一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法

摘要

本发明涉及一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法。该方法将Bt基因连接到原核表达载体pET-28B上，将含有Bt基因的原核表达载体转入大肠杆菌BL21中，进行诱导表达Bt蛋白，提取诱导表达出的Bt蛋白，将此Bt蛋白拌入玉米螟幼虫人工饲料中喂养玉米螟幼虫，数天后统计玉米螟幼虫的死亡率和生长状况。该方法操作简单，快速，不受时间和季节限制、经济成本低，能快速地进行Bt蛋白抗虫鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringHansis）。它在芽孢形成过程中产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。其作用原理为这种抗虫蛋白能被碱性肠液溶解，水解为更小的活性毒素片段—核心片段（Hofte和Whiteley,1989）。该活性片段能抗蛋白酶的进一步水解，被激活的蛋白质结合在昆虫肠道上的刷状小泡上，引起穿孔从而影响渗透平衡，细胞膨胀并溶解，靶标生物停止取食并最后死亡。研究表明许多靶标害虫的肠道上皮细胞都具有Bt蛋白高亲和性的结合位点（Hofte和Whiteley,1989）。苏云金芽孢杆菌因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用基因工程技术将外源抗虫基因Bt导入玉米，使玉米自身产生抗虫蛋白而达到抗虫的目的。

利用基因工程技术将外源抗虫基因Bt导入玉米，得到的转基因苗进行抗虫性鉴定是最直接的抗虫鉴定方法。但是因为转基因整个周期比较长，如果克隆、或改造的Bt基因抗虫性较差，不但浪费人力、物力，更是影响了实验进程。因此如何快速有效地检测Bt基因的抗虫性鉴定，对于Bt蛋白的应用具有重要的实用价值。Bt蛋白的体外抗虫鉴定技术成为首要解决的问题。

Bt蛋白的体外抗虫鉴定的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术依据苏云金杆菌的杀虫活性主要是由杀虫蛋白基因型和产生的伴孢晶体的量所决定的，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出Bt蛋白的含量，测定Bt蛋白的含量，也能指示该蛋白相应的毒力活性。但是该方法只是能检测出Bt蛋白含量，Bt蛋白实际效果最终还是要进行生物测定，才能准确鉴定出Bt蛋白的抗虫性。

另外，如何获得大量的实验虫源是进行Bt蛋白体外鉴定的基础，1980年周大荣等研发了亚洲玉米螟半人工饲料-新7号饲料，其后宋彦英等用代号为JSMD的物质取代新7号饲料中的琼脂取得成功，同时研究亚洲玉米螟的一些学者，在饲养亚洲玉米螟时也对饲料配方进行了一些改进。然而现有这些玉米螟人工饲料仍有改进的必要，以获得一致性较好的标准试虫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，该方法操作简单，快速，不受时间和季节限制、经济成本低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

将Bt基因连接到原核表达载体pET-28B上，将含有Bt基因的原核表达载体转入大肠杆菌BL21中，进行诱导表达Bt蛋白，提取诱导表达出的Bt蛋白，将此Bt蛋白拌入玉米螟幼虫人工饲料中喂养玉米螟幼虫，数天后统计玉米螟幼虫的死亡率和生长状况。该方法操作简单，快速，不受时间和季节限制、经济成本低，能快速地进行Bt蛋白抗虫鉴定。

一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，包括以下步骤：

（1）将待鉴定的Bt基因克隆进原核表达载体PET-28B中；

（2）将含有Bt基因的原核表达载体PET-28B转入大肠杆菌BL21中；

（3）诱导培养含Bt基因的大肠杆菌BL21产生Bt蛋白；

（4）收集分离上步所得菌体，加溶菌酶后破碎菌体，分离提取BT蛋白；

（5）以玉米螟为受试昆虫，将上步提取的Bt蛋白掺入玉米螟饲料中，饲喂试验组玉米螟，同时分别以蒸馏水、含空原核表达载体的大肠杆菌BL21菌液掺入玉米螟饲料中饲喂对照组玉米螟，同样的条件下饲养8～10天后统计死亡率和虫体重量，进而确定Bt蛋白的杀虫效果。

在所述步骤（3）中，诱导产生Bt蛋白的具体方法如下：

（1）在无菌环境下，用接种环沾取少量含有Bt基因原核表达载体的大肠杆菌BL21菌液在含有卡那霉素的LB平板上划线分离单菌落；划线后将LB平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养；

（2）无菌环境下，挑取上步所得大肠杆菌BL21单菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜；

（3）将菌液以1：100接种到含卡那霉素的LB液体培养基中摇动培养，培养至OD₆₀₀=0.5；

（4）在OD₆₀₀已经达到0.5时加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时；

（5）收集诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体。

在所述步骤（3）中，按如下方法提取Bt蛋白；

（1）收集上步诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体；

（2）在收集的菌体中加入裂解缓冲液重新悬浮，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30分；

（3）超声波破碎菌体，4000rpm离心10分，收集上清。

在所述步骤（5）中，按如下方法喂养玉米螟：

（1）在26～28℃，相对湿度70%的环境条件下孵化玉米螟虫卵；

（2）孵化的玉米螟幼虫在26～28℃、相对湿度70%条件下进行人工饲养，饲喂人工饲料。

本发明还对玉米螟人工饲料进行了改进，使整个人工饲料营养成分，饲料的软硬程度，刚好适合玉米螟的生长。因为玉米螟喜甜，在配方中添加少量甜度高于葡萄糖的蔗糖，增加了饲料的甜度，更适合玉米螟的生长。以重量份计，所述人工饲料可由下述A、B、C、D四组原料制成：

A：大豆面12份，玉米面12份，酵母粉7.2份；

B：葡萄糖 6份，蔗糖 1份，Vc 0.4份，水36份或含待鉴定Bt蛋白的上清液36份；

C：玉米粉3.2份，水8份；

D：琼脂1.2份，山梨酸0.4份，水48份；

先将A组中的三种原料混匀混合；将B组中的葡萄糖、蔗糖、Vc混合后加入36份水中；取另一容器将C组原料混合均匀；再将D组中的琼脂1放入48份水中，加热至沸腾后加入将混匀的C组原料，随后加入山梨酸，再等其降温至50℃时加入混合后的A、B组混合物，搅拌均匀，待凝固后切成长条使用。

本发明具有积极有益的效果：

1．本发明方法中使用pET-28B表达载体，该载体属于Novagen的 pET系列；该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA聚合酶识别的 T7启动子之下，因此在加入 T7 RNA聚合酶之前几乎没有表达发生；克隆到 pET载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定；重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5控制的 T7 RNA聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导表达；T7 RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达，诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50%。

2．本发明中方法中采用BL21（DE3）表达菌株，该菌株是蛋白原核表达的常用菌株，优点在于缺失 lon和 ompT蛋白酶；T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上，可以高效表达外源基因，在适当诱导条件和可大量表达可溶行蛋白，并可保持外源基因产物完整性和生物活性。

3．本发明还进一步改进了供试昆虫的人工饲料，不受季节性和不必更换饲料的限制和不易发霉、变质、变干, 及在饲养过程中可以少换或不换饲料等特点, 管理十分方便,使大规模工厂化生产成为可能；而且在配方中出去甲醛后，没有特殊的气味，幼虫可以正常取食，对人身体没有任何危害，整个配方中所加水分量适中，使整个人工饲料软硬程度，刚好适合玉米螟的生长。玉米螟喜甜，在配方中添加少量甜度高于葡萄糖的蔗糖，增加了饲料的甜度，更适合玉米螟的生长。

附图说明

图1为改造合成的Bt基因，大小为1848bp；Marker为SM331(购自上海生物工程有限公司)；

图2为原核载体pET28b-Bt酶切鉴定图谱；表明Bt基因已经构建到原核表达载体上；Marker为SM331(购自上海生物工程有限公司)。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。

实施例一  一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，包括以下步骤：

（1）将改造合成抗虫基因Bt（图1）克隆到原核表达载体pET-28B中（购自上海生物工程有限公司）；具体方法如下： 

第一步：用限制性内切酶酶切pUCbt，凝胶回收试剂盒回收纯化Bt片段；

第二步：用相同限制性内切酶酶切pET28b，凝胶回收试剂盒回收纯化酶切过的pET28b片段；

第三步：将两个纯化后的片段进行连接反应，构建所得原核表达质粒命名为pET28bbt，用限制性内切酶进行酶切鉴定，表明载体构建正确（图2）；

（2）将含有Bt基因的原核表达载体PET-28B转入大肠杆菌BL21中（购买自上海生物工程有限公司）；

（3）诱导产生Bt蛋白：

①将大肠杆菌BL21（含有Bt基因原核表达载体）原液从-80℃环境中取出，放在冰上冻融。待菌液融化后，在超净台里用接种环沾取少量菌液在含有卡那霉素的LB平板上划线分离单菌落（注意无菌操作）；划线后将LB平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养；

②在超净台内，用10μl白枪头挑取大肠杆菌BL21单菌落于5ml LB（含卡那霉素）液体培养基中，37℃摇动培养过夜；

③将菌液以1：100接种到500ml LB（含卡那霉素）液体培养基中摇动培养，培养至OD₆₀₀=0.5（摇动培养需要一定空间，可把500ml LB分到两个500ml 锥形瓶中，每个500ml锥形瓶分装250ml LB）；

④在OD₆₀₀已经达到0.5时加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时。

（4）提取含有Bt蛋白：

①收集诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体；

②在收集的菌体中加入36ml裂解缓冲液（2mM Tris-HCl、0.2mM CaCl₂ PH=8)                                                                      重新悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30分；

③超声波破碎菌体（破碎参数：工作10S，间隔5S，次数40，注意破碎时冰浴，若不冰浴，超声波时使蛋白溶液温度过高，破坏蛋白结构），4000rpm离心10分，收集上清，此上清中含有Bt基因表达出的蛋白。

（5）Bt蛋白抗虫鉴定

1）以玉米螟为供试虫，以下述改进的人工饲料饲喂玉米螟：

包括4组原料成分：

A：大豆面12g，玉米面12g，酵母粉7.2g；

B：葡萄糖6g，蔗糖1g，Vc0.4g，水36ml；

C：玉米粉3.2g，水8ml；

D：琼脂1.2g，山梨酸0.4g，水48ml；

将A组中大豆面、玉米面、酵母粉三成分放一容器混匀；将B组中的葡萄糖、蔗糖、Vc混合后加入36ml水中；取另一容器将C组各成分混匀；将D组中的琼脂加入48ml水，微波炉加热至沸腾后，加入混匀C组原料，再加入山梨酸，等上述混合物料凉至50℃时加入A+B的混合物，搅拌均匀后倒入饭盒盖中，待凝固后切成长条使用。

上述改进后的玉米螟人工饲料经济成本低，并且整营养成分更为均衡，饲料的软硬程度更加适合玉米螟的生长；因玉米螟喜甜，在配方中添加少量甜度高于葡萄糖的蔗糖，增加了饲料的甜度，更有利于玉米螟的生长。

2）方法步骤

①分别依次以上步所得含Bt蛋白的上清、灭菌水、空白载体PET-28B的大肠杆菌BL21菌液替代玉米螟人工饲料中B组的水，配制出相应的人工饲料；

②取30支试管，分成三组，每组10支（高温高压灭菌后使用），其中一组放入含有Bt蛋白的玉米螟人工饲料，另两组分别放入上述含空原核表达载体PET-28B的玉米螟人工饲料和以灭菌水配制正常的玉米螟人工饲料。

③取刚孵化出的玉米螟幼虫接入试管，每个试管随机接种10头，每个处理共100头（接虫时，挑取那些离孵化地点远的幼虫，这样的幼虫强壮、生活力旺盛），然后将各试管放入组培室中饲养，培养环境条件如下：

玉米螟虫卵放在26～28℃，相对湿度70%左右的环境中就可以孵化，孵化大概需要3天左右时间，如果见虫卵中有黑点（此时虫卵俗称“黑头卵”）冒出，要注意了，幼虫马上就会钻出卵壳。

玉米螟幼虫人工饲养需放在26～28℃，相对湿度70%左右的环境中培养。本实验采用在试管中饲养，用棉塞堵口，棉塞可透气又能防止幼虫咬嗑而逃逸，影响统计结果。试管放在28℃组培室中培养，可在试管附近增设个加湿器以保证相对湿度。

3）统计结果分析

通过统计用上述方法饲养8天后玉米螟死亡率和虫体重量，通过生物学统计分析可以判断待鉴定Bt蛋白的抗虫性；同时以清水和空载体pET28b大肠杆菌BL21菌液为对照，也可以看上述人工饲料对玉米螟饲养的效果，见表1。

结果分析表明：Bt原核表达载体表达的蛋白具有很好好的杀虫效果，玉米螟死亡率达到90.67%，而且对玉米螟的生长有明显的抑制作用，活虫单只虫重仅有0.1610，说明种这种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法确实能快速检测Bt蛋白抗虫性，而且方法操作简单，快速，不受时间和季节限制、经济成本低，因此本发明方法可以快速有效地检测Bt基因的抗虫性鉴定，对于Bt蛋白的研究应用具有重要的实用价值。

另外以本发明的人工饲料进行玉米螟饲养，结果发现：本发明的人工饲料适合玉米螟的生长。

 

表1 Bt蛋白原核表达产物体外抗虫鉴定结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。