用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒

摘要

一种用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶IV的RNA干涉序列及重组干涉质粒，其主要内容是：设计并筛选出岩藻糖基转移酶I和IV的各7条FUT1/FUT4 SiRNA模板的DNA序列，分别以RNA干涉载体(pSilencer-4.1-CMV neo)的多克隆特异酶切位点为基础构建7个FUT1和7个FUT4的重组干涉质粒，并应用这些干涉质粒作为抗肿瘤药物。这些干涉质粒具有明显的抑制肿瘤生长的作用，是一种高效、安全、经济的肿瘤基因治疗模式。

说明书

本申请是<用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I和IV的RNA干涉序列及重组干涉质粒>申请号200710010099.3，申请日2007年01月15日的分案申请。 

技术领域本发明涉及一种特异的DNA序列及根据该序列构建的重组干涉质粒。 

背景技术恶性肿瘤是一种较为难治的疾病，尚无理想的治疗方法。目前，对肿瘤的治疗策略主要是采取外科手术、放射治疗和化学治疗等综合手段，但每一种方法仍具有局限性并可产生一定程度的毒副作用。 

发明内容本发明的目的在于提供一种依据肿瘤特异糖抗原合成及肿瘤生长、浸润、转移等分子机制所构建的，用于抑制LeY肿瘤寡糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I和IV的RNA干涉序列及重组干涉质粒。本发明主要是：应用RNAi(RNAi，RNA interference)技术以肿瘤的特异糖抗原为靶位点，抑制细胞表面Lewis Y(LeY)肿瘤寡糖抗原的合成。LeY分子结构为Fucα1→2Galβ→4(Fucα1→3)GlcNAc)，即通过设计并合成LeY肿瘤寡糖抗原的关键酶岩藻糖基转移酶I(Fucosyltransferase I，简称FUT1)和岩藻糖基转移酶IV(Fucosyltransferase IV，简称FUT4)基因的干涉序列，并采用分子克隆重组技术构建重组FUT1干涉质粒(pSilencer-4.1-FUT1SiRNA)和重组FUT4干涉质粒(pSilencer-4.1-FUT4SiRNA)，用于抗肿瘤药物应用。 

本发明的技术方案如下： 

1.设计并合成FUT1和FUT4基因的干涉序列 

应用DNASTAR软件分析了GenBank中全部的人的FUT1/FUT4基因的同源序列，FUT1/FUT4基因的编码序列的全长分别为1098bp和1218bp，从SiRNA设计软件获得的用于抗肿瘤生长的重组FUT1/FUT4的干涉质粒的DNA模板序列中各选取7条作为形成干涉序列的模板DNA序列，长度均为19bp。其中，所设计的FUT1基因的干涉序列为：FUT1-1：TGGCCGGTTTGGTAATCAG；FUT1-2：AGACTTTGCCCTGCTCACA；FUT1-3：GAGGAGTACGCGGACTTGA；FUT1-4：CAGATCCGCAGAGAGTTCA；FUT1-5：CGGCATGGAGTGGTGTAAA；FUT1-6：TGGCCTTCCTGCTAGTCTG；FUT1-7：TTCGCCTTTCCTCCCCTGC。这些序列在FUT1基因中的位置如图1所示。所设计的FUT4基因的干涉序列为：FUT4-1：GCCTGGCAAGTAACCTCTT；FUT4-2：GTAACCTCTTCAACTGGAC；FUT4-3：CGGACGTCTTTGTGCCTTA；FUT4-4：CATGTGACCGTGGACGTGT；FUT4-5：GTTCTACCTGGCTTTCGAG；FUT4-6：CTCGTACCTGCTTTTCCTC；FUT4-7：GCGGAGGCAGCGCTGCCTG。这些序列在FUT4基因中的位置如图2所示。 

2.构建重组FUT1干涉质粒和构建重组FUT4干涉质粒 

①根据SiRNA设计软件获得用于抗肿瘤生长的重组FUT1/FUT4的干涉质粒的DNA模板序列，它是以上述FUT1/FUT4基因的调控区和编码区的序列进行干涉质粒的构建。 

②根据pSilencer-4.1-CMV-neo(Ambion，Inc)载体结构信息设计插入载体的FUT1/FUT4干涉质粒的DNA模板序列，即以干涉载体的多克隆酶切位点(HindIII、BamH I)为基础，设计与干涉载体有相同粘性末端的FUT1/FUT4SiRNA模板的DNA序列，分别构建7个FUT1干涉质粒：pSilencer-4.1-FUT1-1/FUT1-2/FUT1-3/FUT1-4/FUT1-5/FUT1-6/FUT1-7；7个FUT4的干涉质粒： pSilencer-4.1-FUT4-1/FUT4-2/FUT4-3/FUT4-4/FUT4-5/FUT4-6/FUT4-7。每条链的5`末端含有HindIII或BamH I的酶切位点(下划线标出)。具体序列如下： 

FUT1-1(5’-3’) 

GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGA 

AGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAG 

FUT1-2(5’-3’) 

GATCCAGACTTTGCCCTGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGGA 

AGCTTCCAGACTTTGCCCTGCTCACATCTCTTGAATGTGAGCAGGGCAAAGTCTG 

FUT1-3(5’-3’) 

GATCCGAGGAGTACGCGGACTTGATTCAAGAGATCAAGTCCGCGTACTCCTCGGA 

AGCTTCCGAGGAGTACGCGGACTTGATCTCTTGAATCAAGTCCGCGTACTCCTCG 

FUT1-4(5’-3’) 

GATCCCAGATCCGCAGAGAGTTCATTCAAGAGATGAACTCTCTGCGGATCTGGGA 

AGCTTCCCAGATCCGCAGAGAGTTCATCTCTTGAATGAACTCTCTGCGGATCTGG 

FUT1-5(5’-3’) 

GATCCCGGCATGGAGTGGTGTAAATTCAAGAGATTTACACCACTCCATGCCGGGA 

AGCTTCCCGGCATGGAGTGGTGTAAATCTCTTGAATTTACACCACTCCATGCCGG 

FUT1-6(5’-3’) 

GATCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTTCAAGAGACAGACTAGCAGGAAGGCCAGGA 

AGCTTCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTCTCTTGAACAGACTAGCAGGAAGGCCAG 

FUT1-7(5’-3’) 

GATCCTTCGCCTTTCCTCCCCTGCTTCAAGAGAGCAGGGGAGGAAAGGCGAAGGA 

AGCTTCCTTCGCCTTTCCTCCCCTGCTCTCTTGAAGCAGGGGAGGAAAGGCGAAG 

FUT4-1(5’-3’) 

GATCCGCCTGGCAAGTAACCTCTTCTCAAGAGAAAGAGGTTACTTGCCAGGCGGA 

AGCTTCCAGCCTGGCAAGTAACCTCTTTCTCTTGAGAAGAGGTTACTTGCCAGGCG 

FUT4-2(5`-3`) 

GATCCGTAACCTCTTCAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGGA 

AGCTTCCGTAACCTCTTCAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTGAAGAGGTTACG 

FUT4-3(5’-3’) 

GATCCCGGACGTCTTTGTGCCTTATTCAAGAGATAAGGCACAAAGACGTCCGGGA 

AGCTTCCCGGACGTCTTTGTGCCTTATCTCTTGAATAAGGCACAAAGACGTCCGG 

FUT4-4(5’-3’) 

GATCCCATGTGACCGTGGACGTGTTTCAAGAGAACACGTCCACGGTCACATGGGA 

AGCTTCCCATGTGACCGTGGACGTGTTCTCTTGAAACACGTCCACGGTCACATGG 

FUT4-5(5’-3’) 

GATCCGTTCTACCTGGCTTTCGAGTTCAAGAGACTCGAAAGCCAGGTAGAACGGA 

AGCTTCCGTTCTACCTGGCTTTCGAGTCTCTTGAACTCGAAAGCCAGGTAGAACG 

FUT4-6(5’-3’) 

GATCCCTCGTACCTGCTTTTCCTCTTCAAGAGAGAGGAAAAGCAGGTACGAGGGA 

AGCTTCCCTCGTACCTGCTTTTCCTCTCTCTTGAAGAGGAAAAGCAGGTACGAGG 

FUT4-7(5’-3’) 

GATCCGCGGAGGCAGCGCTGCCTGTTCAAGAGACAGGCAGCGCTGCCTCCGCGGA 

AGCTTCCGCGGAGGCAGCGCTGCCTGTCTCTTGAACAGGCAGCGCTGCCTCCGCG 

③特异的序列合成(Takara公司)后，经变性、退火形成55bp(含粘性末端HindIII、BanH I)的SiRNA模板的双链DNA序列。具体方法是：将合成的用于干扰FUT1/FUT4基因的SiRNA的模板DNA序列的两条链，分别用10-100μl去离子水或者TE(Tris-HCl EDTA)缓冲液溶解，并测定260nm的吸光值，计算其DNA浓度。用去离子水或者TE稀释(10-500ng/μl)。吸取稀释的单链样品加DNA退火缓冲液(含10mM Tris(pH7.4)，50mM NaCl，1mMEDTA)于90-98℃变性3-10分钟，冷却至37℃并维持1小时，于-20℃温度保存此退火产物，备用。 

④pSilencer-4.1-FUT1/FUT4SiRNA重组质粒构建 

取pSilencer-4.1-CMV-neo(10-500ng)于37℃进行HindIII和BamH I双酶切1-3小时，酶切后纯化产物与退火产物进行连接。连接反应如下：取1-20μl退火产物、1-20μl载体酶切后纯化产物、1-20μl连接酶、1-20μl连接缓冲液，最后加去离子水至10-200μl于16℃过夜连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌，利用氨苄青霉素抗性标记筛选阳性克隆子，小量提取质粒后酶切鉴定，如图3和图4。将鉴定正确的克隆子进行大量提取质粒。 

研究表明：肿瘤糖抗原的异常合成是恶性肿瘤增殖、浸润、转移的主要原因，并为其恶性转化的重要标志之一。特异的肿瘤糖抗原的合成是由糖基转移酶的特异性决定的，并且糖抗原的合成水平与糖基转移酶基因的表达调控有关。FUT1/FUT4是合成LeY肿瘤寡糖的关键酶。FUT1为α1，2-岩藻糖化糖基转移酶(α1，2-FUT)，与LeY肿瘤寡糖抗原末端α1，2岩藻糖基的合成有关，催化合成α1，2-岩藻糖苷键；而FUT4为α1，3-岩藻糖化糖基转移酶(α1，3-FUT)，催化合成α1，3-岩藻糖苷键。LeY肿瘤寡糖抗原是细胞表面糖复合 物(糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖)中的糖链成分，已经发现其在多种肿瘤中合成异常增加，与肿瘤增殖、浸润、转移、临床分期(分级)及预后密切相关。因此，通过下调FUT1和FUT4表达水平将以降低LeY肿瘤寡糖抗原的合成量是有效的靶点，该方面的研究目前国内外尚未见报道。本发明利用RNA干涉技术，构建重组FUT1和FUT4干涉质粒，通过抑制肿瘤细胞特异的岩藻糖基转移酶的合成和表达，降低LeY肿瘤寡糖抗原的合成，进而抑制肿瘤的生长、浸润和转移。 

本发明相比现有技术具有如下优点：采用本发明构建重组的FUT1和FUT干涉质粒为临床肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路和手段，它不仅效果明显而且毒副作用小、安全，同时患者治疗周期短，是一种高效、安全、经济的抗肿瘤模式。 

附图说明

图1是本发明FUT1基因的干涉质粒的DNA模板序列在基因上的位置图。 

图2是本发明FUT4基因的干涉质粒的DNA模板序列在基因上的位置图。 

图3是本发明FUT1基因的干涉质粒酶切鉴定分析图。 

图4是本发明FUT4基因的干涉质粒酶切鉴定分析图。 

图5是本发明干涉质粒转染A431肿瘤细胞后FUT1基因的RT-PCR分析图。 

图6是本发明干涉质粒转染A431肿瘤细胞后FUT4基因的RT-PCR分析图。 

图7是本发明FUT1干涉质粒(FUT1-1和FUT1-2)转染A431肿瘤细胞后LeY合成量流式细胞检测图。 

图8是本发明FUT4干涉质粒(FUT4-1和FUT4-2)转染A431肿瘤细胞后LeY合成量流式细胞检测图。 

图9是本发明FUT1干涉质粒(FUT1-1和FUT1-2)转染A431肿瘤细胞生长抑制作用的图。 

图10是本发明FUT4干涉质粒(FUT4-1和FUT4-2)转染A431肿瘤细胞生长的抑制作用的图。 

图11是本发明FUT1的不同干涉质粒对增殖细胞核抗原(PCNA)表达抑制作用的图。 

图12是本发明FUT4的不同干涉质粒对增殖细胞核抗原(PCNA)表达的抑制作用的图。 

图13是本发明影响动物实验各组小鼠瘤体积的分析图。 

图14是本发明影响动物实验各组小鼠瘤重量的分析图。 

具体实施方式

例1构建重组FUT1干涉质粒 

①根据SiRNA设计软件获得用于抗肿瘤生长的重组FUT1干涉质粒的DNA模板序列，它是以上述FUT1基因的调控区和编码区的序列进行干涉质粒的构建。每条链的5`末端含有HindIII或BamH I的酶切位点(下划线标出)。具体如下： 

FUT1-1(5’-3’) 

GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGA 

AGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAG 

FUT1-2(5’-3’) 

GATCCAGACTTTGCCCTGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGGA 

AGCTTCCAGACTTTGCCCTGCTCACATCTCTTGAATGTGAGCAGGGCAAAGTCTG 

②根据pSilencer-4.1-CMV-neo载体结构信息设计插入载体的FUT1干涉质粒的DNA模板序列，即以干涉载体的多克隆酶切位点(HindIII、BamH I)为基础，设计与干涉载体有相同粘性末端的FUT1SiRNA模板的DNA序列，分别构建pSilencer-4.1-FUT1-1和pSilencer-4.1-FUT1-2的干涉质粒。 

③特异的序列合成(Takara公司)后，经变性、退火形成55bp(含粘性末端HindIII、BamH I)的SiRNA模板的双链DNA序列。将合成的用于干扰FUT1基因的SiRNA的模板DNA序列的两条链，分别用100μl去离子水溶解，取1μl去离子水按1∶10的体积比例稀释，测定260nm的吸光值，计算其DNA浓度(约33μg/ml)，用去离子水稀释至80ng/μl，吸取每条链10μl加100μl 1×DNA退火缓冲液(含10mM Tris(pH7.4)，50mM NaCl，1mM EDTA)于98℃变性3分钟，冷却至37℃并维持1小时，于-20℃温度保存此退火产物，备用。 

④pSilencer-4.1-FUT1重组干涉质粒构建 

对pSilencer-4.1-CMV-neo(90ng)于37℃进行HindIII和BamH I双酶切2小时，酶切后回收产物与退火产物进行连接，连接反应如下：取2μl退火产物、2μl载体酶切后纯化回收产物、2μl连接酶、2μl连接缓冲液，最后加2μl去离子水至10μl于16℃过夜连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌，利用氨苄青霉素(Amp)抗性筛选阳性克隆子，小量提取质粒后酶切鉴定。将鉴定正确的克隆子大量提取质粒。 

例2构建重组FUT4干涉质粒 

①根据SiRNA设计软件获得用于抗肿瘤生长的重组FUT4干涉质粒的DNA模板序列，它是以上述FUT4基因的调控区和编码区的序列进行干涉质粒的构建。每条链的5`末端含有HindIII或BamH I的酶切位点(下划线标出)。具体如下： 

FUT4-1(5’-3’) 

GATCCGCCTGGCAAGTAACCTCTTCTCAAGAGAAAGAGGTTACTTGCCAGGCGGA 

AGCTTCCAGCCTGGCAAGTAACCTCTTTCTCTTGAGAAGAGGTTACTTGCCAGGCG 

FUT4-2(5`-3`) 

GATCCGTAACCTCTTCAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGGA 

AGCTTCCGTAACCTCTTCAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTGAAGAGGTTACG 

②根据pSilencer-4.1-CMV-neo载体结构信息设计插入载体的FUT4干涉质粒的DNA模板序列，即以干涉载体的多克隆酶切位点(HindIII、BamH I)为基础，设计与干涉载体有相同粘性末端的FUT4SiRNA模板的DNA序列，分别构建pSilencer-4.1-FUT4-1和pSilencer-4.1-FUT4-2的干涉质粒。 

③特异的序列合成(Takara公司)后，经变性、退火形成55bp(含粘性末端HindIII、BamH I)的SiRNA模板的双链DNA序列。将合成的用于干扰FUT4基因的SiRNA的模板DNA序列的两条链，分别用50μl去离子水溶解，取0.5μl去离子水按1∶10的体积比例稀释，测定260nm的吸光值，计算其DNA浓度，用去离子水稀释至100ng/μl，吸取每条链10μl加46μl 1×DNA退火缓冲液(含10mM Tris(pH7.4)，50mM NaCl，1mM EDTA)于90℃变性10分钟，冷却至37℃并维持1小时，于-20℃温度保存此退火产物，备用。 

④pSilencer-4.1-FUT4SiRNA重组干涉质粒构建 

对pSilencer-4.1-CMV-neo(300ng)于37℃进行HindIII和BamH I双酶切3小时，酶切后回收产物与退火产物进行连接，连接反应如下：取5μl退火产物、5μl载体酶切后回收产物、5μl连接酶、5μl连接缓冲液，最后加去离子至50μl于16℃过夜连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌，利用氨苄青霉素(Amp)抗性标记筛选阳性克隆子，小量提取质粒后酶切鉴定。将鉴定正确 的克隆子大量提取质粒。 

以下为本发明的检测结果： 

1.pSilencer-4.1-FUT1/FUT4 SiRNA重组质粒转染A431肿瘤细胞，采用RT-PCR检测发现转染重组质粒的细胞FUT1/FUT4表达明显下降，如图5和图6所示。 

2.pSilencer-4.1-FUT1/FUT4 SiRNA重组质粒转染A431肿瘤细胞后，采用流式细胞技术检测发现LeY的合成显著降低，如图7和图8所示。 

3.pSilencer-4.1-FUT1/FUT4 SiRNA重组质粒转染A431肿瘤细胞，经噻唑蓝(MTT)比色法检测显示转染重组质粒的细胞生长显著降低，如图9和图10所示。 

4.pSilencer-4.1-FUT1/FUT4 SiRNA重组质粒转染A431肿瘤细胞，采用Western blot技术发现PCNA的表达量明显减少，如图11和图12所示。 

5.pSilencer-4.1-FUT1-1/FUT4-1重组质粒抑制动物模型中肿瘤生长作用 

(1)用胰酶消化A431肿瘤细胞，离心收集细胞，用生理盐水制备细胞悬液，并用台盼蓝法对细胞进行计数，使每0.1ml生理盐水中含A431细胞个数为2×106。取4-6周龄的裸鼠(n＝6～8)，每只鼠右腋皮肤下注射0.1ml肿瘤细胞悬液。对照组等量注射生理盐水。 

(2)实验分为四组：空白组、空载体组、FUT1-1干涉质粒组和FUT4-1干涉质粒组。于注射A431肿瘤细胞悬液次日开始，每隔1天注射干涉质粒(150μg/次/鼠)，共10次。(3)每日观察实验组和对照组鼠的生长状态、种植肿瘤大小变化，并称重。实验持续22天后处死裸鼠，并测量瘤体积(表1)和测定瘤重量(表2)。 

表1实验各组瘤体积的分析 

注：**表示P＜0.01，差异极显著。 

实验组和对照组的瘤体积的比较分析，见图13。 

表2实验各组瘤重量的分析 

注：**表示(P＜0.01)，差异极显著。 

实验组和对照组的瘤重量的比较分析，见图14。 

抑瘤率＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％由此得到FUT1-1质粒组抑瘤率为52.8％，与对照组比较差异极显著(P＜0.01)；FUT4-1质粒组抑瘤率为45.0％，与对照组比较差异极显著(P＜0.01)。