混合奶牛性控冻精产品鉴定和检测方法

摘要

一种混合奶牛性控冻精产品鉴定和检测方法，属于动物生殖生物技术，混合奶牛性控冻精产品的鉴定方法包括奶牛性控冻精解冻、镜检，解冻后30分钟内，能观察到显示荧光的分离精子和未染色的异种动物混合精子，确认为混合奶牛性控冻精；依据造成动物性别差异的XY性染色体DNA特异性差异鉴定奶牛分离精子以外的混合精子种类；混合奶牛性控冻精产品中奶牛分离精子活力、奶牛分离精子总数、混合精子总数的检测。本发明简便地鉴别混合奶牛性控冻精产品，客观地检测混合性控冻精中分离精子各项质量指标。

说明书

技术领域

本发明属于动物生殖生物工程新技术，主要提供一种混合奶牛性控冻精产品鉴定和检测方法。

背景技术

奶牛精子分离-性控技术从2000年产业化以来，目前已经在全世界十余个国家推广应用。但是，该技术存在的主要问题是生产效率低、产品成本较高，是限制该技术大规模推广应用的关键因素。目前，已经开发出以异种动物混合精子为基础的奶牛低剂量性控冻精生产专利新技术，专利名称：一种低剂量家畜精液及生产方法和应用，专利号：CN 2006100149168，使该技术生产效率大幅度提高。为了在市场上鉴别混合奶牛性控冻精产品，同时更客观地检测混合性控冻精中分离精子的各项质量指标，研究开发了该项技术。

发明内容

本发明提供一种混合奶牛性控冻精产品鉴定和检测方法，该技术原理是利用奶牛分离精子已经荧光染色的特点，解冻后30分钟内分别在荧光和自然光源显微镜下观察精子，根据精子头部颜色显示，来确定该产品是否为混合奶牛性控冻精，同时采用动物精子特异性抗体染色技术，可以鉴定奶牛分离精子以外的混合动物精子种类；并且通过荧光和自然光显微镜检测出该混合性控冻精的奶牛分离精子活力、奶牛分离精子总数，混合精子总数各项质量指标。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种混合奶牛性控冻精产品鉴定和检测方法，其特征在于：它包括混合奶牛性控冻精产品的鉴定方法和混合奶牛性控冻精产品的检测方法，其中：

(2)混合奶牛性控冻精产品的鉴定方法，它包括以下步骤：

1)奶牛性控冻精解冻：取1支规格为0.25ml细管在液氮中保存的奶牛性控冻精产品，迅速放入37℃温水浴中，精液从液氮罐取出到放入水中的时间不得超过10秒，待精液全部融化后将细管中精液转置于1.5ml离心管，放入37℃水浴锅温浴5分钟；

2)混合奶牛性控冻精产品鉴定和确认：同时打开显微镜荧光和自然光，调节光的强度和焦点，达到通过显微镜滤色镜控制可以分别观察染色精子和未染色精子的状态，预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟以

(2)混合奶牛性控冻精产品的鉴定和确认：同时打开显微镜荧光和自然光，调节光的强度和焦点，达到通过显微镜滤色镜控制可以分别观察染色精子和未染色精子的状态，预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟以上，用移液器从(1)中的离心管中取15μl产品滴在准备好的载玻片上，压片后置于荧光显微镜下镜检，在此视场中，染色精子头部呈现蓝色荧光，未染色精子显示灰色，解冻后30分钟内，如能观察到未染色精子，确认该产品为混合奶牛性控冻精，如图1所示，显示蓝色荧光的为分离牛精子，显示深灰色自然光的为羊精子；

(3)奶牛分离精子以外的动物混合精子种类鉴定：

以山羊精子为例，混合山羊精子的奶牛性控冻精的鉴定方法是：

选择Y染色体特异性DNA探针G-SRY(Berta et al.Nature，1990，348：448-450，Koopman et al.Nature，1991，351：117-121)作为鉴定基础，取一剂细管性控冻精，置37℃水浴解冻，推入1.5ml试管中，超声波10s除去精子尾部后，用PBS磷酸缓冲液离心清洗3次；取10ul精子头部样品加到载玻片上，用精子固定液0.05％Formalin固定处理10min，然后用山羊精子特异性DNA探针G-SRY探针，在37℃下与精子头部进行杂交，遮光处理4小时，杂交遮光处理后，依次用一级荧光抗体染色处理20min，处理后的载玻片用清水轻轻冲洗后滴封片油，盖上盖玻片后，在荧光显微镜下检测并统计具有黄色杂交点的精子数，如果发现在UV蓝色荧光的分离精子以外的精子具有约50％的精子有黄色杂交点，说明这个牛性控冻精产品中混合的精子品种为山羊精子，如果没有黄色杂交点的精子，可以选择其它动物的特异性DNA探针，采用同样方法进行鉴定，直到发现黄色杂交点为止，来确定混合精子的动物品种。

实施例2：本实施例是以国际通用的1支规格为0.25ml混合冻精为例，每剂混合冻精中0.2ml混合冻精，计数板容量为0.1μl；性控冻精冷冻液为Tris碱冷冻平衡液A和B，Tris碱冷冻平衡液A和B的比例为1∶1，

Tris-冷冻平衡液A：PH＝6.8，其组成为：

TRIS三羟甲基氨基甲烷    291.7mM

柠檬酸                  95.1mM

果糖                    70.2mM

卵黄                    20％

超纯水；

Tris-冷冻平衡液B：PH＝6.8，其组成为：

TRIS三羟甲基氨基甲烷      291.7mM

柠檬酸                    95.1mM

上，用移液器从离心管取产品滴在准备好的载玻片上，压片后置于荧光显微镜下镜检，在此视场中，染色精子头部呈现蓝色荧光，未染色精子显示灰色；解冻后30分钟内，如能观察到未染色精子，确认该产品为混合奶牛性控冻精；

3)奶牛分离精子以外的混合精子种类鉴定：奶牛分离精子以外的混合精子种类鉴定，其方法是：制备奶牛以外的可能用于精子混合使用动物品种的特异性DNA分子探针(参考文献1：Hassanane M等，Molecular Reproductionand Development，1999，53：407-412；参考文献2：Hamano K，Li X等，Journalof MammOvaRes，2001，18：81-88)，与冻精产品的精子进行分子杂交处理，通过检测精子中有无精子显示特异性荧光杂交点来判别混合动物精子的种类；

(2)混合奶牛性控冻精中奶牛分离精子活力、奶牛分离精子总数、混合精子总数检测方法，它包括以下步骤：

1)奶牛分离精子活力检测，它包括以下步骤：

用移液器从离心管取解冻后的混合奶牛性控冻精，滴在准备好的37℃加热载玻片上，压片后置于UV光源荧光显微镜下，选择压片均匀的样品区域观察，分别计数显示蓝色荧光的活精子数和死精子数，计算分离精子活力＝活分离精子数/活分离精子数与死分离精子数的和；

2)奶牛分离精子总数和混合精子总数检测，它包括以下步骤：

取部分解冻混合奶牛性控冻精样品，用福尔马林溶液固定稀释后滴在血球计数板上，在UV荧光显微镜下计数带有荧光的分离精子总数，并计算出每剂冻精中分离精子总数；再把显微镜调至自然光下，在自然光下计数总精子数，并计算出每剂冻精中总精子总数。

本发明的有益效果是：1、可以简便地鉴别市场上混合奶牛性控冻精产品，同时更客观地检测混合性控冻精中分离精子的各项质量指标。2、本发明还可同时鉴定奶牛分离精子以外的混合精子种类，包括牛、羊、猪、鹿、马和驴。3、因为混合奶牛性控冻精为新产品，目前还没有针对该产品检测和鉴定的惯用方法，该发明是依据造成动物性别差异的XY性染色体DNA特异性差异设计的检测和鉴定方法，目前还没有与其他方法的可比性。

附图说明

图1是解冻30分钟内的混合冻精扫描电镜图。

具体实施方式

实施例1：一种混合奶牛性控冻精产品的鉴定方法，它包括以下步骤：

(1)奶牛性控冻精解冻：取1支规格为0.25ml细管在液氮中保存的奶牛性控冻精产品，迅速放入37℃温水浴中，精液从液氮罐取出到放入水中的时间不得超过10秒，待精液全部融化后，将细管中精液转置于1.5ml离心管，放入37℃水浴锅温浴5分钟；

果糖    70.2mM

卵黄    20％

甘油    12％

超纯水；

一种混合奶牛性控冻精产品中分离精子活力、分离精子总数和混合精子总数的检测方法，其中：

(1)分离精子活力检测，它包括如下步骤：预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟以上，用移液器从实施例1中解冻后经确认为混合奶牛性控冻精产品的离心管中取15μl样品滴在准备好的载玻片上，压片后置于荧光显微镜下镜检，打开荧光显微镜，选择UV光源，同时选择压片均匀的样品区域观察，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数显示蓝色荧光的活精子数和死精子数，计算分离精子活力＝活分离精子数/活分离精子数与死分离精子数的和；

以1支规格为0.25ml混合冻精为例，解冻后，镜检，各质检指标计算方法如下：观察5个视野后，各视野精子数(单位：个)：

  活分离精子数  26  25  17  15  25  108  死分离精子数  18  13  10  16  12  69

该批分离精子活力＝108/(108+69)*100％＝61％；

(2)奶牛分离精子总数和混合精子总数检测，它包括以下步骤：按照实施例1中的方法解冻0.25ml规格的混合冻精，取50ul混合精液，用950ul的福尔马林溶液20倍稀释后滴在血球计数板上，置于显微镜自然光下计数总精子数为(单位：个)：106、100、98、96、109，平均数为101.8，即该批次产品总精子是：101.8*20*10000＝2036万/ml，每支产品的混合精子总数为2036/5＝407万/剂；再在显微镜UV光下用血球计数板计数荧光分离精子总数为(单位：个)：25、28、27、28、27，平均数为27，即该批次产品分离精子密度是：27*20*10000＝540万/ml，每支产品的奶牛分离精子总数为：540/5＝108万/剂；

因为混合奶牛性控冻精为新产品，目前还没有针对该产品检测和鉴定的惯用方法，该发明是依据造成动物性别差异的XY性染色体DNA特异性差异设计的检测和鉴定方法，目前还没有与其他方法的可比性。本发明可同时鉴定奶牛分离精子以外的混合精子种类，包括牛、羊、猪、鹿、马和驴。