一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法，属于基因工程技术领域。包括如下步骤：(1)将抗菌肽天蚕素基因和多拷贝整合表达载体分别用Not I酶切，然后用DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Not I进行酶切验证，选取反向插入cecA1片段的转化子命名为pYIP-cecA1；(2)将步骤(1)制得的pYIP-cecA1用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80μL酵母电转化感受态细胞，将混合物电击后，经G418的YEPD平板的筛选，获得表达天蚕素的酵母细胞；(3)培养步骤(2)制得的表达天蚕素的酵母细胞，经干燥，制得天蚕素饲料添加剂。本发明可降低天蚕素的生产成本，从而为推广天蚕素作为饲料添加剂成为饲用抗生素替代品打下良好基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

畜禽和水产养殖业在国民经济中占有重要地位。高密度养殖方式在提高产量的同时，也导致养殖生物疾病滋生，造成巨大经济损失。目前普遍使用抗生素防治病害，但所造成的药物残留和病原菌抗药性等问题，危害人类健康和环境，并成为限制畜牧水产品出口的重要原因。在人们对食品安全日益关注的今天，寻找安全高效的抗生素替代品，发展健康养殖，已成为饲料学科的重要研究方向。目前，抗生素替代品主要通过抑制或杀死病原菌、改善肠道菌群、提高机体免疫力，以达到防病促生长的目的。

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽，广泛存在于生物界。生物内源性的抗菌肽可经细菌感染诱导合成，在机体抵抗病原入侵方面起重要作用，更是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。天蚕素(Cecropins)是5类昆虫抗菌肽中抗菌活性较强的一种，其抗菌谱广，不仅能杀死细菌也能杀死一部分真菌；其杀菌机制是通过改变细菌细胞膜上的电势依赖通道，造成胞内物质泄漏而导致细菌死亡，这和抗生素通过阻断大分子生物合成不同，不易产生耐药菌，且对各种抗生素耐药菌也有杀伤作用；其还有分子量小、水溶性好及无免疫原性等特点；它具有较强热稳定性，在100℃加热10分钟还能保持一定活力，更适合饲料的高温加工过程；并且经过人造胃酸处理后，活性保持不变；它对人畜无害，在雏鸡中发现，Cecropins还有促生长的作用。将Cecropins作为饲料添加剂不仅可以替代饲用抗生素，杀灭消化道病原菌，达到防病促生长的作用，而且还可作为饲料的防腐剂使用，便于饲料储存。

目前，已有在毕赤酵母中表达果蝇Cecropin B的报道。但毕赤酵母表达异源蛋白需甲醇诱导，残留的甲醇可能带来毒害作用。酿酒酵母是美国食品和药品管理局公布的可用作饲料添加剂且对人畜无害的唯一酵母类微生物。酿酒酵母有成熟的异源基因表达系统，本身还是高蛋白饲料，酵母细胞壁还是一种免疫促进剂。因此，酿酒酵母更适合用来生产Cecropins作为饲料添加剂。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法。

一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法，步骤如下：

(1)将抗菌肽天蚕素基因(如SEQ ID NO.14所示)和多拷贝整合表达载体(如SEQ IDNO.1所示)分别用Not I酶切，然后用DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用Not I进行酶切验证，经分析测序，选取反向插入cecA1片段的转化子命名为pYIP-cecA1；

(2)将步骤(1)制得的pYIP-cecA1用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80μL酵母电转化感受态细胞，将混合物电击后，经G418的YEPD平板的筛选，获得表达天蚕素的酵母细胞；

(3)培养步骤(2)制得的表达天蚕素的酵母细胞，经干燥，制得天蚕素饲料添加剂。

上述步骤(2)中电转化的电击时间为3.5～4.0ms。

上述步骤(3)中的培养条件：在无选择压力的YEPD培养基中28～30℃培养2～3天。

上述步骤(2)中的酵母为具有絮凝性的野生型酿酒酵母ABXL-1D，菌种购自美国ATCC公司。

所述的多拷贝整合表达载体的制备方法可参见中国专利申请号为：“201010531234.0”，发明名称为：“一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用的申请中的记载”。

酿酒酵母对人类无毒，被食品和药物管理局(FDA)确认为无害表达系统，表达产物可直接作为饲料添加剂应用，并且酿酒酵母的细胞壁成分β-1，3葡聚糖也是一种免疫增强剂。故本发明利用强絮凝型酿酒酵母组成型表达天蚕素，在工业生产中不需要分离工艺，复杂的蛋白纯化工艺，利用成本较低的发酵培养基即可进行发酵生产，发酵完毕后收集酵母，即可直接制成酵母干粉制剂作为饲料添加剂应用。

为了降低重组天蚕素的生产成本，简化生产工艺，本研究选择具有絮凝性的野生型酿酒酵母ABXL-1D整合表达天蚕素，但是目前商品化的酿酒酵母整合表达载体大都利用营养缺陷型标记作为筛选标记和整合位点，需要营养缺陷型酿酒酵母作为宿主，并且整合后得到的拷贝数较低，不适合进行工业化生产。有研究表明，酿酒酵母的rDNA基因也可作为整合位点，并且可使重组蛋白基因的拷贝数提高到50或50以上。本发明构建含有rDNA作为整合位点，G418抗性为筛选标记，酵母强组成型表达启动子PGK为启动子的新型酿酒酵母多拷贝整合表达载体。另外，Cecropins有较强的抗菌活性，并且其抗菌机制不同于抗生素，不宜产生耐药菌，其本身又是小肽，最终在体内会被降解掉，安全无残留。另外，Cecropins的热稳定性非常好，在沸水处理30min其抗菌活性保持不变，非常适用作为青贮饲料的加工过程中的防腐剂。

有益效果：

1、本发明所述的多拷贝整合表达载体以YIPlac204质粒为骨架，PGK为启动子，G418抗性为筛选标记，rDNA为整合位点，是适用于工业化生产使用的酵母多拷贝整合型表达载体。

2、本发明采用强絮凝性的野生型酿酒酵母作为重组蛋白的宿主菌，并成功表达重组天蚕素。强絮凝性的酿酒酵母菌在工业化生产时，能使分散在培养液中的酵母细胞相互聚集发生凝集，形成絮凝颗粒并沉降，从而有利于酵母细胞同培养液的有效分离，可大大简化生产工艺，降低成本。

3、本发明采用组成型强启动子PGK高效启动重组蛋白的表达，提高了重组的表达率和减去工业化生产时补料控制工艺，简化了操作。

4、本发明首次利用野生型酿酒酵母成功表达抗菌肽天蚕素，并且利用生物安全性较高的多拷贝整合表达载体提高天蚕素在酿酒酵母基因组中的拷贝数从而提高天蚕素在酿酒酵母中的表达效率，重组天蚕素不需纯化就可直接作为饲料添加剂应用。利用该重组天蚕素酿酒酵母工程菌进行天蚕素的发酵生产，降低天蚕素的生产成本，从而为推广天蚕素作为饲料添加剂成为饲用抗生素替代品打下良好基础。

附图说明

图1CecropinA1 mRNA序列同根据其氨基酸序列设计的CecropinA1人工合成序列的比对图；

图2pYIP-cecA1菌液PCR验证

其中泳道1：pYIP-cecA1菌液PCR验证；泳道2：DL2000 Marker

图3酿酒酵母转化子菌液PCR验证；

其中：1泳道：S.cerevisiae ABXL-1D菌液PCR结果，2泳道：S.cerevisiae ABXL-1D重组cecA1转化子菌液PCR结果，3泳道：DL2000 Marker；

图4重组转化子SDS-PAGE检测蛋白表达情况；

其中：1泳道：1.CecropinA1转化酿酒酵母ABXL-1D的转化子，2泳道：小分子量蛋白Marker，3泳道：对照酿酒酵母ABXL-1D。图中箭头所指为重组CecropinA1条带。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此；

质粒pPIC9K购自Invitrogen公司，质粒pUC57-cecA1是金思特生物科技有限公司对cecA1进行人工合成后将其插入pUC57中得到的。

实施例1

抗菌肽天蚕素基因的获得：

酿酒酵母和果蝇的密码子偏爱性存在较大差异，为了使果蝇抗菌肽cecropin基因能在酿酒酵母中得到比较高效的表达，因此根据酿酒酵母密码子偏爱性表，将从NCBI上查到的果蝇抗菌肽cecropinA1氨基酸序列转换成适合在酿酒酵母中表达的核酸序列，同时还要考虑整个核酸序列的GC含量、二级结构等问题，避免翻译过程提前终止。CecropinA1 mRNA序列同根据其氨基酸序列设计的CecropinA1人工合成序列的比对见图1。

将设计好的序列如SEQ ID NO.14所示的Cecropin A1核酸序列(cecA1)两端引入Not I酶切位点后，交由金思特生物科技有限公司进行人工合成。该公司将合成好的片段插入pUC57中，并进行测序，测序结果反馈序列合成无误。

实施例2

多拷贝整合表达载体的构建

(I)载体骨架pYB-1的构建：

(i)Bgl片段的扩增：以YIPlac204为模板，引物b1和b2为引物，利用PCR技术扩增Bgl片段并在其两端分别引入Aat II，EcoR I和Bgl II酶切位点。引物序列如下：下划线部分为Bgl II的识别位点，阴影部分为Aat II的识别位点，框架中的序列为EcoR I的识别位点。

引物b1：5’AGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC 3’；(SEQ ID NO.2)

引物b2：5’AGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG 3’；(SEQ ID NO.3)

PCR反应条件为94℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min。PCR得到280bp大小的DNA片段，将该片段纯化回收后同pGM-T载体连接，转化E.coli TOP10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，进行蓝白斑筛选挑取白色菌落，摇菌过夜后进行菌液PCR(以菌液为模板，T7和SP6通用引物为引物)得到约460bp大小片段，即280bp的Bgl片段再加上载体上T7和SP6引物结合位点间约180bp的距离。这与预期相符，说明Bgl片段已经同T载体连接成功。

(ii)Bgl片段和YIPlac204的连接：将Bgl片段用Aat II和EcoR I从T载体上酶切下来，切胶回收。载体YIPlac204上有Aat II和EcoR I的酶切位点，将该载体用Aat II和EcoR I双酶切后，回收大片段，并将其同酶切过的Bgl片段连接，连接液转化E.coliTOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，用Bgl II酶切进行验证，得到大小约为2.2kb的大片段和256bp的小片段。同预期相符，说明Bgl片段成功同YIPlac204的片段连接成为表达载体的骨架，将其命名为pYB-1。

(II)启动子终止子元件的插入

1.8kb PGK启动子和终止子片段(PGKp+t)以质粒pMA91为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到，反应条件为98℃10sec，61℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min，引物均引入BamH I酶切位点(下划线)，

pgk1：CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC(SEQ ID NO.4)和

pgk2：CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG(SEQ ID NO.5)，反应产物大小约为1836bp。

将PCR产物回收后进行末端加A尾反应，然后再同pGM-T连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，进行蓝白斑筛选挑取若干白色菌落，小量制备质粒后用EcoR I进行酶切验证，得到约3051bp的T载体片段和约1836bp的PGKp+t片段，同预期相符说明该片段已插入T载体中。将筛选出的转化子送去测序，测序结果经过序列比对分析，表明PGKp+t片段序列同pMA91质粒上的PGKp+t相同。

利用BamH I和Bgl II为同尾酶的特点，将用BamH I从T载体酶切下来，切胶回收得到的PGKp+t片段同用Bgl II单酶切pYB-1，切胶回收得到的片段连接，连接液转化E.coliTOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Hind III进行酶切验证。若PGKp+t片段正向插入pYB-1的Bgl II位点，则经Hind III酶切后将得到一条电泳条带，而反向插入则会出现两条带，大小分别约为2230bp和1960bp。选取反向插入的转化子将其命名为pYB-2。

(III)整合位点rDNA单元的插入

酵母基因组中高度重复的rDNA单元，是构建高拷贝整合表达载体同源重组区的首选序列。每个rDNA单元长达9.1kb左右，由5S、5.8S、25S和18S rRNA的转录区及一些非转录区组成。有研究表明，用于介导整合的rDNA区域，不应包含其RNA polymerase I的起始转录区，同时整合于rDNA区域的外源片断大小接近rDNA单元长度时，其在有丝分裂中稳定性最高。根据这一要求，对S.cerevisiae rDNA序列进行分析，确定所需2.2kb片断，其在rDNA单元中的相对位置。该片段含有质粒用于线性转化的Hpa I单酶切位点。

为了减少能赋予细菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶编码基因的扩散，增加重组蛋白工程菌作为饲料添加剂的生物安全性，将选择出的rDNA片段从Hpa I处分成两段进行PCR并克隆入pYB-2中，这样就可以在转化酵母时，利用Hpa I线性化载体从而去除β-内酰胺酶编码基因Ampr。

根据这两段rDNA序列设计引物

rDNA1F：TTTCCTCTGGC TTCACCCTATT (SEQ ID NO.6)，

rDNA1R：CCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT (SEQ ID NO.7)，

rDNA2F：GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT (SEQ ID NO.8)，

rDNA2R：GACGTC GAAACTCACCAGGTCCAGACACA (SEQ ID NO.9)，

引物均引进酶切位点(Aat II下划线，Pst I阴影)。以酿酒酵母ABXL-1D染色体为模板，上述引物为上下游引物进行PCR扩增rDNA1和rDNA2片段。PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec，61℃30sec，72℃100sec，循环重复34次，72℃10min。PCR反应产物rDNA1和rDNA2的大小分别约为1134bp和1216bp。将rDNA2和pYB-2用Aat II酶切，切胶纯化回收片段后连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Hind III和Hpa I进行酶切验证，酶切后产生三条带，大小分别约为2156bp，1856bp和960bp的转化子为rDNA2片段反向插入pYB-2的转化子，将其命名为pYB-3。

将pYB-3和rDNA1用Pst I酶切，切胶纯化回收片段后连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Hpa I进行酶切验证，酶切后产生两条带，大小分别约为4089bp和2450bp的转化子为rDNA1片段反向插入pYB-3的转化子，将其命名为pYB-4。

(IV)pYB-5的构建

由于G418抗性基因中含有Bgl II位点，因此，PGKp+t片段中的克隆位点Bgl II则不可用，需要另换克隆位点。经过序列分析后，得知载体和cecA1上不存在Not I位点，并且Not I在基因组中出现频率低，故将PGKp+t片段的Bgl II位点置换成Not I位点。用于置换酶切位点的Not片段通过PCR得到，该PCR以YIPlac204为模板，两端引入BamH I(下划线)和Not I位点(阴影)的

notF：CGCGGATCCATTCTTGCCACGACTCATCTCC (SEQ ID NO.10)和

notR：CGCGGATCCGATTCCGATGCTGACTTGCTG (SEQ ID NO.11)

为引物，条件为：95℃2min，94℃30sec，61℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min，PCR反应得到大小约为256bp的Not片段。将Not片段用BamHI酶切，pYB-4用Bgl II酶切，纯化回收后连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Not I进行酶切验证。挑选释放出约256bp的Not片段的转化子，将其命名为pYB-5。

(v)G418抗性基因的插入

以质粒pUG6为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到约1.4Kb的KanMX基因，PCR反应条件为98℃10sec，58℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min，引物均引入BamH I酶切位点(下划线)，引物序列为：

kanF：GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC (SEQ ID NO.12)和

kanR：GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG (SEQ ID NO.13)，反应产物大小约为1456bp。

将PCR产物回收后进行末端加A尾反应，然后再同pGM-T连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，进行蓝白斑筛选挑取若干白色菌落，小量制备质粒后用EcoR I进行酶切验证，得到约3051bp的T载体片段和约1472bp的KanMX片段，同预期相符说明该片段已插入T载体中。将筛选出的转化子送去测序，测序结果经过序列比对分析，表明KanMX片段序列同pUG6质粒上的KanMX序列相同。

将KanMX用BamH I从T载体酶切下来，切胶回收后同用Bgl II单酶切pYB-1，切胶回收得到的片段连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Pst I进行酶切验证。若KanMX正向插入pYB-1的BamH I位点，则经Pst I酶切后将得到三条电泳条带，大小分别为276bp，1200bp和6720bp。选取正向插入的转化子将其命名为pYB-6(pYIP-6)。pYIP-6即为构建完毕的多拷贝整合表达载体。其序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例3

抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法，步骤如下：

(I)cecA1表达载体的构建：将实施例1制得的pUC57-cecA1和载体pYIP-6用Not I酶切，切胶回收相应的片段进行连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。

挑取若干转化子，摇菌过夜后，以菌液为模板，进行菌液PCR，引物序列如下：

P1：CAGATCATCAAGGAAGTA，SEQ ID NO.15

P2：CCTTACCTTCCAATAATTCC SEQ ID NO.16

反应条件为：95℃2min；94℃30sec，54℃30sec，72℃30sec，循环重复34次；72℃10min。

得到约323bp大小片段(图2)，即203bp的cecA1再加上载体上P1和P2引物结合位点间约120bp的距离。这与预期相符，说明cecA1已经同pYIP-6载体连接成功。将插入片段的几个转化子送去测序，分析测序结果将反向插入cecA1片段的转化子命名为pYIP-cecA1。

(II)表达载体转化酿酒酵母ABXL-1D以及含多拷贝基因转化子的筛选：提取pYIP-cecA1质粒，用Hpa I酶切，切胶回收线性化质粒。将回收得到的线性化质粒加入到80μL酿酒酵母ABXL-1D电转化感受态细胞，将混合物加入0.1cm电击杯中，选取酵母电击参数进行电击。电击完后，涂布含200μg/mL G418的YEPD平板，30℃倒置培养2天。经过梯度浓度G418平板筛选得到的转化子为含高拷贝数的转化子。

(III)重组天蚕素酿酒酵母工程菌的菌液PCR检验：将步骤(II)挑选出来的含高拷贝数的转化子和空白菌利用冻-煮-冻的方法制备模板，利用根据cecA1设计的引物进行PCR验证，引物序列如下：

Sense：    ATGAATTTCTATAATATTTT    SEQ ID NO.17

Antisense：TTAACCTCTTGCTGTAGCAG    SEQ ID NO.18

反应条件为：94℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min。取10μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。转化子PCR得到的片段大约为204bp，符合引物同模板结合区域之间的距离，而没有经载体转化的空白菌PCR没有得到条带(图3)，说明经筛选得到的转化子基因组中含有cecA1，pYIP-cecA1已经整合入S.cerevisiae ABXL-1D基因组中。

(Ⅳ)Tricine SDS-PAGE检测酿酒酵母胞内表达重组cecA1情况：接种转化子于50mLYEPD液体培养基中，30℃200rpm振荡培养48h后，取1mL菌液离心后，用1mL PBS洗涤两次后，用200μL PBS溶解沉淀后，加2×上样缓冲液混匀后，沸水浴10min。取20μL处理液上样SDS-PAGE(图4)。由图5可知，转化子表达一种不在空白菌中表达的蛋白，大小约为4.6kD，同Cecropins分子量相符，说明Cecropins在酿酒酵母转化子中成功表达，但表达量比较低。