过程中，新血管的形成是受到严格控制的。

血管发生与疾病

在许多严重疾病状态下，身体失去了对血管发生的控制。在很多疾病中都会出现过度血管发生，如癌症、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、关节炎和牛皮癣。在这些病症之中，新血管为患病组织输送营养，破坏正常组织，并且在癌症的情况下，新血管使得肿瘤细胞能够逃逸进入循环系统中并定植于其他器官中(肿瘤转移)。

肿瘤生长是血管发生依赖性的假说首次于1971年提出(Folkman，1971)。按照其最简单的表述，该假说提出，超过一定阶段的肿瘤体积膨胀需要新的毛细血管诱导分化。例如，除非通过高功率显微镜对组织切片进行检测，否则在小鼠的早期血管前阶段中不能检测到肺部微小转移。支持肿瘤形成是血管发生依赖性这一观点的其他间接证据能够在美国专利5,639,725、5,629,327、5,792,845、5,733,876和5,854,205中找到。

为了模拟血管发生，肿瘤上调其各种血管发生因子的产生，包括成纤维细胞生长因子(αFGF和βFGF)(Kandel et al.，1991)和血管内皮细胞生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)和HGF。然而，许多恶性肿瘤也产生血管发生的抑制剂，包括血管生成抑制因子蛋白和凝血酶敏感蛋白(Chen et al.，1995；Good et al.，1990；O′Reilly et al.，1994)。假设血管原性表型是新生血管形成的这些正负调节剂之间净平衡的结果(Good etal.，1990；O′Reilly et al.，1994)。已经鉴别出了几种其他内源性血管发生抑制剂，但是并非所有的内源性血管发生抑制剂都与肿瘤存在相关。它们包括，血小板因子4(Gupta et al.，1995；Maione et al.，1990)、干扰素-α、干扰素诱导蛋白10(Angiolillo et al.，1995；Strieter et al.，1995)，其是由白细胞介素-12和/或干扰素-γ(Voest et al.，1995)、gro-β(Cao et al.，1995)和泌乳刺激素的16kDa N-端片段(Clapp et al.，1993)诱导的。

眼病

由眼中组织或结构功能障碍所致的许多眼部疾病或病症会导致视力下降或完全丧失视力。近来眼科疾病越来越多，包括由于电视、计算机、游戏机和其他数码产品，以及隐形眼镜的广泛使用导致的疾病，如干眼和视疲劳。

在这些眼科疾病中，年龄相关性黄斑变性(AMD)在西方社会的老年人群中尤其流行。在美国、加拿大、英格兰、威尔士、苏格兰和澳大利亚，AMD是年龄超过65的患者中法定的不可逆失明的最常见的病因。尽管患者的第一只眼睛的中心视力丧失时他们的平均年龄为约65岁，但一些患者在四十几或五十几岁时就开始发展疾病征兆。由于现代生活方式和预期寿命增加，受到这种疾病侵扰的人数稳步增加。

眼中新血管形成是严重眼部疾病如AMD和糖尿病性视网膜病变的基础。约10％～15％的患者会表现出这种疾病的渗出性(湿)形式。渗出性AMD的特征在于血管发生和病理性新生血管的形成。这种疾病与每年在对侧眼中发展失明障碍约10％～15％的累积机率是双向的。

糖尿病性视网膜病变是约40％～45％被诊断患有I型或II型糖尿病的的患者中出现的糖尿病的并发症。糖尿病性视网膜病变通常影响双眼并以四个阶段发展。第一阶段，轻度非增殖性视网膜病变，特征在于眼中微血管瘤。在视网膜的毛细血管和小血管中出现小面积的肿胀。在第二阶段，中度非增殖性视网膜病变，供给视网膜的血管开始堵塞。在第三阶段，出现重度非增殖性视网膜病变，受阻的血管导致视网膜的供血减少，并且视网膜向眼睛发出信号以发展新的血管(血管发生)从而为视网膜供血。在第四阶段即最高级的阶段，发生增殖性视网膜病变，发生血管发生，但是新血管是异常且脆弱的，并沿着视网膜和填充眼睛的玻璃体凝胶的表面生长。当这些薄血管破裂或渗漏血液时，就能够导致严重的视力丧失或失明。

贝伐单抗是一种用于治疗AMD的化合物，然而该疗法的副作用在视网膜脱离中增加(Chan et al.，2007；Kook et al.，2008；Garg et al.，2008)。

随着年龄的增加，玻璃体液从凝胶变成液体并且随着这种变化逐渐萎缩并从视网膜的ILM脱离。这个过程被称为“玻璃体后脱离”(PVD)，其在40岁之后出现是正常的。然而，玻璃体中的退化性变化也可以是由病理性病症所诱导，如糖尿病、伊尔斯氏病(视网膜静脉周围炎，Eale’sdisease)和葡萄膜炎。而且，PVD会比近视人群和那些接受过白内障手术的人中的正常情况出现得更早。通常，玻璃体与视网膜完全脱离。然而，玻璃体偶尔会在某些地方紧密连接于视网膜。这些小的抗病灶(foci ofresisting)，玻璃体的异常强力连接能够在连接位置从玻璃体向视网膜传输较大的牵引力。由玻璃体产生的这种持续的牵引感通常会导致视网膜中产生马蹄形撕裂。如果视网膜撕裂没有得到修复，玻璃体液体就会通过该撕裂处渗透到视网膜中或视网膜之下并导致视网膜脱离，视网膜脱离是一种非常严重的威胁视力的病症。另外，玻璃体和ILM之间的持续连接能够导致血管破裂出血，这会导致玻璃体混浊(clouding)和浑浊(opacification)。

不完全的PVD的发展对于包括玻璃体黄斑牵引综合征、玻璃体积血、黄斑裂孔、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑病变和视网膜脱离的许多玻璃体视网膜病都会产生影响。

仍需要能够用于治疗或预防眼病和/或血管发生相关的病症的其他疗法。

发明内容

本发明人已经出人意料地发现，当利用包含细胞和中断VEGF-信号传导的化合物的组合疗法来治疗或预防眼病时具有协同作用。因此，在第一方面，本发明提供了一种治疗或预防受治疗者中眼病的方法，该方法包括向受治疗者给予i)细胞、和ii)中断血管内皮生长因子(VEGF)-信号传导的化合物。

采用本发明的方法能够治疗或预防的眼病的实例包括，但不限于，视网膜缺血、视网膜炎症、视网膜水肿、视网膜脱离、黄斑裂孔、牵引性视网膜病变、玻璃体积血、牵引性黄斑病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生和/或虹膜潮红(rubeosis)。在一种优选的实施方式中，眼病是视网膜脱离、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变和/或黄斑变性。

在一种实施方式中，黄斑变性是干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。优选黄斑变性是湿性年龄相关性黄斑变性。

之前，本申请的申请人已经提出，干细胞，或其后代细胞，能够用于治疗或预防血管发生-相关的病症(参见WO 2008/006168)。他们也已经出人意料地发现，当使用包含细胞和中断VEGF-信号传导的化合物的组合疗法来治疗或预防血管发生-相关的病症时具有协同作用。因此在第二方面，本发明提供了一种治疗或预防受治疗者中与血管发生相关的疾病的方法，该方法包括向所述受治疗者给予i)细胞、和ii)中断血管内皮生长因子(VEGF)-信号传导的化合物。

采用本发明的方法能够治疗或预防的与血管发生相关的疾病的实例包括但不限于，血管发生依赖性的癌症、良性肿瘤、类风湿性关节炎、牛皮癣、眼部血管发生病、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Webber Syndrome)、心肌血管发生、斑块内血管新生(plaque neovascularization)、毛细血管扩张、血友病性关节病(hemophiliac joints)、血管纤维瘤、伤口肉芽形成、肠粘连、动脉粥样硬化、硬皮病、肥厚性瘢痕、猫抓病和幽门螺杆菌致溃疡。

在一种实施方式中，细胞是干细胞，或其后代细胞。在一种优选的实施方式中，干细胞获自骨髓或眼睛。

优选地，干细胞是间质前体细胞(MPC)。优选地，间质前体细胞是TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CDl46⁺、3G5⁺或它们的任意组合。在另一种实施方式中，至少一些STRO-1⁺细胞是STRO-1^bri。

在另一种实施方式中，还没有对MPC进行扩大培养，其是TNAP⁺。

在一种优选的实施方式中，后代细胞通过体外培养MPC而获得。

在一种实施方式中，该化合物结合血管内皮生长因子和/或降低其生产。优选地，血管内皮生长因子是VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C和/或VEGF-D。更优选地，血管内皮生长因子是VEGF-A。

在一种实施方式中，该减少血管内皮生长因子产生的化合物结合缺氧诱导因子1(HIF-I)和/或降低其生产。

在一种可替代的实施方式中，该化合物结合血管内皮生长因子受体和/或降低其生产。优选地，血管内皮生长因子受体选自VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3。更优选地，血管内皮生长因子受体是VEGFR1和/或VEGFR2。

在还有的另一种替代实施方式中，该化合物结合参与通过血管内皮生长因子与血管内皮生长因子受体(如VEGFR酪氨酸激酶)结合而诱导的胞内信号传导的分子和/或降低其生产。

在一种实施方式中，该化合物是多肽。更优选地，该多肽是抗体、抗体相关的分子、和/或它们中的任一种的片段。

在另一实施方式中，该化合物是多核苷酸。实例包括但不限于，反义多核苷酸、正义多核苷酸(有义多核苷酸，sense polynucleotide)、催化多核苷酸、双链体RNA分子、或编码其中的任一种或多种的多核苷酸。

在一种实施方式中，至少一些细胞经过遗传修饰。

本发明还提供了细胞和中断VEGF-信号传导的化合物在制造用于治疗或预防受治疗者中眼病的组合疗法的药物中的用途。

另外，本发明还提供了细胞和中断VEGF-信号传导的化合物作为用于治疗或预防受治疗者中眼病的组合疗法中的药物的用途。

本发明还提供了细胞和中断VEGF-信号传导的化合物细胞和中断VEGF-信号传导的化合物在制造用于治疗或预防受治疗者中与血管发生相关的病症的组合疗法的药物中的用途。

另外，本发明还提供了细胞和中断VEGF-信号传导的化合物细胞和中断VEGF-信号传导的化合物作为用于治疗或预防受治疗者中与血管发生相关的病症的组合疗法中的药物的用途。

在另一方面，本发明提供了一种包含细胞和中断VEGF-信号传导的化合物以及可选的药用载体的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种包含细胞和中断VEGF-信号传导的化合物的试剂盒。该细胞和化合物可以在相同或不同的容器中。

显然，本发明一方面的优选性质和特征可适用于本发明的许多其他方面。

在说明书全文中，词语“包含”或其变体如“包括”或“含有”应被理解为意指包括所述的元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组，但并不排除任何其他元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组。

附图说明

图1.研究设计。

图2.异源MPC在减少血管渗漏方面等价于抗-VEGF，且与抗-VEGF有协同效应。

图3.将异源MPC与抗-VEGF组合消除了严重渗漏的血管。

图4.将异源MPC与抗-VEGF组合对高级别渗漏血管的协同益处。

图5.通过异源MPC和抗-VEGF的组合持续预防阶段4疾病，而通过单独的抗-VEGF仅仅是短效的。

图6.异源MPC与抗-VEGF的组合在阶段1疾病中维持较高比例的激光受损血管。

图7.异源MPC与抗-VEGF的组合预防视网膜脱离。

图8.异源MPC与抗-VEGF的组合预防激光诱导的血管新生(或称新血管形成)之后的视网膜脱离。

关键序列表

SEQ ID NO：1-人VEGF-A(活化处理的肽)。

SEQ ID NO：2-人VEGF-B(活化处理的肽)。

SEQ ID NO：3-人VEGF-C(活化处理的肽)。

SEQ ID NO：4-人VEGF-D(活化处理的肽)。

SEQ ID NO：5-人VEGFR-1(-信号序列)。

SEQ ID NO：6-人VEGFR-2(-信号序列)。

SEQ ID NO：7-人VEGFR-3(-信号序列)。

SEQ ID NO：8-人HIF-1α。

SEQ ID NO：9-全长人VEGF-A的编码序列。

SEQ ID NO：10-全长人VEGF-B的编码序列。

SEQ ID NO：11-全长人VEGF-C的编码序列。

SEQ ID NO：12-全长人VEGF-D的编码序列。

SEQ ID NO：13-全长人VEGFR-1的编码序列。

SEQ ID NO：14-全长人VEGFR-2的编码序列。

SEQ ID NO：15-全长人VEGFR-3的编码序列。

SEQ ID NO：16-人HIF-1α的编码序列。

具体实施方式

通用技术

除非另外明确指出，本文中所使用的所有的技术和科学术语都应该采用其在本领域(例如，在干细胞生物学中、细胞培养学、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通所理解的相同意义。

除非另外明确指出，在本发明中所使用的重组蛋白、细胞培养(物)和免疫技术都是本领域技术人员公知的标准方法。这些技术在以下来源的文献中有描述和解释，例如，J.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning，John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(编者)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)、D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNACloning：A Practical Approach，1-4卷，IRL Press(1995和1996)、以及F.M.Ausubel et al.(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直到现在的所有更新)，EdHarlow和David Lane(编者)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratory，(1988)、以及J.E.Coligan et al.(编者)Current Protocolsin Immunology，John Wiley & Sons(包括直到现在的所有更新)。

治疗或预防疾病

如本文中所使用的，术语“受治疗者”(本文中也称之为“患者”)包括温血动物，优选哺乳动物，包括人类。受治疗者可以是，例如牲畜(例如，羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、或捕获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。在一种优选的实施方式中，受治疗者是灵长类动物。在一种更加优选的实施方式中，受治疗者是人类。

如本文中所使用的，术语“治疗”、“医疗”或“处理”包括给予治疗有效量的如本文中所定义的细胞，和治疗有效量的如本文中定义的化合物，从而足以减少或消除眼病和/或与血管发生相关的病症的至少一种症状。在一种实施方式中，该疾病是湿性年龄相关的黄斑变性，并且该方法降低了该疾病的严重程度和/或延迟或预防该疾病的复发。在另一种实施方式中，本发明的方法比单独给予中断血管内皮生长因子(VEGF)-信号传导的化合物的疗效时间增长。

如本文中所使用的，术语“预防”包括给予治疗有效量的如本文中定义的细胞和治疗有效量的如本文中定义的化合物，从而足以终止或抑制眼病和/或与血管发生相关的病症的至少一种症状发展。

眼病

如本文中所使用的，术语“眼病”是一种影响或涉及眼睛或眼睛的部件或区域之一的疾病或病症。眼睛包括眼球和构成眼球的组织和流体、眼周肌肉(如斜肌和眼直肌)以及眼球内和眼球附近的视神经部分。

在一种实施方式中，眼病的至少部分特征在于视网膜脱离和/或血管渗漏。

应该理解，本发明的方法可以用于预防或治疗眼睛或与眼睛相关的任何疾病，或在一种实施方式中，可以用于预防或治疗任何眼科病症。采用本发明的方法能够治疗或预防的眼病的实例包括但不限于，巩膜外层炎、巩膜炎、糖尿病性视网膜病变、青光眼、黄斑变性、视网膜脱离、全色盲/Maskun、弱视、屈光参差、阿盖尔罗伯逊瞳孔(Argyll Robertson pupil)、散光、屈光参差、失明、睑板腺囊肿、色盲、全色盲/Maskun、内斜视、外斜视、飞蚊症(floaters)、玻璃体脱离、福克斯营养不良、远视眼(hypermetropia)、远视(hyperopia)、高血压性视网膜病变、虹膜炎、圆锥角膜、雷伯氏的先天性黑蒙(Leber′s congenital amaurosis)、雷伯氏遗传性视神经病变、黄斑水肿、近视、夜盲症、眼肌麻痹(包括进行性外部眼肌麻痹和内部眼肌麻痹、眼局部麻痹(opthalmoparesis))、老花眼、翼状胬肉、红眼(药)、视网膜色素变性、早产儿视网膜病变、视网膜劈裂症、河盲症、眼肌麻痹、暗点(scotoma)、雪盲/电光性眼炎(arc eye)、眼睑疾病、睑下垂、眼外肿瘤、斜视。

在一种优选的实施方式中，本发明的方法可以用于预防或治疗黄斑变性。在一种实施方式中，黄斑变性的特征在于黄斑的损坏或裂开(breakdown)，在一种实施方式中黄斑是眼睛后面的一小片区域。在一种实施方式中，黄斑变性导致中心视力的进行性丧失，但并不是完全失明。在一种实施方式中，黄斑变性是干型的，而在另一实施方式中，黄斑变性是湿型的。在一种实施方式中，干型的特征在于黄斑组织功能消弱和丧失。在一种实施方式中，湿型的特征在于黄斑后面的异常血管的生长。在一种实施方式中，如果不对异常血管出血或渗漏进行治疗就会导致疤痕组织的形成。在一些实施方式中，干型的黄斑变性能够转化成湿型。在一种实施方式中，黄斑变性是年龄相关的，在一种实施方式中其是由伴有视网膜色素上皮下方的维管组织增殖的通过布鲁赫膜中缺陷的脉络毛细管的向内生长所导致的。

在另一优选实施方式中，本发明的方法可以用于治疗或预防视网膜病变。在一种实施方式中，视网膜病变是指视网膜的疾病，在一种实施方式中其特征在于发炎而在另一种实施方式中，这是由于眼睛内的血管损伤所致。在一种实施方式中，视网膜病变是糖尿病性视网膜病变，在一种实施方式中，视网膜病变是由视网膜血管内变化导致糖尿病的并发症。在一种实施方式中，视网膜内血管渗漏血液和/或生长脆弱、毛刷状分支和疤痕组织，在一种实施方式中，视网膜传送至大脑的图像模糊或扭曲。在另一实施方式中，视网膜病变是增殖性视网膜病变，在一种实施方式中，其特征在于视网膜表面上生长新的异常的血管(新血管发生)。在一种实施方式中，瞳孔周围的新血管发生使眼压增加，在一种实施方式中，导致青光眼。在另一种实施方式中，新血管发生产生破裂和出血的更薄弱管壁的新血管，或导致疤痕组织生长，在一种实施方式中，牵拉视网膜离开眼后部(视网膜脱离)。在一种实施方式中，视网膜病变的发病机理与非酶糖化作用、糖基化作用、高级糖化作用终产物的累积、自由基介导的蛋白质损伤、基质蛋白酶的上调、生长因子的确定(elaboration)、血管内皮细胞中粘附分子的分泌、或它们的组合有关。

在另一优选实施方式中，视网膜病变是指早产儿视网膜病变(ROP)，在一种实施方式中，当视网膜上生长异常血管和疤痕组织时就会在早产婴儿中出现早产儿视网膜病变。在一种实施方式中，早产儿视网膜病变是由促进早产儿存活必要治疗所引起的。

在另一优选实施方式中，本发明的方法可以用于治疗或预防视网膜脱离，尤其包括，裂孔源性、牵引性或渗出性视网膜脱离，在一种实施方式中，视网膜脱离是视网膜从其支持层分离。在一种实施方式中，视网膜脱离与视网膜中的撕裂或孔有关，眼内部液体会通过该撕裂或孔渗漏。在一种实施方式中，视网膜脱离是由外伤、衰老过程、严重的糖尿病、炎性疾病、新生血管、或早产儿视网膜病变引起的，而在另一实施方式中，视网膜脱离是自发发生的。在一种实施方式中，从小的视网膜血管出血会在脱离过程中使玻璃体浑浊，在一种实施方式中，会造成图像模糊和扭曲。在一种实施方式中，视网膜脱离会导致严重的视力丧失，包括失明。

血管发生

如本文中所使用的，术语“血管发生”被定义为涉及新血管生长和/或血管发育成为组织的组织血管化过程，因而也被称为新血管形成。该过程能够按照三种方式中之一进行：血管能够从现有的血管长出，由前体细胞能够新形成发育成血管(血管发生)，和/或现有小血管的直径增大。

如本文中所使用的，术语“与血管发生相关的疾病”是特征在于过度和/或异常性新血管形成的任何病症。任何与血管发生相关的疾病可以采用本发明的方法进行治疗或预防。与血管发生相关的疾病包括但不限于，血管生成依赖性癌症，包括，例如，实体瘤、血源性肿瘤(blood born tumor)如白血病和肿瘤转移；良性肿瘤，如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿；类风湿关节炎；牛皮癣；眼部血管发生性疾病，例如，糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病变，包括干性年龄相关的黄斑变性和湿性年龄相关的黄斑变性的黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生；虹膜潮红；奥斯勒-韦伯综合征；心肌血管发生性失明；斑块新生血管；毛细血管扩张；血友病性关节病；血管纤维瘤；及伤口肉芽形成。本发明的方法，也适用于治疗或预防具有作为病理后果如猫抓病(Rochele minalia quintosa)和溃疡(幽门螺杆菌(Helicobacter pylorii))的血管发生的疾病。

在一种优选的实施方式中，与血管发生相关的疾病是一种眼科血管发生疾病。正如本文中所使用的，“眼科血管发生疾病”是特征在于过度和/或异常性新血管形成的眼病。其实例包括但不限于，糖尿病性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生和虹膜潮红。

干细胞及其后代细胞

这种细胞可以是能够用于治疗眼病和/或血管发生相关的病症的任何细胞类型。

如本文中所使用的，术语“干细胞”是指能够产生表现型和基因型相同的子代(daughter)的自我更新细胞以及至少一种其他最终细胞类型(例如，终末分化的细胞)。术语“干细胞”包括全能细胞、多能细胞和多潜能细胞，以及由它们分化而得到的祖细胞和/或前体细胞。

如本文中所使用的，术语“全能细胞(totipotent cell)”或“全潜能细胞(totipotential cell)”是指能够形成完整胚胎(例如，胚泡)的细胞。

如本文中所使用的，术语“多能细胞(pluripotent cell)”或“多能性细胞(pluripotential cell)”是指具有完全分化多能性，即生长成任何哺乳动物体的约26种细胞类型的能力的细胞。多能细胞能够自我更新，并能够在组织中保持不活动或休眠。

对于“多潜能细胞(multipotential cell)”或“多潜能性细胞(multipotentcell)”，我们是指能够产生任何几种成熟细胞类型的细胞。如本文中所使用的，这个短语涵盖了成体或胚胎干细胞和祖细胞，如间质前体细胞(MPC)和这些细胞的多潜能后代。与多能细胞不同，多潜能细胞并不具有形成所有细胞类型的能力。

如本文中所使用的，术语“祖细胞”是指必定会分化成特体类型的细胞或形成特定的组织类型的细胞。

间质前体细胞(MPC)是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝、心脏、眼睛(包括视网膜)、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的；并能够分化成不同种系如中胚层、内胚层和外胚层的细胞。因此，MPC能够分化成大量的细胞类型，包括但不限于，脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维性结缔组织。这些细胞所进入的特定谱系定型和分化途径取决于源于力学影响和/或内生生物因素，如生长因子、细胞活素类和/或由宿主组织构建的局部微环境条件的各种影响。因此，间质前体细胞是分裂产生子代细胞的非造血祖细胞，该子代细胞是干细胞或及时将不可逆地分化而产生表型细胞的前体细胞。

在一种优选的实施方式中，本发明方法中所使用的细胞从获自受治疗者的样品进行富集。本文中所使用的术语“富集”、“浓缩”或它们的变型用于描述当与未处理细胞群相比时，其中细胞群的一种特定细胞类型的比例或许多特定细胞类型的比例增加。

在一种优选的实施方式中，本发明中所使用的细胞是TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或它们的任意组合。优选地，STRO-1⁺细胞是STRO-1^亮(STRO-1^bright)。优选地，STRO-1^亮细胞另外是VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺和/或CD146⁺中的一种或多种。

在一种实施方式中，间质前体细胞是如WO 2004/85630中定义的血管周的间质前体细胞。

当我们对于一种给定的标记物称细胞为“阳性”时，根据该标记物存在于细胞表面的程度，其可以是那个标记的一个低的(lo或暗)或高的(亮，bri)表达子，其中该术语涉及在细胞的颜色分选过程中所使用的荧光或其他颜色的强度。在被分选的特定细胞群上的标记物环境中，应理解lo(或暗或暗淡)和bri的区别。在本文中，当我们对于一种给定标记物称细胞为“阴性”时，并不意味着该标记物根本不会被该细胞表达。这是指该标记物被那种细胞表达的水平相对较低，并且当其被可检测地标记时所产生信号非常低。

当本文中使用术语“亮”时，是指当被可检测地标记时产生相对高信号的细胞表面上的标记物。尽管不期望受限于理论，但是有人提出，“亮”细胞比样品中其他细胞表达更多的靶标记蛋白(例如，由STRO-1识别的抗原)。例如，当用FITC-结合的STRO-1抗体标记而通过FACS分析检测时，STRO-1^bri细胞比非-亮细胞(STRO-1^{灰暗/暗淡})产生更大的荧光信号。优选低，“亮”细胞构成初始样品中所含的至少约0.1％的最亮标记的骨髓单核细胞。在其他实施方式中，“亮”细胞构成初始样品中所含的至少约0.1％，至少约0.5％，至少约1％，至少约1.5％或至少约2％的最亮标记的骨髓单核细胞。在一种优选的实施方式中，STRO-1^亮细胞具有STRO-1表面表达的2log幅度的较高表达。这是相对于“背景”来计算的，即属于STRO-1^-的细胞。通过对比，STRO-1^灰暗和/或STRO-1^中等细胞具有STRO-1表面表达的不到2log幅度的较高表达，典型地约1log幅度的较高表达或低于“背景”。

本文中所使用的术语“TNAP”预想涵盖所有组织非特异性碱性磷酸酶的同种型(isoform)。例如，该术语涵盖肝脏同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一种优选的实施方式中，TNAP是BAP。在一种尤其优选的实施方式中，本文中所使用的TNAP是指能够结合STRO-3抗体的分子，该STRO-3抗体是由于2005年12月19日根据布达佩斯条约以保藏登录号PTA-7282保藏在ATCC的杂交瘤细胞系产生的。

另外，在一种优选的实施方式中，该细胞能够产生克隆的CFU-F。

优选较大比例的多潜能细胞能够分化成至少两种不同的种系。多潜能细胞能够定型(commit)的种系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞前体，其是胆管上皮细胞和肝细胞多潜能的；神经限制性细胞(neuralrestricted cell)，其能够产生发展为少突神经胶质细胞和星形细胞的神经胶质细胞前体；发展成神经元的中性前体；心肌和心肌细胞的前体，响应于葡萄糖而分泌胰岛素的胰岛β细胞系的前体。其他种系包括但不限于，成牙本质细胞、产生牙本质的细胞和软骨细胞、以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角化细胞、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周细胞、血管细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一种实施方式中，干细胞及其后代能够分化成周细胞。

在另一种实施方式中，“多潜能细胞”在培养后不能产生造血细胞。

本发明的方法适用的干细胞可以来自于成体组织、胚胎或胎儿。术语“成体”以最广泛的意义使用，包括出生后的受治疗者。在一种优选的实施方式中，术语“成体”是指青春后期的受治疗者。本文中所使用的术语“成体”也能够包括取自雌性的脐带血。

本发明还涉及产生于本文中描述的体外培养干细胞和包括干细胞以及其后代等的的直系后代的后代细胞(其也能够称之为扩展细胞)的用途。根据培养条件(包括在培养基中的刺激因子的数目和/或类型)的不同，本发明的扩展细胞可以具有各种不同的表型、传代数等。在某些实施方式中，后代细胞获自亲代群传代后约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，或约10代。然而，后代细胞可以获自父本群之后任何传代数。

后代细胞可以通过在任何合适的培养基中的培养而获得。对于本文中提到的细胞培养基，所使用的术语“培养基”包括细胞所处环境的构成。培养基可以是固态的、液态的、气态的或各种多种相态和物质的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶介质如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。术语“培养基”也是指预想用于细胞培养的物质，即使其并不接触细胞。换句话说，为细菌培养制备的营养丰富的液体就是一种培养基。类似地，当与水或其他液体混合时成为合适用于细胞培养的粉末混合物，可以被称为“粉状培养基”。

在一种实施方式中，适用于本发明方法的后代细胞通过采用用STRO-3抗体标记的磁珠从骨髓中分离TNAP+细胞，并如先前所述在补充有20％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100μm L-抗坏血酸-2-磷酸盐的α-MEM中培养皿培养而获得(对于有关培养条件的进一步细节，参见Gronthos et al.(1995))。

在一种实施方式中，这种扩展的细胞(至少5代之后)可以是TNAP-、CC9⁺、HLA类I⁺、HLA类II^-、CD 14^-、CD 19^-、CD3^-、CD11a-c^-、CD31^-、CD86^-和/或CD80^-。然而，在与本文中描述的培养条件不同的培养条件下，不同标记物的表达可以是不同的。而且，尽管这些表型的细胞可以在扩展细胞群中占优势，但是并不意味着不存在那些不具有这种表型(这些表型)的少量比例的细胞(例如，扩展细胞的小百分数可以是CC9^-)。在一种优选的实施方式中，本发明的扩展细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。

在一种实施方式中，本发明方法中使用的扩展细胞群中包含至少25％，更优选至少50％的细胞是CC9+。

在另一种实施方式中，本发明方法中使用的扩展细胞群中包含至少40％，更优选至少45％的细胞是STRO-1+。

在另一种实施方式中，后代细胞可以表达选自由以下标记物组成的组中的标记物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β、6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R、(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL、STRO-1^亮和CD 146或这些标记物的任意组合。

在一种实施方式中，后代细胞是在WO 2006/032092中定义的多潜能扩展的MPC后代(MEMP)。WO 01/04268和WO 2004/085630中描述了制备可由其获得的后代的MPC富集群的方法。在体外环境中，MPC几乎不会以绝对纯净制剂存在，起一般与其他属于组织特异性定型细胞(TSCC)一起存在。WO 01/04268涉及从骨髓以约0.1％至90％的纯度水平收获这种细胞。含有可由其获得的后代的MPC的群可以直接从组织源收获，或可替代地可以是已经离体(ex vivo)扩展的群。

例如，后代可以获自收获的、未扩展的、基本上纯的MPC群，包含它们所在的群中的全部细胞的至少约0.1％，1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或95％。这个水平可以例如通过对于选自由TNAP、STRO-1^亮、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD 146和STRO-2组成的组中的至少一种标记物呈阳性的细胞进行选择而实现。

MPC起始群可以，例如，来自于WO 01/04268或WO 2004/085630中所列出的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或可能更广泛地来自于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

MEMPS与新收获MPC的区别之处在于它们对于标记物STRO-1^bri呈阳性而对于标记物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相比而言，新分离的MPC对于STRO-1^bri和ALP都呈阳性。在本发明的一种优选实施方式中，至少15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的所给予的细胞具有表型STRO-1^bri，ALP^-。在另一优选实施方式中，MEMPS对于Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种标记物呈阳性。在还有的另一优选实施方式中，MEMP并不表现出TERT活性和/或对于标记物CD18呈阴性。

在一种实施方式中，细胞取自患有血管发生相关疾病的患者，利用标准技术体外培养并向患者作为自体同源或异源移植物进行给药。在一种可替代实施方式中，使用了一种或多种已构建的人细胞系的细胞。在本发明另一有用的实施方式中，使用非人动物的细胞(或如果患者不是人类，而来自另一物种)。

本发明能够采用来自任何非人动物物种的细胞来实施，包括但不限于，非人灵长类动物细胞、有蹄动物、犬科、猫科、兔类动物、啮齿类动物、鸟类和鱼类动物细胞。可以用于实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、猕猴和任何其他新大陆猴或旧大陆猴的细胞。可以用于实施本发明的有蹄动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可以用于实施本发明的啮齿类动物细胞包括但不限于，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可以用于实施本发明的兔类动物种的实例包括家兔、长腿野兔、野兔、棉尾兔(cottontail)、雪鞋兔(snowshoe rabbit)和鼠兔。可以用于实施本发明的鸟类物种的实例是鸡(原鸡(Gallus gallus))。

适用于本发明方法的细胞可以在使用之前储存。保存和储存真核细胞，尤其是哺乳动物细胞的方法和方案在本领域内是公知的(cf.，例如，Pollard，J.W.and Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，N.J.；Freshney，R.I.(2000)Culture of AnimalCells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，N.J.)。维持所分离的干细胞如间质干细胞/祖细胞，或其后代细胞的生物活性的任何方法都可以结合本发明使用。在一种优选的实施方式中，通过使用低温冷藏来维持和储存细胞。

在一种实施方式中，细胞是同种异源的或自体同源的。

能够用于治疗或预防眼病的细胞类型的其他实例包括但不限于，WO 07/130060(来自视网膜外组织的成年视网膜干细胞)、US 2008089868(视网膜干细胞)、US 2001031256(神经视网膜细胞和猪视网膜色素上皮细胞)、US2006002900(视网膜色素上皮细胞)、US 2007248644(马勒干细胞)和US 6162428(hNT-神经元细胞)中描述的细胞。

能够用于本发明方法的其他细胞类型的实例包括但不限于，CD34+造血干细胞、来自于脂肪组织的细胞、来自于STRO-1-骨髓的MPC、胚胎干细胞、和骨髓或外周血单核细胞。

细胞分选技术

适用于本发明方法的细胞能够利用各种技术获取。例如，能够使用许多细胞分选技术，这些技术根据与细胞-抗体复合物有关的性质，或连接于抗体的标记(lable)而物理分离细胞。这种标记可以是磁性颗粒或荧光分子。抗体可以是交联的而使之形成可通过其密度分离的多细胞的聚集体。可替代地，抗体可以粘附于所需的细胞粘附的静态基质。

在一种优选的实施方式中，使用结合于TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、3G5⁺、CD45⁺、CD146⁺的抗体(或其他结合剂)来分离这些细胞。更优选地，使用结合于TNAP⁺或STRO-1⁺的抗体(或其他结合剂)来分离这些细胞。

从未结合的细胞中分离抗体结合的细胞的各种方法是已知的。例如，结合于细胞的抗体(或抗同型抗体(anti-isotype antibody))能够被标记并随后通过检测标记存在的机械细胞分选器来分离细胞。荧光活化的细胞分选器在本技术领域内是公知的。在一种实施方式中，抗-TNAP抗体和/或STRO-1抗体连接至固体载体。各种固体载体对于本领域技术人员公知的，包括但不限于，琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜、聚合物和塑料培养皿。能够通过从细胞悬浮液中简单物理分离固体载体而将经由抗体结合的细胞细胞悬浮液中除去。

超顺磁性微粒子可以用于细胞分离。例如，可以用抗-TNAP抗体和/或STROng-1抗体来涂覆微粒。抗体标记的超顺磁微粒可以随后用包含所关注细胞的溶液进行培养。微粒结合于所需干细胞的表面，并且随后能够在磁场中收集这些细胞。

在另一实例中，细胞样品容许物理接触，例如，固体载体连接的抗-TNAP单克隆抗体和/或抗-STRO-1单克隆抗体。固相连接能够包括，例如，将抗体吸附于塑料、硝基纤维素或其他表面上。抗体也能够吸附于中空纤维膜的大孔的壁上(足够大而容许细胞流过)。可替代地，抗体能够共价地连接至表面或珠上，如法玛西亚琼脂糖凝胶6MB(PharmaciaSepharose 6MB)的大珠上。采用包含干细胞的悬浮液对于固相-连接抗体培养的精确条件和持续时间取决于对所采用系统具有特异性的几种因素。然而，合适条件的选择是本领域技术人员是公知的。

在使干细胞结合足够的时间之后，用生理缓冲剂随后洗脱或冲洗掉未结合的细胞。可回收未结合的细胞能够以用于其他目的或在合适的测试完成后以确保所需分离已经达到后丢弃。结合的细胞随后通过任何合适的方法从固相分离，这些方法主要取决于固相和抗体的性质。例如，通过剧烈搅拌使结合的细胞从塑料培养皿洗脱。可替代地，结合的细胞能够通过酶的“间隙(nicking)”或消化固相和抗体之间的酶敏性“间隔区(spacer)”序列而被洗脱。结合于琼脂糖珠的间隔区，可以从例如Pharmacia商购获得。

被洗脱的富集的细胞部分随后可以通过离心用缓冲液冲洗，并且所述富集的部分可以根据常规技术以存活状态低温储存备用，将培养物扩展和/或引入至患者中。

中断VEGF-信号传导的化合物

适用于本发明方法的化合物能够是降低VEGF发挥其正常生物效应能力的任何类型的分子。例如，该化合物可以结合VEGF本身、其受体，或在通过VEGF结合之后在VEGF受体的活化后被活化和/或合成的胞内信号传导蛋白或转录因子，或减少它们的的产生。因此，如本文中所使用的，术语“中断VEGF-信号传导的化合物”是指减少VEGF、VEGF受体或其他涉及VEGF-信号传导的分子的量，和/或VEGF通过其相应受体发送信号并产生相关下游生物学效应(如促进细胞生长和/或分裂)的能力。

化合物和其靶(例如，VEGF)之间的结合可以由共价或非共价相互作用或共价和非共价相互作用的组合而介导。当该相互作用产生非共价结合络合物时，所产生的结合典型地是静电结合、氢键或亲水/亲脂相互作用的结果。在一种实施方式中，该化合物是纯化的和/或重组多肽。尤其优选的化合物是纯化的和/或重组的抗体、抗体相关的分子或其抗原结合片段。

尽管并不是必要的，但是该化合物可以特异性地结合于靶。短语“特异性地结合”是指在特定条件下，化合物结合于靶而不结合于大量的其他物质，例如蛋白质或碳水化合物。例如，在一种实施方式中，化合物特异性地结合于VEGF-A，而不结合其他的VEGF。在另一种实施方式中，如果在化合物与靶的结合与另一种蛋白质与靶的结合相比时，它们之间存在超过10倍的差异，且优选25、50或100倍时，就认为化合物是“特异性地结合”。

适用于本发明的化合物的实例包括但不限于，VEGF的喹唑啉衍生物抑制剂(US 2007265286、US 2003199491和US 6809097)、五羟黄酮(槲皮素，quercetin)(抑制VEGF)(WO 02/057473)、VEGFR酪氨酸激酶的喹唑啉衍生物抑制剂(US 2007027145)、VEGFR酪氨酸激酶的氨基苯甲酸衍生物抑制剂(US 6720424)、VEGFR酪氨酸激酶的吡啶衍生物抑制剂(US 2003158409)、雷生汀(Recentin)(Astra Zeneca)(抑制所有三种VEGFR)(WO 07/060402)、舒尼替尼(Novartis)(抑制所有三种VEGFR)(WO 08/031835和US 6,573,293)、培加尼布(Macugen^TM)(US 6,051,698)、阿昔替尼(Pfizer)(抑制所有三种VEGFR)(WO 2004/087152)、索拉非尼(Bayer Pharmaceuticals)(WO 07/053573)、VEGFR-1结合肽(US2005100963)、阻断结合于受体的VEGF的富精氨酸抗-血管内皮生长因子肽(US 7291601)、VEGF-Trap(Regeneron Pharmaceuticals)(US2005032699)、可溶性的VEGF受体(US20061 10364和Tseng et al.，2002)、VEGF-C和VEGF-D拟肽抑制剂(US 2002065218)、阻断VEGF从VEGF-肝素复合物释放的PAI-1(US 2004121955)、US 2002068697、WO02/081520、US 20060234941、US 2002058619中描述的抑制剂、以及以下所概括的其他实例。在一种优选的实施方式中、该化合物是来尼珠单抗(Lucentis)、阿瓦斯汀或VEGF-Trap。

靶分子的实例

在一种实施方式中，这种中断VEGF-信号传导的化合物的靶分子是血管内皮生长因子。

如本文中所使用的，术语“血管内皮生长因子”或“VEGF”是指一组在细胞表面结合于酪氨酸激酶受体(VEGF受体，或VEGFR)而刺激血管发生、血管形成和内皮细胞生长的生长因子(参见，例如，Breen，2007)。

如本文中所使用的，术语“VEGF-A”是指结合于VEGFR-1和VEGFR-2受体以刺激内皮细胞发生有丝分裂和细胞迁移，刺激MMOP活性，增加αvβ3活性，促进血管腔的产生和穿孔的VEGF多肽生长因子家族中的成员，其对于巨噬细胞和粒性白细胞是趋化性的，并也是一种强效血管扩张剂(Breen，2007；Eremina和Quaggin，2004)。另外，已经鉴别出了VEGF-A的剪接转录变异体，其产生VEGF-A的多个不同的同种型。VEGF-A多肽的实例包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码前原VEGF-A的开放读码框的实例是由SEQID NO：9提供的。

如本文中所使用的，术语“VEGF-B”是指结合于VEGFR-1受体以刺激血管发生，内皮细胞有丝分裂和迁移的VEGF多肽生长因子家族的成员(Breen，2007；Olofsson et al.，1996)。另外，已经鉴别了VEGF-B的剪接转录变异体，其产生VEGF-A的多个不同的同种型。VEGF-B多肽的实例包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码前原VEGF-B的开放读框码框的实例是由SEQ ID NO：10提供的。

如本文中所使用的，术语“VEGF-C”是指结合于VEGFR-2和Flt4受体以刺激内皮细胞有丝分裂和迁移以及淋巴血管发生的VEGF多肽生长因子家族中的成员(Breen，2007；Su et al.，2007)。VEGF-C经过络合物蛋白水解成熟以产生几个同种型而仅有完全处理的形式(fully processedfrom)能够结合并活化其同源VEGFR-2受体。VEGF-C多肽的实例包括含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码前原VEGF-C的开放读码框的实例是由SEQ ID NO：11提供的。

如本文中所使用的，术语“VEGF-D”是指结合于VEGFR-2受体和VEGFR-3受体以刺激血管发生，淋巴管新生和内皮细胞有丝分裂和迁移的VEGF多肽生长因子家族的成员。VEGF-D经过络合物蛋白水解成熟而产生几个同种型而仅有完全处理的形式能够结合并活化其同源VEGFR-2受体和VEGFR-3受体。VEGF-D多肽的实例包括含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码前原VEGF-D的开放读码框的实例是由SEQ ID NO：12提供的。

在一种实施方式中，中断VEGF-信号传导的靶分子是血管内皮生长因子受体。

如本文中所使用的，术语“VEGFR-1”(也被称为为Flt-1)是指位于细胞表面上的VEGF酪氨酸激酶受体家族的成员1，其含有7个胞外免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和一个包含酪氨酸激酶功能的胞内域，VEGF-A和VEGF-B结合于此(Olsson et al.，2006；Cross et al.，2003)。一旦结合配体(例如，VEGF-A)，VEGFR-1受体发生二聚并通过磷酸转移作用被活化一刺激血管发生、血管形成和内皮细胞生长。VEGFR-1多肽的实例包括含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码VEGF-1的开放读码框的实例是由SEQ ID NO：13提供的。

如本文中所使用的，术语“VEGFR-2”(也被称为KDR或Flk-1)是指位于细胞表面上的VEGF酪氨酸激酶受体家族的成员2，其含有7个胞外免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和一个包含酪氨酸激酶功能的胞内域，VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D结合于此(Olsson et al.，2006；Crosset al.，2003)。一旦与配体结合，VEGFR-2受体就发生二聚并通过磷酸转移作用被活化以刺激血管发生、血管形成和内皮细胞生长。VEGFR-2多肽的实例包括含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码VEGF-2的开放读码框的实例是由SEQ ID NO：14提供的。

如本文中所使用的，术语“VEGFR-3”(也被称为为Fltk-4)是指位于细胞表面上的VEGF酪氨酸激酶受体家族的成员3，其含有7个胞外免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和一个包含酪氨酸激酶功能的胞内域，VEGF-C和VEGF-D结合于此(Olsson et al.，2006；Cross et al.，2003)。一旦结合配体，VEGFR-3受体二聚并通过磷酸转移作用被活化而介导血管增生。VEGFR-3多肽的实例包括含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码VEGF-3的开放读码框的实例是由SEQ ID NO：15提供的。

在另外一种实施方式中，中断VEGF-信号传导的靶分子使血管内皮生长因子的生长减少。例如，该靶分子可以是缺氧诱导因子1(HIF-1)。

如本文中所使用的，术语“缺氧诱导因子1”(HIF-1)是指调节参与低氧响应中的基因的转录因子。例如，已知HIF-1在低氧响应中上调VEGF表达(Zhang et al.，2007)。HIF-1α是HIF-1的可诱导亚单元。HIF-1多肽的实例包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列的蛋白，以及其变体和/或突变体。另外，编码HIF-1的开放读码框的实例是由SEQ ID NO：16提供的。

靶向于HIF-1的化合物实例包括但不限于，棘霉素(Kong et al.，2005)、BDDF-1(WO 08/004798)、S-2-氨基-3-[4′-N，N，-二(2-氯乙基)氨基]苯基丙酸N-氧化物二盐酸盐(PX-478)(US 2005049309)、黑毛霉素(Kunget al.，2004)、3-(5′-羟甲基-2′-呋喃基)-1-苄基吲唑(YC-1)(Yeo et al.，2003)、103D5R(Tan et al.，2005)、quinocarmycin单柠檬酸盐及其衍生物(Rapisardaet al.，2002)、3-(5′-羟甲基-2′-呋喃基)-1-苄基吲唑(US 2004198798)、以及NSC-134754和NSC-643735(Chau et al.，2005)。

在另外一种实施方式中，中断VEGF-信号传递的靶分子是经由VEGF结合之后在VEGF受体活化作用后活化和/或合成的胞内信号传导蛋白或转录因子。

抗体-一般性

抗体可以作为完整免疫球蛋白存在，或作为以各种形式的修饰物(modification)存在，包括，例如，但不限于，包括V_H或V_L域的域抗体、重链可变区的二聚体(VHH，对于骆驼科动物描述的)、轻链可变区的二聚体(VLL)、仅包含轻链和重链可变区的Fv片段、或包含重链可变区和CH1域的Fd片段。术语“抗体”也涵盖由连接在一起形成单链抗体的重链和轻链可变区的scFv(Bird et al.，1988；Huston et al.，1988)和scFv的低聚物，如二聚体和三聚体。非天然存在的抗体包含至少一个CDR，更优选至少一个可变域，在本文中其也被称为“抗体相关的分子”。术语“抗体”也涵盖抗体的片段，如包含可变区和部分恒定区的Fab、(Fab′)₂和FabFc₂片段。CDR嫁接的抗体片段和抗体片段的低聚物也涵盖在内。Fv的重链和轻链组分可以来自于相同的抗体或不同的抗体，由此产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(例如，小鼠、家兔或大鼠)抗体或人源抗体或可以是嵌合抗体(Morrison et al.，1984)或人源化抗体(Jones et al.，1986)。如本文中所使用的，术语“抗体”包括这些各种形式。利用本文中提供的准则和以上引述的参考文献和如Harlow & Lane(supra)之类的出版物中描述的本领域技术人员公知的方法，能够容易地制作出适用于本发明方法的抗体。

抗体可以是包含可变轻(V_L)链和可变重(V_H)链的Fv区。轻链和重链可以直接或通过连接子连接在一起。如本文中所使用的连接子是指共价连接至轻链和重链并提供两条链之间足够间隔和柔性，以使它们能够实现其中它们能够特异性结合其所指向的抗原决定基的构造。蛋白连接子由于它们可以表达为融合多肽的Ig部分的固有组分而是特别优选的。

在另一实施方式中，在本发明的方法中使用重组生产的单链scFv抗体，优选人源化的scFv。

各种免疫分析方式可以用于选择与靶分子(如VEGF或其受体)具有特异性免疫反应活性的抗体。例如，表面标记和流式细胞测量分析或固相ELISA免疫分析都常规用于选择与蛋白或碳水化合物具有特异性免疫反应活性的抗体。参见Harlow & Lane(supra)，其中描述了免疫分析方式和能够用于测定特异性免疫反应活性的条件。

能够适用于本发明方法的抗体、抗体相关的分子或其片段的实例包括但不限于，抗-VEGF-A抗体如贝伐单抗(阿瓦斯汀)(US 6,054,297)、来尼珠单抗(Lucentis)(US 6,407,213)和描述于US 5730977和US2002032315中的那些；抗-VEGF-B抗体如描述于US 2004005671和WO07/140534中的那些；抗-VEGF-C抗体如描述于US 6403088中的那些；抗-VEGF-D抗体如描述于US 7097986中的那些；抗-VEGFR-1抗体如描述于US 2003088075中的那些；抗-VEGFR-2抗体如描述于US 6344339，WO 99/40118和US 2003176674中的那些；以及抗-VEGFR-3抗体如描述于US 6824777中的那些。

单克隆抗体

通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。产生永生化抗体的细胞系能够通过细胞融合，并且也可以通过其他技术如B淋巴细胞与成瘤DNA直接转化，或与爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr viru)转染来制备。对靶抗原决定基生产的单克隆抗体的面板能够对各种性质进行筛选；即，对于异型和抗原决定基亲合性。

来自于动物的单克隆抗体都能够用于支配体内和体外免疫疗法。然而，据观察，例如，当来自小鼠的单克隆抗体能够作为治疗药物用于人类时，患者产生人抗鼠抗体。因此，来自于动物的单克隆抗体对于治疗，尤其是用长期使用时，并不是优选的。然而，采用所构建的遗传工程技术，可以创造具有来自于动物的和来自于人的部分的嵌合抗体或人源化的抗体。动物能够是，例如，小鼠或其他啮齿类动物，如大鼠。

如果嵌合抗体的可变区是，例如，来自于小鼠的，而恒定区是来自于人的，则该嵌合抗体一般比“纯的”鼠源单克隆抗体的免疫原性要差。这些嵌合抗体可能更适用于治疗应用，从而认为“纯的”鼠源抗体是不适合的。

产生嵌合抗体的方法对于本领域技术人员都是可以利用的。例如，轻链和重链能够利用，例如，免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链在单独的质粒中单独表达。随后将它们进行纯化并体外组装成完整抗体；完成这种组装的方法已经进行了描述(参见，例如，Sun et al.，1986)。这种DNA构建体(或构件，construct)可以包含编码抗体轻链或重链可变区的功能重排基因的DNA，其中该抗体编码连接于编码人恒定区的DNA。用轻链和重链的DNA构建体转染的淋巴细胞(如骨髓瘤或杂交瘤)能够表达和组装这种抗体链。

从还原分离的轻链和重链形成IgG抗体的体外反应参数也已经进行了描述。也可以在同一细胞中共表达轻链和重链，从而实现轻链和重链发生胞内缔合并连接成完整的H2L2 IgG抗体。这种共表达能够采用相同的或不同的质粒在相同的宿主细胞中完成。

在本发明的一种优选实施方式中，抗体是人源化的，即通过分子模型技术产生抗体，其中抗体人源部分最大化而同时导致几乎没有或没有损失可归于，例如，亲代大鼠、兔或鼠科动物抗体的可变区的结合亲合性。以下描述的方法可适用于抗体的人源化。

在确定人源化过程中使用什么样的人源化抗体序列时需要考虑几个因素。轻链和重链的人源化应彼此独立地考虑，但是考虑轻链和重链的原理是基本上类似的。

这种选择过程基于以下基本原理：给定抗体的抗原特异性和亲合性主要是通过可变区CDR的氨基酸序列来确定的。可变区框架残基几乎没有或没有直接贡献。框架区的主要功能是在其适当的空间定向上固定CDR从而识别抗原。因此，如果人可变域框架与其所起源的动物可变域的同源程度最高，则动物如啮齿动物CDR替代成人可变域框架最可能导致其适当的空间定向得以保留。应该优先选择人可变域，从而高度同源于动物可变域。合适的人抗体可变域序列能够如下进行选择。

步骤1.利用计算机程序，搜索那些与动物源抗体可变域同源程度最高的人抗体可变域序列的所有可用的蛋白质(和DNA)数据库。合适程序的输出结果是与动物源抗体同源程度虽高的序列列表、每一序列的同源百分数、以及动物源序列的每一序列比对。这对于重链和轻链可变域序列都是分别完成的。如果仅包含人免疫球蛋白序列，则以上分析就更容易完成。

步骤2.列出人抗体可变域序列并比对同源性。首先，除了可变程度较高的重链的CDR3之外，在CDR的长度上进行比对。将人重链和κ和λ轻链分成多个亚组；重链3个亚组，κ链4个亚组，λ链6个亚组。每一亚组中CDR的大小类似但是在亚组之间是可以是不同的。通常可以将动物源抗体CDR匹配于人亚组的抗体作为同源性的一级近似(firstapproximation)。随后对具有相似长度CDR的抗体来比对氨基酸序列的同源性，尤其是在CDR中，而且在周围框架区内进行比对。选择最具同源性的人可变域作为人源化的框架。

实际人源化方法/技术

根据EP-A-0239400，抗体可以通过将所需的CDR嫁接到人框架来实施人源化。编码所需的改造抗体的DNA序列能够因此以期望改造其CDR的人DNA开始来制造。将包含所需CDR的动物源可变域氨基酸序列与所选择的人抗体可变域序列的氨基酸序列进行比对。对人可变域中需要改变成动物中对应残基之处的残基进行标记以将人可变域引入动物源的CDR。还可以具有需要在人序列中替换、加入和从人序列中删除的残基。

合成的寡核苷酸能够用于诱变人可变域框架以使其包含所需的残基。这些寡核苷酸能够是任何方便的尺寸。一种通常由可利用的具体合成子的能力仅受限于长度。寡核苷酸体外定向诱变的方法是公知的。

可替代地，人源化可以采用WO 92/07075的重组聚合酶链反应(PCR)方法来实现。利用这种方法，可以在人抗体的框架区之间剪接CDR。一般而言，WO 92/07075的技术能够利用包含两个人框架区(AB和CD)及其之间通过供体CDR替换的CDR的模版来实施。引物A和B用于扩增框架区AB，而引物C和D用于扩增框架区CD。然而，引物B和C每一个在其5′端处还包含对应于所有或至少部分供体CDR序列的附加序列。引物B和C重叠足够的长度从而能够在容许实施PCR的条件下在它们的5′端相互进行退火。因此，扩增的区域AB和CD可以通过重叠延伸进行基因剪接从而在单个反应中生成人源化产物。

在诱变反应以改造抗体之后，可将经诱变的DNA连接于编码轻链和重链恒定区的合适DNA，克隆到表达载体中并转染到宿主细胞中，优选哺乳动物细胞。这些步骤能够按照常规的模式完成。改造的抗体因此可以通过包括以下步骤的方法进行制备：

(a)制备包含可操作地连接于编码Ig重链或轻链的至少一个可变域的DNA序列的合适启动子的第一可复制表达载体，可变域包括人抗体和本发明的人源化抗体所需的CDR的框架区；

(b)制备包含可操作地连接于分别编码互补Ig轻链或重链的至少可变域的DNA序列的合适启动子的第二可复制表达载体；

(c)用所制备的该第一载体或两个载体转化细胞系；和

(d)培养所述转化的细胞系以生成所述改变的抗体。

优选地，步骤(a)中的DNA序列都编码人抗体链的可变域和每一个恒定域。人源化抗体能够利用任何合适的重组表达系统来制备。经过转化而生成改变的抗体的细胞系可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或永生化哺乳动物细胞系，其有利地是淋巴来源的，如骨髓瘤细胞系、杂交瘤细胞系、三源杂交瘤(trioma)细胞系或四源杂交瘤(quadroma)细胞系。该细胞系也可以包含正常淋巴细胞，如B-细胞，其是通过用病毒，如爱波斯坦-巴尔病毒转化而永生化的。最优选地，永生化细胞系是骨髓瘤细胞系或其衍生物。

适用于抗体表达的CHO细胞可以是二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷型的因而其生长依赖于胸苷和次黄嘌呤。亲本的dhfr^-CHO细胞系用编码抗体和能够进行dhfr阳性表型的CHO细胞转化体选择的dhfr基因的DNA进行转染。通过在缺乏胸苷和次黄嘌呤的培养基上培养菌落而实施选择，胸苷和次黄嘌呤的缺乏防止未转化的细胞生长而从废物再利用的叶酸途径转化细胞，而由此绕过了选择系统。这些转化体通常由于所关注的转染DNA和编码dhfr的DNA发生共合(co-integration)而表达低水平的所关注的DNA。可以通过采用氨甲喋呤(MTX)实施扩增来增加编码抗体的DNA的表达水平。这种药物是酶dhfr的直接抑制剂从而使得能够分离出抗性菌落，这些抗性菌落扩增其dhfr基因拷贝数以使得其能够足以在这些条件下存活。由于编码dhfr和抗体的DNA序列紧密连接于初始转化体中，因此通常存在伴随扩增，从而增加了所需抗体的表达。

适合于与CHO或骨髓瘤细胞一起使用的另一优选表达系统是WO87/04462中描述的谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统。这种系统涉及用编码酶GS的DNA和编码所需抗体的DNA转染细胞。所选择的细胞随后在无谷氨酰胺培养基中生长并由此能够假定整合了编码GS的DNA。这些所选择的克隆随后采用甲硫氨酸砜亚胺(Msx)来进行酶GS的抑制作用。为了存活，该细胞将会采用编码抗体的DNA的伴随扩增而扩增编码GS的DNA。

尽管用于产生人源化抗体的细胞系优选是哺乳动物细胞系，但可替代地可以使用任何其他合适的细胞系，如细菌细胞系或酵母细胞系。具体而言，可以设想，也能够使用来自于大肠杆菌的细菌菌株。检测所获得抗体的功能性。如果功能性消失，则需要转到步骤(2)并改变抗体的框架。

表达之后，整个抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，都能够根据本领域的标准方法，包括硫酸铵沉淀法、亲合柱法、柱色谱法、凝胶电泳法等进行回收和纯化(通常参见，Scopes，R.，ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y(1982))。对于医药用途，优选至少约90％至95％同质性的基本纯净的免疫球蛋白，且98％至99％或更高同质性的免疫球蛋白是最优选的。纯化之后，部分达到或达到所需的同质性，则随后就可以将人源化抗体用于治疗或开发和实施分析过程，免疫荧光染色等(一般参见Lefkovits和Pernis(编者)，Immunological Methods，第I卷和第II卷，Academic Press，(1979和1981))。

也可以通过将抗原给予转基因动物来制备具有全长人可变域的抗体，该转基因动物经过改造响应抗原激发而产生这种抗体，而其内源性基因座已失效。各种随后的操控能够实施与获得抗体本身或其类似物(参见，例如，US 6,075,181)。

基因沉默

在一种实施方式中，采用基因沉默中断VEGF-信号传导。术语“RNA干扰”、“RNAi”或“基因沉默”一般是指其中双链RNA(dsRNA)分子降低核酸序列的表达的方法，该双链RNA分子与该核酸序列共用大部分的同源性或全部的同源性。然而，最近发现，利用非RNA双链分子也能够实现基因沉默(参见，例如，US 20070004667)。

RNA干扰(RNAi)尤其适用于特异性抑制特定RNA和/或蛋白的产生。尽管不期望受限于理论，但是Waterhouse et al.(1998)已经提供了一个用于dsRNA(双链体RNA)通过该机制能够降低蛋白质产生的机制的模型。这种技术依赖于包含基本上相同于所关注基因的mRNA的序列或其部分的sRNA分子的存在，在这种情况下是编码根据本发明的多肽的mRNA的存在。方便地，dsRNA能够由重组载体或宿主细胞的单个启动子产生，其中正义和反义序列通过不相关序列侧接，这能够使正义和反义序列与形成环结构的不相关序列杂交而形成dsRNA分子。本发明的合适dsRNA分子的设计和生产充分属于本领域内技术人员的能力范围，尤其考虑Waterhouse et al.(1998)，Smith et al.(2000)、WO 99/32619、WO99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。

本发明包括包含和/或编码基因沉默的双链区的核酸分子的用途。核酸分子典型地是RNA但可以包含DNA、化学修饰核苷酸和非核苷酸。

双链区应该有至少19个毗邻核苷酸，例如约19至23个核苷酸，或可以更长，例如，30或50个核苷酸，或100个核苷酸或更长。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。优选地，它们的长度为约19至约23个核苷酸。

核酸分子的双链区域与靶转录物的同一性应该至少为90％且更优选95％～100％。核酸分子的同一性百分数(％)通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)以空位产生罚分(gap creation penalty)＝5和空位延伸罚分(gap extension penalty)＝0.3来确定。优选地，两个序列在其全长长度上进行比对。

核酸分子当然可以包含功能上用于稳定该分子的不相关序列。

如本文中所使用的，术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指包含能够抑制或下调基因表达(例如，通过以序列特异性方式介导RNAi)的核糖核苷酸的核酸分子，其中双链部分的长度小于50个核苷酸，优选长度为约19至约23个核苷酸。例如，siRNA能够是包含自互补的正义和反义区的核酸分子，其中反义区域包含互补于靶核酸分子中核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，正义区具有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。siRNA能够由两个独立的寡核苷酸组装而成，其中一条链是正义链而另一条是反义链，其中反义和正义链是自互补的。

如本文中所使用的，术语siRNA是指等价于用于描述能够介导序列特异性RNAi，例如微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸(siNA)、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等的核酸分子的其他术语。另外，如本文中所使用的，术语RNAi是指等价于用于描述序列特异性RNA干扰，如转录后基因沉默、转录抑制或实验胚胎学(epigenetics)的其他术语。例如，本发明的siRNA分子在实验胚胎学上能够用于转录后水平或转录前水平这两种水平下的基因沉默。在一个非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子完成的基因表达的渐成式调节能够由siRNA介导的染色质结构的修饰从而改变基因表达。

优选的小干扰RNA(‘siRNA’)分子包含与靶mRNA的约19至23个毗邻核苷酸相同的核苷酸序列。在一种实施方式中，靶mRNA序列开始于双核苷酸AA，包含约30％～70％(优选30-60％，更优选40-60％，且更优选约45％-55％)的GC内容物，并且例如，按照通过标准BLAST搜索测定，除了将要引入到鸟类动物(优选鸡)基因组中的靶之外，其与任何核苷酸序列都不具有高百分比的同一性。

对于“shRNA”或“短发夹RNA”是指少于约50个核苷酸，优选约19至约23个核苷酸的siRNA分子，其与位于相同RNA分子上的互补序列碱基配对，并且其中所述序列和互补序列通过至少约4至15个核苷酸的未成对区域而被分隔开，该未成对区域在由碱基互补性的两个区域产生的干结构之上形成单链环。单链环的序列实例是5′UUCAAGAGA 3′和5′UUUGUGUAG 3′。

所包含的shRNA是双指的或二指和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包含两个或多个这种由单链间隔区隔开的干环结构。

对于设计siRNA已经有既定的标准(参见，例如，Elbashire et al.，2001；Amarzguioui et al.，2004；Reynolds et al.，2004)。在一些商业化供应商如Ambion、Dharmacon、GenScript和OligoEngine的网站上能够找到详细内容。典型地，必须产生许多siRNA并进行筛选才能比较其有效性。

经过设计后，适用于本发明方法的dsRNA能够通过本领域已知的任何方法，例如，通过体外转录、重组、或合成方式来产生。siRNA能够通过使用重组酶如T7 RNA聚合物酶、和DNA寡核苷酸模版体外产生，或能够，例如，在培养的细胞中体内制备。在一种优选的实施方式中，核酸分子是合成产生的。

另外，对于由包含，例如，RNA聚合物酶III启动子的载体产生发夹siRNA的策略已经进行了描述。已经构建了用于利用H1-RNA或snU6RNA启动子在宿主细胞中生产发夹siRNA的各种载体。以上描述的RNA分子(例如，第一部分、连接序列、和第二部分)能够被可操作地连接于这种启动子。当通过RNA聚合物酶III进行转录时，第一和第二部分形成了发夹的双链体主干(stem)而连接序列形成环(loop)。pSuper载体(OligoEngines Ltd.，Seattle，Wash.)也能够用于产生siRNA。

可以引入核苷酸的修饰体或类似物来改善本发明的核酸分子的性能。改善的性能包括核酸酶耐性增加和/或渗透细胞膜的能力增加。因此，术语“多核苷酸”和“双链RNA分子”等包括合成修饰的碱基例如，但不限于，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8位取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代的鸟嘌呤、其他氮杂和去氮腺嘌呤、其他氮杂和去氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

在一种实施方式中，双链分子、优选dsRNA，包含含有其中用U代替T的SEQ ID No 9至16提供的任意一个或多个核苷酸序列的至少19个毗邻核苷酸的寡核苷酸，其中该分子的双链部分的长度为至少19个碱基对并包含所述寡核苷酸。

本发明方法中能够使用的双链分子的实例包括但不限于，CN1804038、CN 1834254、WO 08/045576、US 2006025370、US 2006094032、GB 2406569、CA 2537085、WO 03/070910、US 2006217332、US2005222066、US 2005054596、US 2004209832和US 2004138163、US2005148530和US 2005171039中描述的那些。

反义多核苷酸

术语“反义多核苷酸”应该是指DNA或RNA或其组合的分子，这种分子互补于至少一部分编码本发明的多肽的特异性mRNA分子并能够干扰转录后事件如mRNA翻译。反义方法的使用在本领域中是公知的(参见，例如，G.Hartmann和S.Endres，Manual of Antisense Methodology，Kluwer(1999))。Senior(1998)认为反义方法对于操控基因表达现在已经是一种非常完善的技术。

本发明的一种反义多核苷酸将会在生理条件下杂交于靶多核苷酸。如本文中所使用的，术语“在生理条件下杂交于靶多核苷酸的反义多核苷酸”是指多核苷酸(其全部或部分单链的)至少能够在标准条件下与编码蛋白的mRNA，例如SEQ ID NO 9至SEQ ID NO 16中任一种提供的那些，在细胞中，优选在人细胞中形成双链的多核苷酸。

反义分子可以包括对应于结构基因或对于基因表达或剪接事件实施控制的序列的序列。例如，反义序列可以对应于本发明的基因的靶向编码区域，或5′-未翻译区域(UTR)或3′-UTR或其组合。其可以部分互补于靶基因的基因的内含子序列，其可以是转录期间或之后被剪切掉的，优选仅仅互补于靶基因的外显子序列。从UTR的趋异度一般较大的观点来看，靶向这些区域提供了基因抑制的较大特异性。

反义序列的长度应该为至少19个毗邻核苷酸，优选至少50个核苷酸，且更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。互补于整个基因转录物的全长序列都可以使用。长度最优选100-2000个核苷酸。反义序列与被靶向转录物同一性程度应该至少为90％窃更优选95％～100％。反义RNA分子当然可以包含功能上可以稳定该分子的不相关序列。

本发明方法中能够使用的反义多核苷酸的实例包括但不限于描述于US 2003186920和WO 07/013704中的那些。

催化性多核苷酸

术语“催化性多核苷酸/核酸”是指特异性识别独特底物并催化这种底物化学修饰的DNA分子或含DNA分子(本领域中也被称为“脱氧核酶”)或RNA分子或含RNA分子(也被称为“核酶”)。在催化性核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T(而对于RNA为U)。

典型地，催化性的核酸含有一种特异性识别靶核酸的反义序列，并具有核酸酶切活性(本文中也称之为“催化域(catalytic domain)”)。本发明中尤其适用的核酶的类型有锤头核酶(Haseloff和Gerlach，1988；Perrimanet al.，1992)和发夹核酶(Shippy et al.，1999)。

本发明中适用的核酶和编码这种核酶的DNA能够采用本领域中公知的方法进行化学合成。脱氧核酶也能够由可操作地连接于RNA聚合物酶启动子，例如，T7 RNA聚合物酶或SP6 RNA聚合物酶的启动子的DNA分子(转录后就能产生RNA分子)来制备。因此，本发明还提供了一种编码本发明的催化性多核苷酸的核酸分子，即DNA或cDNA。当载体也包含可操作地连接于DNA分子的RNA聚合物酶启动子时，核酶能够在用RNA聚合物酶和核苷酸进行培养时体外生产。在一种独立的实施方式中，DNA能够被插入到表达盒或转录盒中。合成之后，RNA分子能够通过连接(ligation)于具有使核酶稳定并使其耐核糖核酸酶的能力的DNA分子而进行修饰。

如同本文中所述的反应多核苷酸一样，本发明的催化性多核苷酸应该也能够在“生理条件”，即细胞(尤其是在动物细胞如人细胞中的条件)中的那些条件下杂交靶核酸分子(例如，编码由SEQ ID NO 1至8提供的任何多肽的mRNA)。

本发明方法中能够使用的核酶的实例包括但不限于，US 6,346,398，Ciafre et al.(2004)和Weng et al.(2005)中描述的那些。

基因疗法

本文中描述的治疗性多核苷酸分子可以根据本发明通过在经常被称为“基因疗法”的治疗方法中表达这种多核苷酸来使用。因此，来自患者的细胞可以与多核苷酸(如DNA或RNA)一起进行设计来体外编码多核苷酸。随后，所设计的细胞能够提供于使用这种多核苷酸治疗的患者，或有关经由其编码的多肽(例如，抗VEGF抗体)之处。在该实施方式中，细胞可以，例如，通过使用逆转录酶病毒质粒载体转化，例如干细胞或分化的干细胞而进行体外设计。这种方法在本领域内是公知的，并且在本发明中其用途根据本文中的教导显而易见。

而且，对于通过本领域已知的方法体内表达多核苷酸，可以体内设计细胞。例如，多核苷酸可以对于在复制缺陷型逆转录病毒载体或腺病毒载体或其他载体(如痘病毒载体)中的表达进行设计。随后可以分离表达构建体。包装的细胞采用包含编码本文中所述多核苷酸的RNA的质粒载体进行转换而使包装的细胞现在产生包含所关注的基因的感染病毒粒子。这些生产者细胞可以给药至患者以进行体内细胞设计和体内多核苷酸表达。对于本领域技术人员而言，根据本发明的教导，给予多核苷酸的这些和其他方法是显而易见的。

可由本文中以上提及的逆转录酶病毒质粒载体得到的逆转录酶病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。在一种优选的实施方式中，逆转录酶病毒质粒载体来自于莫洛尼鼠白血病病毒。

这样的载体包括一种或多种表达多核苷酸的启动子。可以采用的合适启动子包括但不限于，逆转录酶病毒LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子。也可以使用细胞启动子，如真核细胞启动子包括但不限于，组蛋白、RNA聚合酶III、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、白蛋白启动子、人珠蛋白启动子和α-肌动蛋白启动子。其他可以采用的病毒启动子包括但不限于，腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B 19细小病毒启动子。对于本领域技术人员而言，根据本发明的教导，合适启动子的选择是显而易见的。

逆转录酶病毒质粒载体能够用于将包装的细胞系转换以形成生产者细胞系。可以被转染的包装细胞的实例包括但不限于，由Miller(1990)描述的PE501、PA317、Y-2、Y-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系。该载体可以通过本领域已知的任何方法转换成包装细胞。这种方法包括但不限于电穿孔、脂质体的使用和CaPO₄沉淀。在一种替代方式中，逆转录酶病毒质粒载体可以被包封成脂质体，或耦合于脂质，并且然后给予宿主。

生产者细胞系将产生感染的逆转录酶病毒载体颗粒，其包括多核苷酸。这种逆转录酶病毒载体颗粒随后用于体外或者体内转换真核细胞。转换的真核细胞将表达该多核苷酸，并且相关地产生有其编码的多肽。可以转换的真核细胞包括但不限于，真核干细胞、视网膜干细胞、真核肿瘤细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、肌细胞(尤其是骨骼肌细胞)、内皮细胞和支气管上皮细胞。

在一种实施方式中，作为组合疗法的部分给药的细胞并不是遗传修饰的细胞而是使其产生化合物。在一种尤其优选的实施方式中，作为组合疗法的部分给药的这种细胞并不是遗传修饰的细胞而是使其产生抗VEGF单克隆抗体。

为了监控连续遗传修饰和选择将多核苷酸整合到其中的细胞，构建体或载体中可以包含选择性标记。非限制性实例包括抗药性标记，如G148或潮霉素。另外，可以使用阴性选择，例如，其中标记是HSV-tk基因。这个基因使该细胞对药物如阿昔洛韦和更昔洛韦敏感。通常使用NeoR(新霉素/G148耐受性)基因，但是任何方便的标记基因都可以使用，只要其基因序列不已经存在于靶细胞中的基因都能够使用。另外，非限制性实例包括低亲和性的神经生长因子(NGFR)、增强的荧光绿蛋白(EFGP)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠科动物CD24(HAS)、鼠科动物CD8a(lyt)、赋予嘌呤霉素或腐草霉素耐受性的细菌基因、和β-半乳糖苷酶。

其他多核苷酸序列可以引入到相同载体上的细胞中或可以引入到第二载体上的宿主细胞中。在一种优选的实施方式中，选择性标记将包含于与该多核苷酸相同的载体上。

本发明也涵盖遗传上修饰的内源信基因的启动子区域以使该内源性基因的表达上调以导致编码的蛋白相比于野生型细胞产生增加。

在本发明一种有用的实施方式中，细胞经过遗传修饰而包含中断或抑制血管发生的基因。该基因可以编码细胞毒性药物如蓖麻毒蛋白。在另一实施方式中，该基因编码引发免疫排斥响应的细胞表面分子。例如，该细胞能够遗传修饰而产生α1，3半乳糖基转移酶。这种酶合成属于关键异种抗原的α1，3半乳糖基抗原决定基，而其表达通过所实施的抗体循环和/或通过T细胞介导的免疫排斥导致转基因内源性细胞的超急性排斥。

根据本发明的基因疗法可以涉及基因疗法的多核苷酸在患者中的暂时(临时)存在或将多核苷酸永久引入患者体内。

组合物及其给药

典型地，细胞和化合物在含有至少一种药用载体的药物组合物中给药。另外，本发明的一个方面涉及包含细胞和中断VEGF-信号传导的化合物，以及可选的一种药用载体的组合物。

短语“药用的”是指在合理的医疗判断范围内，适用于与人和动物组织接触，而不会产生过度毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症，并与合理的受益/风险率相当的那些化合物、物质、组合物、和/或剂量形式。本文中所使用的短语“药用载体”是指药用物质、组合物或载体，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、或溶剂包封物质。

药用载体包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这种载体的使用在本领域内是众所周知的。溶液优选无菌的并属于达到存在易于可注射性的程度的流体。优选地，溶液在生产和储存的条件下是稳定的并通过使用，例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、水杨乙汞等而抗微生物如细菌和真菌的污染行为来储存。

能够用作药用载体的物质和溶液的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖，(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)生理盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH值缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)其他药物制剂中采用的无毒相容性物质。

包含适用于本发明方法的细胞的药物组合物可以包含聚合物载体或胞外基质。

各种生物或合成固体基质物质(即，固体支持基质、生物粘合剂或敷料、以及生物/医疗支架)都适用于本发明中。基质物质优选医疗上可接受的且适用于体内应用。这种医疗上可接受和/或生物上或生理上可接受或相容性物质的非限制性实例包括但不限于，可吸收和/或非可吸收的固体基质物质，如小肠粘膜下层(SIS)，例如，猪源的(和其他SIS源)；交联的或非交联的褐藻酸盐、水解胶体、泡沫、胶原凝胶、胶原海绵、聚乙醇酸(PGA)的网格、聚乳糖(PGL)网格、羊毛状物(fleece)、泡沫敷料、生物粘合剂(例如，纤维蛋白胶和纤维蛋白胶)和在一层或多层中的死的去上皮化皮肤等价物。

纤维蛋白胶是一类手术密封剂，已经用于各种临床情况中。由于本领域技术人员已经具备这样的技能，因此许多密封剂都适用于本发明方法适用的组合物中。然而，本发明优选的实施方式涉及与本文中所述的细胞一起使用纤维蛋白胶。

当在本文中使用术语“纤维蛋白胶”时，是指通过纤维蛋白聚合物在钙离子存在下发生交联而形成的不溶性基质。纤维蛋白胶可以由纤维蛋白原，或其衍生物或代谢物、纤维蛋白(可溶性单体或聚合物)和/或其由构成纤维蛋白基质的生物组织或流体衍生的络合物而形成。另外，纤维蛋白胶可以由纤维蛋白原、或其衍生物或代谢物，或通过重组DNA技术生产的纤维蛋白形成。

纤维蛋白胶也可以通过纤维蛋白原和形成纤维蛋白胶的催化剂(如凝血酶和/或因子XIII)相互作用而形成。这一点对于本领域技术人员而言应该理解，纤维蛋白原在催化剂(如凝血酶)存在下发生蛋白水解而切开并转化成纤维蛋白单体。纤维蛋白单体随后可以形成聚合物，这种聚合物可以发生交联而形成纤维蛋白胶基质。纤维蛋白聚合物发生交联，可以通过存在催化剂如因子XIII而得到增强。纤维蛋白胶形成的催化剂可以来自于包含纤维蛋白原或凝血酶的血浆、冷沉淀物(cryoprecipitate)或其他血浆部分。另外，催化剂可以通过重组DNA技术进行生产。

凝块的形成速率取决于与纤维蛋白原混合的凝血酶浓度。由于属于酶依赖性反应，因此温度越高(高达37℃)，凝块形成速率越快。凝块的拉伸强度取决于所用的纤维蛋白原的浓度。

纤维蛋白胶的用途和其制备和使用的方法描述于US 5,643,192中。US 5,643,192公开了从单一供体提取纤维蛋白原和凝血酶组分，以及仅仅这些组分组合而用作纤维蛋白胶。US 5,651,982描述了另一纤维蛋白胶的制备和使用方法。US 5,651,982，提供了具有脂质体的纤维蛋白胶而使用用作哺乳动物中的局部密封剂。

几个出版物描述了纤维蛋白胶用于递送治疗药物的用途。例如，US4,983,393公开了一种用作内阴道插入物的组合物，含有琼脂糖、琼脂、盐水溶液糖胺聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白和酶。另外，US 3,089,815公开了一种可注射药物制剂，包含纤维蛋白原和凝血酶，而US 6,468,527公开了一种纤维蛋白胶，其有利于向体内的特异性位点递送各种生物和非生物药物。这种方法能够用于本发明的方法中。

合适的聚合物载体包括由合成或天然聚合物，以及聚合物溶液形成的多孔网格或海绵。基质的一种形式是聚合物网格或海绵；其他形式是聚合物的水凝胶。能够使用的天然聚合物包括蛋白，如胶原蛋白，白蛋白和纤维蛋白；以及多糖如海藻酸盐和透明质酸的聚合物。合成聚合物包括可生物降解的和非可生物降解的聚合物。可生物降解的聚合物的实例包括羟基酸的聚合物，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、及它们的组合。不可生物降解的聚合物包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙烯醋酸乙烯酯和聚乙烯醇。

能够形成离子或共价交联水凝胶的(其是可延展的)聚合物用于包封细胞。水凝胶是当有机聚合物(天然的或合成的)经由共价键、离子键或氢键交联以产生用于使水分子陷入(捕获，entrap)的三维开放晶格结构以形成凝胶时形成的一种物质。能够用于形成水凝胶的物质的实例包括多糖如褐藻酸盐、聚磷腈和聚丙烯酸酯，其是离子交联的，或嵌段共聚物如Pluronics^TM或Tetronics^TM，其分别通过温度或pH值发生交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。其他物质包括蛋白如纤维蛋白、聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸和胶原。

一般而言，这些聚合物至少部分可溶于水性溶液中，如水、缓冲盐水溶液、或水性醇溶液，其具有带电侧基，或其单价离子盐。具有酸性侧基并能够与正离子反应的聚合物的实例为聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。也可以使用具有酸性侧基的共聚物，其由丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯基醚单体或聚合物反应而形成。酸性基团的实例为羧酸基、磺酸基、卤化的(优选氟化的)醇基、酚OH基和酸性OH基团。具有碱性侧基并能够与阴离子反应的聚合物的实例为聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和一些亚氨基取代的聚磷腈。聚合物的铵或季盐也能够由骨架氮或悬垂亚氨基形成。碱性侧基的实例是氨基和亚氨基。

另外，本发明方法所使用的组合物可以包含至少一种其他治疗药物。例如，该组合物可以包含一种辅助治疗发炎或疼痛的止痛剂、另一种抗血管增生化合物、或防止组合物治疗处发生感染的抗感染药物。更具体而言，有用的治疗药物的非限制性实例包括以下治疗药物类别：止痛药，如非类固醇抗炎药、鸦片受体激动剂类和水杨酸酯类；抗感染剂，如抗蠕虫药(antihelmintics)、抗厌氧菌类药(antianaerobics)、抗生素、氨基糖苷抗生素、抗真菌抗生素、头孢类抗生素、大环内酯类抗生素、混杂的(miscellaneous)β-内酰胺类抗生素、青霉素抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、四环素类抗生素、抗结核菌类药、抗结核抗结核菌类药(antituberculosis antimycobacterials)、抗原虫药(antiprotozoals)、抗疟抗原虫类药(antimalarial antiprotozoals)、抗病毒药剂、抗逆转录酶病毒药物、灭疥癣药(scabicides)、抗炎剂、皮质类固醇抗发炎剂、止痒剂/局部麻醉剂、局部抗感染药、抗真菌局部抗感染药、抗病毒局部抗感染药、电解和肾药、如酸化剂、碱化剂、利尿剂、碳酸酐酶抑制剂利尿剂、环利尿剂、渗透性利尿剂、保钾利尿剂、噻嗪类利尿剂、电解质替代品、和排尿酸药剂；酶，如胰腺酶和溶栓酶；消化系统药物，如止泻药、胃肠抗消炎药、胃肠道抗发炎剂、抗酸抗抗溃疡剂、胃酸泵抑制剂抗抗溃疡剂、胃黏膜抗胃溃疡药物、H2-阻断剂抗胃溃疡药物、胆石溶解剂、消化剂、催吐剂、轻泄剂和大便软化剂、和胃肠蠕动促动力剂；全身麻醉剂，如吸入麻醉药、卤化吸入麻醉药、静脉麻醉药、巴比妥静脉麻醉药、苯二氮平静脉注射麻醉剂、和鸦片激动剂静脉注射麻醉剂；激素和激素调节剂，如堕胎药、肾上腺剂、皮质激素类肾上腺剂、雄激素类、抗-雄激素类、免疫生物剂、如免疫球蛋白、免疫抑制剂、类毒素、和疫苗；局部麻醉剂，如酰胺局部麻醉剂和酯局部麻醉剂、肌骨骼剂(musulokeletal agent)，如抗痛风抗发炎药物、皮质激素类抗发炎剂、金化合物抗消炎药、免疫抑制抗消炎药、非类固醇抗发炎药(NSAIDs)、水杨酸抗发炎剂、矿物质；以及维生素，如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K。

与本发明一起可以在单一组合物中或作为组合疗法使用的其他抗血管发生因子的实例，包括但不限于，血小板因子4；鱼精蛋白硫酸盐；磺化甲壳素衍生物(由皇后蟹壳制备)；磺化多糖肽聚糖络合物(SP的-PG)(该化合物的功能可能由类固醇如雌激素，和他莫昔芬柠檬酸盐的存在而增强)；星形孢菌素；基质代谢调节剂，包括例如，脯氨酸类似物、顺式羟脯氨酸、d，L-3，4-脱氢脯氨酸、硫代脯氨酸、α，α-联吡啶、氨基丙腈富马酸；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-恶唑酮；甲氨蝶呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；2-巨球蛋白-血清；ChIMP-3；抑凝乳蛋白酶素；环糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素；硫代苹果酸金钠；抗胶原酶-血清；α-2-抗纤维蛋白溶素；比生群(国家癌症研究所)；氯苯扎利二钠(N-(2)-羧苯基-4-氯氨茴酸二钠)、沙利度胺；Angostatic类固醇；AGM-1470；羧基氨基咪唑；和金属蛋白酶抑制剂如BB94。

在某些实施方式中，其他治疗药剂可以是生长因子或影响细胞分化和/或增殖的其他分子。诱导最后分化状态的生长因子在本技术领域是公知的，并且可以选自这种已经证实诱导最后分化状态的任何因子。适用于本文中所描述方法的生长因子，在某些实施方式中，可以是天然存在的生长因子的变体或片段。

适用于本发明方法且包含细胞的组合物可以包含细胞培养基组分，例如，培养基介质包含氨基酸、金属、辅酶因子、以及小群落的其他细胞，例如，其中一些可以是由干细胞随后分化产生的。

适用于本发明且包含细胞的组合物可以，例如，通过从培养基介质沉积出受治疗者细胞并将其再悬浮于所需溶液或物质中来制备。细胞可以在培养基介质之外进行沉淀和/或变化，例如，通过离心、过滤、超滤等。

组合物可以口服、非肠道、口腔、阴道、直肠、吸入、喷洒、舌下、肌肉注射、皮下注射、局部外用、滴鼻、眼内、腹腔注射、胸腔内注射、静脉注射、硬膜外腔注射、鞘内注射、脑室内注射和通过注入关节给药。

细胞和/或化合物可以，例如使用眼滴、油膏、霜剂、凝胶、悬浮液、灌注等给予至眼睛或眼睑。在另一实施方式中，利用眼内注射来治疗眼病。在一种实施方式中，细胞和/或化合物可以玻璃体内给药，在另一实施方式中，采用视网膜下注射给药，而在另一实施方式中采用视网膜内注射给药，而在另一实施方式中，采用眼周注射给药。在一种实施方式中，细胞和/或化合物可以前房内注射向前房或玻璃体给药，经由手术期间连接于插入的人工晶体植入的储药器完成。细胞和/或化合物可以采用赋形剂如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、中性聚(甲基)丙烯酸酯、和其他粘度增强剂进行配制。细胞和/或化合物可以在结膜或眼球筋膜囊(tenon囊)下注射、玻璃体内注射、或球后注射而注射到眼睛中。细胞和/或化合物可以采用缓释药物递送系统，如聚合物、基质、微胶囊或由，例如，乙醇酸、乳酸酸、乙醇酸和乳酸的组合，脂质体、硅酮、聚酸酐聚醋酸乙烯酯单独或与聚乙二醇等组合的其他递送系统进行给药。递送装置能够眼内植入，例如，在结膜下植入、在眼壁中植入、缝合到巩膜来进行长期药物递送。引入方法可以另外通过不可生物降解的装置进行提供。具体而言，细胞和/或化合物能够经由可植入的人工晶体给药。细胞和/或化合物能够涂覆在人工晶体上，通过人工晶体进行分散，或这二者同时采用。

适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水可溶的)或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉注射给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛EL(CREMOPHOREL)(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的且应该是具有易于可注射性的程度的流体。在生产和储存以及防微生物如细菌和真菌污染作用进行保存的条件下应该是稳定的。载体能够是溶剂或包含，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的分散体介质。例如，通过使用涂层如卵磷脂，在分散体情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂能够维持合适的流度。防止微生物作用能够通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、水杨乙汞等实现。等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠，也能够包含在组合物内。可注射的组合物的延长吸收能够通过在组合物内包含延长吸收的试剂如单硬脂酸铝或白明胶而实现。

无菌可注射溶液能够通过将化合物和/或细胞按照所需用量与以上所列出的成分中的一种或组合，按照所需，一起引入合适的溶剂中，接着过滤灭菌而进行制备。一般而言，分散体通过将多核苷酸引入无菌载体中而制备，其含有基本分散介质和来自以上所列出的那些中的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，合适的制备方法包括，真空干燥和冻干，这能够产生来自其先前过滤灭菌的溶液的活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗给药的目的，化合物或细胞能够用赋形剂引入而以片剂、锭剂或胶囊剂，例如，明胶胶囊来使用。口服组合物也能够采用用作漱口水的流体载体进行制备。药物相容性结合剂，和/或佐剂物质能够作为组合物部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等能够包含任何以下成分，或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素，树胶黄芪胶或白明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如褐藻酸、PRIMOGEL、或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或氢化植物油(Sterotes)；助流剂如胶状二氧化硅；甜味剂如乳糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯、或橙风味剂。

适用于鼻内给药且其中的载体是固体的制剂，包括粒径为，例如约20～约500μm的粗粉，其给药的方式中是采取鼻吸入，即，通过从储存粉末的容器向上靠近鼻子而通过鼻通道快速吸入。通过喷雾器给药而其中载体是液体的合适制剂，包括药物的水性或油性溶液。通过吸入给药，该化合物或细胞也能够按照液滴或气溶胶喷雾的形式从加压容器或包含合适推进剂，例如，气体如二氧化碳的分散器或喷雾器中来递送。这种方法包括描述于U.S.6,468,798中的那些。

系统给药也能够通过穿透粘膜或穿透皮肤的方式。对于穿透粘膜或穿透皮肤给药，在制剂中使用适合于所渗透阻隔层的渗透剂。这种渗透剂一般在本领域内是已知的，并包括，例如，用于穿透粘膜给药、洗涤剂、胆盐、和夫西地酸衍生物。穿透粘膜给药能够通过使用鼻喷雾剂、滴眼液或栓剂而完成。对于穿透皮肤给药，活性化合物配制成油膏剂、软膏剂(salve)、凝胶剂或霜剂，这一般在本领域内是已知的。

技术人员能够易于确定组合物中细胞、化合物和可选的载体的用量而根据本发明的方法进行给药。在一种实施方式中，磷酸盐缓冲盐水中存在的任何添加剂(除了活性细胞或化合物之外)的量为0.001％～50％(重量)溶液，而活性成分以微克至毫克级存在，例如，约0.0001wt％～约5wt％，优选约0.0001wt％～约1wt％，更加优选约0.0001wt％～约0.05wt％或约0.001wt％～约20wt％，优选约0.01wt％～约10wt％，且更加优选约0.05wt％～约5wt％。当然，对于任何向动物或人给药的组合物，以及对于任何具体的给药方法，优选由此进行确定：毒性，如通过在合适的动物模型，例如，啮齿动物如小鼠中测梁致命剂量(LD)和LD₅₀；以及组合物剂量，其中组分浓度和组合物给药的定时，这都引起合适的响应。这种决策，从技术人员所掌握的知识、本文中的公开内容和文中引述的文献并不需要过度实验就能完成。而且，对于按序给药的时间能够无需过度实验就能确定。

组合物中的细胞浓度可以为至少约5×10⁵个细胞/mL，至少约1×10⁶个细胞/mL，至少约5×10⁶个细胞/mL，至少约10⁷个细胞/mL，至少约2×10⁷个细胞/mL，至少约3×10⁷个细胞/mL，或至少约5×10⁷细胞/mL。

化合物可以按照每剂量约0.001～2000mg/kg体重，且更优选每剂量约0.01～500mg/kg体重。重复的剂量可以按照由主治医师开具的方药来给药。

本发明涉及组合使用细胞和中断VEGF-信号传导的化合物而治疗或预防血管发生相关的疾病。术语“与...组合”或“组合疗法”或其变体是指细胞和化合物能够同时给药，或在相同的组合物中或者在分开的组合物(例如，彼此间隔约3分钟)按照一定顺序的方式，或者按照这二者进行，以及高达几个小时、几天或几周的临时间隔次序。这种组合治疗方法也可以包括不只一种单一的给药方式。据设想，这种组合疗法可以包括在另一种药物给药之间多次给药这种治疗药物。给药之间的时间周期可以为几秒(或更短)至几个小时或几天，而这将取决于，例如，细胞或化合物的性质(例如，效能、溶解度、生物利用度、半衰期和动力学分布)以及患者的病状。

在一种实施方式中，化合物在细胞给药之前进行给药。这尤其就是如果药物结合VEGF或其受体的那种情况。在一种实施方式中，化合物在细胞给药之前约1天，3天，5天，7天，9天，或14天进行给药。

本发明的方法可以与其他用于治疗或预防眼病和/或与血管发生相关的疾病的疗法结合。这些其他疗法的性质将会取决于具体血管发生相关的疾病。例如，对于采用本发明方法治疗或预防黄斑变性，可以结合抗氧化剂和/或锌补充剂，给予哌加他尼钠(哌加他尼)，采用US 6,942,655中定义的方法、类固醇疗法和/或激光治疗法(如Visudyne^TM)。对于癌症，采用本发明方法的疗法能够与手术、放射疗法和/或化疗结合。

实施例

以下本文通过以下非限制性实施例的方式并参照附图进行描述。

按照图1提供研究设计的总结。

材料和方法

明细清单

物种            成束猴(Macaca fascicularis)

品种(strain)    食蟹猴(短尾猴，cynomolgus)

来源            PCS优选供应商

年龄            在治疗开始时为约1.5至3.5岁

体重范围        在治疗开始时为约2至4kg

组数            7

动物数量        6只雄性/组和2只备用(总计44只)

饲养

当可能时，将动物分组(2只或3只)饲养于不锈钢的笼子中，笼子装有条棍型地板和自动洒水阀。每个笼子用指示项目、分组、动物编号和刺标(tattoo)的颜色编码笼子卡清楚地标记。

每只动物通过永久性皮肤刺标进行唯一识别。动物室温和光周期的针对性条件如下：

温度        24±3℃

湿度        50±20％

光照周期    12h光照和12h黑暗(除了在指定的程序期间之外)。

膳食材料

除了在指定的程序期间之外，所有的动物都获得了标准认证的颗粒状商品化灵长类动物的食物(2050C全球认证的20％灵长类动物蛋白质饮食：Harlan)，每天两次。另外，每只动物每天按照以下任意组合而提供食物补充：Golden BananaPrima-(5g规格)和/或新鲜水果或干果以及至少每周一次的Prima-Foraging作为环境丰富计划的部分。其他水果补充在麻醉恢复之后提供以刺激食欲并维持营养。

饮食中(如重金属、黄曲霉毒素、有机磷、氯代烃类、PCB)污染物的最高允许浓度通过厂商进行控制和常规分析。市政自来水已经过软化并通过反渗透纯化并暴露于紫外光下，可以自由获取(除了在指定的程序期间之外)。可以认为，在膳食材料中不存在能够干扰研究目的的已知污染物。

组分配

治疗开始之前，采用以满足体重作为参数的基于计算机的随机化程序将动物分配到治疗组中(健康程度差的动物未配到组中)(表1)

细胞的制备

从2007年6月25日每一主批次记录(Master Batch Record)3001 MES的雌性成束猴(D.O.B.，2005年3月12日)收集的15mL骨髓吸出物分离出猿猴骨髓祖细胞-食蟹猴(smMPC-cyno)(在该实施例中也被称为MPCs)。该骨髓吸出物悬浮液经过菲柯尔(Ficoll)并冲洗而除去非成核细胞(红血细胞)。成核细胞经过计数随后通过附着于CA 12抗体(也已知为STRO-3抗体-参见WO 2006/108229)和磁性微珠(Dynalbeads)而分离。含抗体和所连接的珠的细胞通过MPC-1磁体的磁场进行阳性选择。

阳性选择的细胞经过计数并接种于T-烧瓶中在p.0下的生长培养基中。在克隆形成分析(CFU-F)中使用了预选择、阳性和阴性细胞。

表1  动物分配

·*组7并未接受任何激光治疗。

·**来尼珠单抗在激光损伤50μL的时间给药，而高剂量的MPCs在7天后给药。

smMPC-cyno细胞供给生长介质(Growth Media)。AU培养基(p.0-p.5)每2～4天被供给(feed)直至其达到所需的汇合。随后细胞采用HBSS冲洗并随后通过胶原酶作用之后进行胰蛋白酶/维尔烯作用而进行传代或收获。第一代(p.1)细胞经过计数后而接种于T-烧瓶中。当第一代(p.1)smMPC-cyno达到所需的汇合时，该细胞进行收获并采用速控冷冻机低温冷藏。

第1代的低温冷藏smMPC-cyno经过解冻而接种于T-烧瓶中(第2代(p.2))。第2代(p.2)细胞传代于第三代(p.3)的细胞工厂内。第三代(p.3)细胞收获后传代于第四代(p.4)而进入细胞工厂中。额外的第三代(p.3)细胞低温储藏。第四代(P.4)细胞在第5代(p.5)传代于6×细胞工厂。当第5代(p.5)smMPC-cyno达到所需汇合时，细胞进行收获并采用速控冷冻机低温冷藏。细胞在50％AlphaMEM，42.5％预冷冻(Profreeze)和7.5％DMSO(表2和表3)中低温冷藏。样品对于CFU-F分析、FACS、无菌度、支原体和内毒素进行测试(表4)。

表2  在p.5的低温冷藏smMPC-cyno 15897 amps

  细胞/Amp  Amps数目  体积/Amp(mL)  0.781×10⁶  32  0.5  3×10⁶  31  0.5  12.5×10⁶  32  0.5  25×10⁶  32  0.5

表3  冷冻后细胞数

表4  测试结果

测试        结果

                                       

CFU-F分析   5.84倍CA 12+增加

CA12        3.3％@p.2，0％@p.5

CC9         95.6％@p.2，90.0％@p.5

AIk Phos    12.2％@p.2，8.0％@p.5

CD45        0％@p.2，0.5％@p.5

无菌度：    阴性

支原体：    阴性

内毒素：    ＜0.05EU/mL

低温冷藏smMPC-cyno和人MSC(huMPC)经过解冻而沿着成软骨、成脂和成骨途径接种于对人MPC分化进行优化的分化分析中。成脂分化和体外矿化分别通过油红O(Oil-Red-O)和细胞茜素红(Alizirin Red)染色进行评价。

与其huMPC配对物(counterpart)一样，smMPC能够完成成脂分化(数据未显示)。sm和huMPC的第18天培养用油红O染色而确定脂肪细胞的存在。smMPC的P1和P5培养基当在成脂培养基条件下培养时都栖息了许多脂载脂肪细胞。

在成骨培养基的第21天之后，细胞用细胞茜素红(Alizirin Red)染色。成骨分化通过形成染红的矿物而证据确凿。与huMPC一样，smMPC拥有成骨潜力。

激光诱导脉络膜血管新生

在测试制品给药的同一天实施激光诱导的脉络膜血管新生(CNV)。这些动物在实施这个方案之前断食过夜。

在实施这个方案之前，将散瞳眼滴(1％散瞳剂)施用于双眼。这些动物在用异氟烷/氧麻醉之前接受肌内注射胃长宁、氯胺酮和甲苯噻嗪的镇静鸡尾酒(cocktail)治疗。在麻醉后，围绕每只眼的斑点(macula)(不在其内)采用810nm二极管激光作出9-点图案(9-spot pattern)，该激光初始功率设置为250～300mW而持续时间0.1s。在其中布鲁赫膜(Bruch′smembrane)破裂并不能对特定的点证实的情况下，适当考虑通过兽医眼科医师添加其他的点。

在该方案期间眼睛水合作用采用盐水溶液维持。任何显著的事件，如视网膜出血都对于每个激光点(spot)记录在案。

测试制品的给药

在激光处理之时给药Lucentis^TM(0.5mg/mL，0.3mL/瓶；NovartisCanada)，而接受MPCs+来尼珠单抗(Lucentis)的组在激光损伤之后用MPCs给药7天。双眼都施用外用眼科抗生素(艮他霉素)，治疗处理之前的那天给药两次，在紧接最后的注射之后，而在注射之后那天实施2次(AM和PM)。在其中激光治疗处理之前仅仅实施一次注射的情况下，则在激光治疗处理之后施用抗生素。

结膜用无菌水稀释(U.S.P.～1∶10,000(v/v))的苯扎氯铵(Zephiran^TM)冲洗。在Zephiran^TM前后双眼实施局麻(丙美卡因，0.5％)。对每次注射采用新的注射器，采用30-规格，1/2英寸针头。50μL载体，测试制品细胞悬浮液和/或来尼珠单抗双重给药。双眼在治疗处理之后立即检测(间接和/或直接检眼镜检查法和/或裂隙灯生物显微镜)而记录由于注射过程产生的任何异常性。

眼评价

眼科学

在第2天、第14天、第26天、第34天和第40天时动物进行眼科学评价。

所用的散瞳药是1％的散瞳剂。为了进行检测而对动物进行镇静处理。镇静剂，HCl的注射，U.S.P.，在合适的禁食时间之后通过肌肉注射给药。

检测时通过一个委员会认证的兽医眼科医师进行实施，首先不用散瞳剂(仅仅用裂缝灯等)而随后在散瞳给药之后重复进行(裂缝灯和/或直接和/或间接检眼镜检查)。对于每一只动物预处理，作为通过兽医眼科医师在眼科检查时所考虑的必要而拍摄眼睛的眼底照片。

眼压测定

眼内压(IOP)在眼科检查之后进行测定(除了给药后立即检查之外)。在测定之前实施眼睛局部外用麻醉(Alcain，0.5％)。采用Tono-Pen XL^TM或TonoVet进行测定。在整个研究过程中都采用相同的仪器类型。

视网膜电流图描述术

在所有动物上于第27天和41天一旦预处理后就进行视网膜电流图记录。在ERG记录之前动物都进行黑暗适应至少30分钟。这些动物接受肌内注射的胃长宁，氯胺酮和甲苯噻嗪的镇静鸡尾酒。在测试之前每只眼施用散瞳剂(1％)约5至10分钟。眼睑通过在每只眼的表面上放置眼睑诊视器和接触晶状体电极的方式缩回。针状电极小心地放置于每只眼(参比)之下和头部之上，眉毛之后(接地)。在将接触晶状体电极放置于眼睛上之前，用羧甲基纤维素(1％)滴眼液施用于接触晶状体电极的内部表面上。

每个ERG时刻包括以下系列暗视单闪刺激：

1)-30dB单闪，5次单闪的平均值，每次闪光之间10s间隔。

2)-10dB单闪，5次单闪的平均值，每次闪光之间15s间隔。

3)0dB，2次单闪的平均值，每次闪光之间120s间隔。

接着记录暗视相应，这些动物在约5min的时间内适应约25～30cd/m2的背景光，接着进行1Hz下20次扫描的光适应白光闪烁，随后在29Hz下20次扫描的光适应闪烁。

荧光素血管造影术(除了第7组以外)

在辐照前(once predose)和在第15天、第28天、第35天和第42天时获得荧光素血管造影(FA)。在合适的禁食时间之后，动物接受异丙酚静脉注射并随后插管。

在测试之前约5～10min，对每眼实施散瞳剂(1％)。眼睑通过放置眼睑诊视器的方式缩回。眼睛水化作用通过用盐水溶液频繁刺激而维持。1mL 10％的荧光素钠迅速静脉注射而同时以电影模式对右眼的填充(filing)录像约20s。在荧光素注射之后对双眼录制静态图像约2min和10min。定性评价填充序列。对静态图像上单个激光点半定量地按1～4级评价渗漏。

统计分析

在1～4组(仅仅主研究)的研究实施期间获得的数字数据进行组平均值和标准偏差计算。对于所关注的每一参数(除了ERG，眼压和FA之外)，组方差采用Levene检验以0.05的显著性水平进行比较。当组方差之间的差异发现并不是显著性的时，实施单向方差分析(ANOVA)。当ANOVA(p＜0.05)显示出平均值之间显著性差异时，则利用Dunnett t检验而实施对照组和每一治疗处理组之间的组平均比较。

当Levene检验显示异质组方差(p＜0.05)时，采用克(鲁斯卡尔)-瓦(利斯)二氏检验(Kruskal-Wallistest)比较所有所考虑的组。当克(鲁斯卡尔)-瓦(利斯)二氏检验具有显著性(p＜0.05)时，则对照组和每一检验组之间差异的显著性采用Dunn检验进行评价。数据基于单个基础进行评价，并计算其中合适的组平均和标准偏差。

对于所关注的每一成对组比较，显著性按照0.05、0.01和0.001的水平来报告。

结果

图2A示出了在激光凝固之后晶状体注射之后第42天的荧光素血管造影术结果，其中以抗-VEGF单克隆抗体(来尼珠单抗，0.5mg/50μL)、或以低(78,100细胞/50μL)、中(312,500细胞/50μL)或高(1,250,000细胞/50μL)浓度单剂量给药的异源MPC注射于非人灵长类动物眼睛中。在晶状体内注射后第42天，血管渗漏。新血管发生的程度是相当的，而在任何组中并没有显著差异。

图2B示出了激光凝固后立即晶状体内注射来尼珠单抗(0.5mg/50ul)给药7天后以最高浓度(1,250,000细胞/50μL)另外晶状体内注射异源MPCs，在第42天产生显著降低的平均荧光素血管造影术评分，证实了组合的协同效应(p＝0.03)。

采用10％的荧光素钠的荧光素血管造影术(FA)迅速静脉注射并在给药之后约2～5min收集每只眼的静态图像。对接受激光凝固的每一斑点(spot)采用1～4的半定量分级评分评价第42天时血管造影术的渗漏情况。

在激光凝固(下面板)后给予来尼珠单抗(0.5mg/50ul)7天后给予最高浓度(1,250,000细胞/50μL)的异源MPCs组合治疗，相比于在仅仅来尼珠单抗组中在超过15天的所有时间点所见的许多评分为4级的严重渗漏血管(图3)，导致在研究的所有时间点(第15天、第28天、第35天和第42天)完全防止渗漏血管的最严重形式(第4级评分)。

当分析所有严重损伤(第3组或第4组严重性的损伤)时，在激光凝固(下图)后给予来尼珠单抗(0.5mg/50ul)7天后接着给予最高浓度(1,250,000细胞/50μL)的异源MPCs组合治疗，相对于仅仅给予来尼珠单抗，表明降低了所有时间点的渗漏血管的严重度(图4)。这种效应在第42天在研究总结时是最显著的，表明协同效应的长期受益。

相比于仅接受晶状体内注射介质的对照，来尼珠单抗治疗被发现在第15天降低第4级严重血管渗漏是优异的(图5)。这种效应超过第15天就逐渐消失，推测这可能反映了这种抗体的半衰期较短。相比而言，在激光凝固伤害后来尼珠单抗与第7天最高剂量异源MPC的组合完全防止了研究期间整个42天的任何第4级的严重血管损伤。这些结果表明，异源MPC加到来尼珠单抗中将抗VEFG疗法对血管渗漏的短暂效应转换为长期的持久效应。

在激光引起光凝固伤害后来尼珠单抗给药7天后给予最高剂量异源MPC的组合，相比于对照或仅仅接受来尼珠单抗的动物，导致在整个研究周期内低级(第1级)渗漏血管的数目增加(图6)。这表明，组合疗法防止了低严重度血管向高严重度血管发展，这种早期所见效应维持了整个研究期。

在第42天的组织病理学分析表明，组合疗法相对于每一其他测试组显著降低了视网膜脱离的发生(p＜0.01)(图7)。在接受在激光引起光凝固伤害后立即来尼珠单抗(0.5mg/50ul)给药7天后给予最高浓度(1,250,000细胞/50μL)的异源MPCs的组合疗法的动物中仅仅1/12观察到视网膜脱离。相比而言，对照组为7/12，仅仅用高剂量MPC治疗的组为8/12，而仅仅用来尼珠单抗治疗的组为7/12。

相比于所有接受激光凝固的动物中视网膜脱离的高发生率(37/72，51％)，接受激光引起凝固伤害后立即给予来尼珠单抗(0.5mg/50μL)7天后给予最高剂量(1,250,000细胞/50μL)异源MPCs的组合疗法的动物中仅仅1/12出现视网膜脱离(p＜0.01)(图8)。这些结果表明，组合疗法将与激光凝固引起的血管新生相关的视网膜脱离风险降低后退至单独采用晶状体内注射方法所见的基线水平。

本领域技术人员应该理解到，对于如具体实施方式中所示的本发明可以作出许多变化和/或修改，而不偏离按照广泛描述的本发明的精神或范围。因此，本发明的具体实施方式应该按照所有方面当作示例性的而非限制性的。

以上讨论的所有出版物都以其全文结合于本文中。

本申请要求享有2008年6月30提交的AU 2008903349和2008年6月30日提交的US 61/133,607的优先权，其全部内容结合于本文中作为参考。

任何已经包含于本申请文件内的那些文献、法令、材料、仪器、制品等的说明都仅仅是为提供本发明的内容为目的。不应该因为这些在本申请每一权利要求的优先权日期之前已经存在而将这些中的任何或所有认为是构成现有技术基础的部分或是本发明相关领域内共同的一般知识。

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