法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-09-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N5/071 授权公告日:20130515 终止日期:20160718 申请日:20080718
专利权的终止
2013-05-15
授权
授权
2011-07-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/08 申请日:20080718
实质审查的生效
2011-06-01
公开
公开
发明背景
本发明涉及经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干(hBS)细胞的新肝细胞样细胞群体，用于制备此种细胞的方法，以及此种细胞在例如药学药物开发和发展、毒性测试、细胞疗法和医学治疗中的潜在用途。细胞在本文中命名为DE-hep细胞。
此外，DE-Hep细胞显示功能人肝细胞的性质，这使得它们对于在肝生成的体外研究中的使用非常有吸引力，例如早期肝脏发育过程或肝脏再生障碍或畸形。
发明背景
多能人干细胞预期将改革各种人细胞类型的可及性。繁殖多能人胚泡衍生干(hBS)细胞和后续使它们分化成所需靶细胞类型的可能性将提供稳定和基本上无限的细胞供应，用于在体内和在体外的一系列应用。
肝脏衰竭和末期肝病负责全世界的大量死亡，并且是卫生保健系统的重大负担。肝脏移植仍是最成功的治疗。然而，这个操作的功效是有限的，并且与许多并发症如感染或排斥相关。肝脏移植还具有可用供体器官的短缺，并且治疗患者将非常经常涉及终生免疫抑制。通过减少对于器官的需求，基于细胞的治疗将对社会和患有这些严重疾病的个体具有极大重要性。
此外，肝脏是人体中的代谢和解毒中心，并且因此已付出巨大努力以便鉴定用于体外测试的功能细胞类型的可靠来源。不幸的是，肝脏的复杂性和功能未由目前可用的任何细胞类型反映。原代人肝脏细胞的可用性是非常有限的，并且也已知当用于体外应用时，细胞快速丧失其正常表型和功能性质(即，在24小时内)。原代细胞的一种常用替代物是肝细胞系，其依次包含极低水平的代谢酶，并且具有与体内天然肝细胞基本上不同的其他重要蛋白质的分布。因此，许多测试仍使用动物材料来进行，即使已知肝脏代谢是物种特异性的，并且因此产生在预测除测试那种外的另一个物种中的肝脏代谢和毒性中的困难。
在药学开发中，不利肝脏反应仍是最突出的副作用。因此，当选择化合物进入临床试验时，人肝脏毒性倾向的早期预测是极其重要的。改善这个领域中的能力的努力必须解决可用性问题和模型开发，这提供针对复杂生物学过程的更大覆盖，所述复杂生物学过程与在人中诱导不利肝脏损伤一致。在2个领域中，衍生自hBS细胞的分化细胞的使用提供有希望的机会。
因此，存在关于模型系统的迫切需要，所述模型系统模拟人肝脏细胞，并且能够预测候选物分子在新药或化学制品开发中的效应。关于可用性和生理学相关性，人多能干细胞可以充当功能人肝细胞的理想再生来源。当hBS细胞以置于合适环境中时，在分化2-4周后已观察到特定肝特征。
本发明基于下述事实：定型内胚层(DE)细胞产生内胚层器官且因此产生肝细胞类型。早期内胚层发育并未充分了解。培养的小鼠胚胎的定向研究(Lawson等人，1986，1991；Lawson和Pedersen，1987)已揭示DE在胚胎日期6-6.5(E6-6.5)时开始形成，并且到原肠胚形成结束时(E7.5)，某些标记细胞仅产生内胚层衍生物。未知起始DE细胞是否是多潜能的。原基分布图研究(Laws on等人，1991；Tremblay和Zaret，2005)暗示在E6.5时通过胚线(PS)移动的第一个内胚层细胞命运是成为肝脏、腹胰、肺和胃。共培养实验显示这个阶段时的内胚层在早期胚胎阶段时并未完全定型(Wells和Melton，2000)。
内胚层研究中的复杂情况是哺乳动物具有胚外内胚层。胚外内胚层在胚泡期出现，并且最终形成2个亚群：内脏内胚层和壁内胚层。胚外内胚层细胞与DE(产生内胚层器官的细胞)共享许多基因的表达，包括经常分析的转录因子Sox17(Kanai-Azuma等人，2002)、FoxA1和HNF3b(Belo等人，1997；Sasaki和Hogan，1993)。D′Amour等人已开发了用于从hBS细胞衍生定型内胚层的方案(D′Amour等人，2005；D′Amour等人，2006)。
在本发明中呈现了hBS细胞衍生的肝细胞样细胞群体，其用于在药物开发和再生医学中使用，且具有至少24小时的重要肝脏表达的标记基因例如白蛋白、CYP3A4和UGT2B7及重要的代谢酶和药物转运蛋白的稳定表达。
发明概述
本发明涉及衍生自定型内胚层、DE-Hep祖先和DE-Hep细胞的成肝细胞样细胞和肝细胞样细胞。
如由下文描述显而易见的，本发明还涉及用于制备这些细胞的分阶段方法，i)DE-Hep祖先和ii)DE-Hep细胞。如在图1A和B中描述的，这种方法涉及通过培养hBS细胞(阶段I)的DE细胞的形成，其后从DE细胞获得DE-Hep祖细胞(阶段II)，和最终从DE-hep祖细胞形成DE-Hep细胞(阶段III)。
本发明的一个方面涉及用于制备经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干(hBS)细胞的DE-Hep细胞的方法，该方法包括对hBS细胞实施培养条件，所述培养条件包括
i)阶段I，其中诱导hBS细胞以发育成定型内胚层细胞，阶段I包括在包括活化素的第一种阶段I培养基中培养hBS细胞2-6天，其中在培养1天后培养基由第二种阶段I培养基替换，所述第二种阶段I培养基包括活化素、一种或多种生长因子和任选地血清，
ii)阶段II，其中繁殖得自阶段I的细胞，并且阶段II包括在阶段II培养基中培养来自阶段I的细胞，所述阶段II培养基包括一种或多种生长因子和任选地成骨蛋白，
iii)阶段III，其中使得自阶段II的细胞成熟为肝细胞样细胞(DE-Hep细胞)，阶段III包括在阶段III培养基中培养来自阶段II的细胞，所述阶段III培养基包括一种或多种成熟因子和任选地分化诱导剂。
本发明的另一个方面涉及通过上述方法获得的DE-hep祖细胞。得自阶段I I的细胞显示HNF1、HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、结蛋白、CD133、ICAM1(CD54)、CK8、CK18和CK19中的一种或多种的蛋白质和/或基因表达。DE-hep祖细胞显示CK8、CK18和CK19、ICAM的基因表达。如本文例子中证实的，DE-hep祖细胞通常还显示EpCAM，以及HNF1、HNF3b、HNF4a中的一种或多种优选全部的蛋白质和/或基因表达。包括DE-hep祖细胞且根据本发明获得的细胞群体通常包含至少25％的DE-hep祖细胞，优选50％的细胞是DE-hep祖细胞。依赖于细胞群体中的DE-hep祖细胞百分比，特定百分比细胞可显示所需蛋白质和/或基因表达。因此，百分比非常依赖于细胞群体的“纯度”(即，相同细胞同一性)。然而，可以对具有低百分比DE-hep祖细胞的细胞群体实施细胞选择和此种细胞的繁殖，并且这将反过来导致更高的百分比。特别地，DE-hep祖细胞显示CK8、CK18和CK19的蛋白质和/或基因表达(通常如本文所述获得的DE-hep祖细胞群体中至少50％细胞或细胞显示CK8、CK18和/或CK19的蛋白质和/或基因表达)。
本发明涉及具有上述特征的DE-hep祖细胞以及包括DE-hep祖细胞的细胞群体。
本发明的一个进一步方面涉及可通过本文描述的方法获得的DE-hep细胞。DE-hep细胞显示关于药物转运的一种或多种标记，尤其是BSEP、MRP2、OATP-2(＝OATP-C、OATP1B1)、OATP-8(OATP1B3)、OATP-A(＝OATP1A2)、NTCP、MDR1、MDR3、OCT-1的蛋白质和/或基因表达。特别地，DE-hep细胞显示关于药物转运的下述标记的蛋白质和/或基因表达：MRP2、OATP-2(＝OATP-C、OATP1B1)、OATP-A(＝OATP1A2)、NTCP和OCT-1。此外，在本文描述的至少某些方案中，获得的DE-hep细胞还显示关于药物转运的下述标记的蛋白质和/或基因表达：MDR1和/或MDR3。
本发明的一个进一步方面涉及可通过本文描述的方法获得的DE-hep细胞。DE-hep细胞显示关于药物代谢酶的一种或多种标记，尤其是GSTA1-1、GSTM1-1、CYPs(CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1、UGT1A6、UGT1A和/或UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。特别地，DE-hep细胞显示下述药物代谢酶的蛋白质和/或基因表达：CYP 2C9、CYP2C19、CYP2D6。此外，如本文例子中证实的，DE-hep细胞还显示CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1以及UGT1A6、UGT1A、UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。
本发明的一个进一步方面涉及可通过本文描述的方法获得的DE-hep细胞。DE-hep细胞显示关于转录因子的一种或多种标记，尤其是FXR、RXRα、RXRβ、RXRγ、HNF1α、HNF3α、HNF3β、HNF4α、HNF6、C/EBP A、C/EBP B的蛋白质和/或基因表达。特别地，DE-hep细胞显示关于转录因子的下述标记的蛋白质和/或基因表达：RXRγ。此外，如本文例子中证实的，DE-hep细胞还显示FXR、RXRα、RXRβ、HNF1α、HNF3α、HNF3β、HNF4α、HNF6、C/EBP A、C/EBP B的蛋白质和/或基因表达。
在一个具体实施方案中，DE-hep细胞显示关于药物转运蛋白和药物代谢酶的一种或多种标记的蛋白质和/或基因表达，DE-hep细胞显示关于药物转运蛋白和转录因子的一种或多种标记的蛋白质和/或基因表达，DE-hep细胞显示关于药物代谢酶和转录因子的一种或多种标记的蛋白质和/或基因表达，并且DE-hep细胞显示关于药物转运蛋白、药物代谢酶和转录因子的一种或多种标记的蛋白质和/或基因表达(参考在上文段落中具体提及的标记)。
此外，与使用相同种类的细胞但对细胞实施固有分化比较，通过上述方法获得的DE-hep细胞可能显示下述增加的蛋白质和/或基因表达：白蛋白、UGT2B7、CYP3A4。如本文例子中显示的，基于根据本发明的DE-hep细胞的白蛋白表达增加至少5倍，但使用特定方案(方案2或4)可以高至约140。平均起来，白蛋白表达增加约80或90倍。如本文例子中显示的，基于根据本发明的DE-hep细胞的UGT2B7表达增加至少3倍，但使用特定方案(方案2)可以高至约85。平均而言，UGT2B7表达增加约30或40倍。如本文例子中显示的，基于根据本发明的DE-hep细胞的CYP 3A4表达增加至少20倍，但使用特定方案(方案3)可以高至约200。平均而言，白蛋白表达增加约100或110倍。
本发明的DE-hep细胞特别良好地适合于在药物开发和毒性测试中使用，因为它们表达药物转运蛋白和/或代谢酶。此外，通过本发明的获得的DE-hep细胞显示对于成熟肝脏细胞重要的标记基因的表达，例如白蛋白、CYP3A4和UGT2B7。
包括DE-hep细胞且根据本发明获得的细胞群体通常包含至少25％的DE-hep细胞，优选50％的细胞是DE-hep细胞。依赖于细胞群体中的DE-hep细胞百分比，特定百分比细胞可能显示所需蛋白质和/或基因表达。因此，所述百分比非常依赖于细胞群体的“纯度”(即，相同细胞同一性)。然而，可以对具有低百分比DE-hep细胞的细胞群体实施细胞选择和此种细胞的繁殖，并且这将反过来导致更高的百分比。
本发明涉及具有上述特征的DE-hep细胞以及包括DE-hep细胞的细胞群体。
在本发明的一个方面，DE-hep细胞或细胞核显示下述特征中的至少一种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种或全部：葡萄糖6磷酸酶、载脂蛋白E、CYP7A1(胆固醇7α羟化酶)、醇脱氢酶1、细胞色素P450还原酶、HNF4a、α-1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF 3b(HNF 3B)、白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白和下述11种特征中的至少2种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种或全部
A.药物转运蛋白
i)至少1％的细胞或相关的细胞核显示BSEP的蛋白质和/或基因表达，
ii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MRP2的蛋白质和/或基因表达，
iii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OATP-2(＝OATP-C、OATP1B1)和/或OATP-8(OATP1 B3)的蛋白质和/或基因表达，
iv)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OATP-A(＝OATP1A2)的蛋白质和/或基因表达，
v)至少1％的细胞或相关的细胞核显示NTCP的蛋白质和/或基因表达，
vi)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MDR1的蛋白质和/或基因表达，
vii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MDR3的蛋白质和/或基因表达，
viii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OCT-1的蛋白质和/或基因表达
B.药物代谢酶
ix)至少20％的细胞或相关的细胞核显示GST A1-1和GSTM1-1的蛋白质和/或基因表达，
x)至少5％的细胞或相关的细胞核显示下述CYPs-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4、-3A7和-7A1中的至少2种的蛋白质和/或基因表达，
xi)至少5％的细胞或相关的细胞核显示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。
特别地，本发明涉及显示全部下述特征的DE-hep细胞：葡萄糖6磷酸酶、载脂蛋白E、CYP7A1(胆固醇7α羟化酶)、醇脱氢酶1、细胞色素P450还原酶、HNF4a、α-1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF3b(HNF3B)、白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白。这些特征指示细胞是肝脏细胞。
此外，如上所述，DE-hep细胞具有就药物转运和药物代谢而言的特征。因此，包括DE-hep细胞的细胞群体通常具有下述特征：至少20％的细胞显示OATP-2、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的蛋白质表达。
包括DE-hep细胞的细胞群体通常是这样的群体，其中至少20％的细胞显示关于药物转运的下述标记中的至少5种、优选7种、更加优选全部的蛋白质和/或基因表达：BSEP、MRP2、OATP-2(＝OATP-C、OATP1B1)、OATP-8(OATP1B3)、OATP-A(＝OATP1A2)、NTCP、MDR1、MDR3、OCT-1，和
至少20％的细胞显示GST A1-1和/或GSTM1-1的蛋白质和/或基因表达，和
至少20％的细胞显示下述CYPs-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1，-3A4、-3A7和-7A1中的至少7种、优选9种、更加优选全部的蛋白质和/或基因表达
至少5％的细胞显示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。
人胚泡衍生干细胞(hBS细胞)是多能的，并且可以产生所有3个胚胎胚层(内胚层、外胚层和中胚层)的细胞，并且进一步产生所有体细胞和生殖细胞。因此，在未来，衍生自具有肝细胞功能特征的hBS细胞的分化细胞不仅具有用于移植或在生物反应器中用于在具有肝衰竭的患者中的额外身体肝脏支持的潜力，以及作为测试系统用于研究药物靶、异生物质的肝代谢和肝毒性的潜力。hBS衍生的肝细胞可以需要时潜在提供来自相同的遗传供体的功能人肝细胞的无限来源，并且因此改善体外测试例如毒性测试的预测性，且减少关于动物实验的需要。然而，异生物质的毒性通常依赖于其生物转化成毒性和反应性代谢物，并且因此需要生物转化系统的存在和分布。目前，原代人肝细胞构成用于体外药物代谢和毒性测试的模型。然而，当培养原代肝细胞时，药物代谢酶的活性和许多转运蛋白功能快速丧失和/或改变。此外，用于体外研究的许多肝细胞瘤细胞系例如HepG2，缺乏许多重要药物代谢酶的表达。
细胞色素P450s(CYPs)是混合功能单加氧酶和异生物质I期代谢中的主要酶。依赖于异生物质的性质，这种氧化代谢导致药物前体的失活和促进的消除、激活或代谢激活。CYP表达的主要部位是肝脏，并且CYP3A4是人成年肝脏中最丰富的CYP同工酶。对于药物代谢具有最大重要性的酶属于家族1-3，负责临床使用药物的70-80％的所有I期依赖性代谢。由于多态现象，CYP表达和活性呈现很大的个体间变异。此外，CYPs可以由特定药物诱导几倍或抑制，导致另外，尽管暂时的代谢活性的变异性。特别地，在肝细胞内3个主要CYP家族(1-3)基本CYP活性的组成对于药物代谢具有极大重要性。在本文例子中描述了hBS细胞衍生的DE-Hep细胞，其中检测出来自所有测试CYP酶的mRNA，包括CYP1A2(成年肝脏特异性酶)、CYP2C9和CYP3A4。检测出主要CYP家族更精确地CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4的基本CYP活性，并且另外这3种提及的CYPs活性的个体间组成类似于人原代肝细胞的那种。此外，CYP1A2也是另一种成年肝脏特异性酶，即CYP7A1(胆固醇7α羟化酶)，在DE-Hep细胞中表达，证实它们的成年肝表型。因此，本发明提供了用于制备表达功能药物代谢酶的DE-Hep细胞的方法。
除I期酶如CYPs外，肝细胞还表达II期酶如UGTs。因此，本发明提供了用于制备表达II期酶的DE-Hep细胞的方法。在本发明的一个进一步方面，DE-hep细胞表达I期酶和II期酶，特别是CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6连同UGT1A6和/或UGT1A。
此外，肝细胞表达细胞色素P还原酶，这是对于CYPs重要的氧化还原配偶体，并且因此对于CYP功能性是必需的。因此，本发明提供了用于制备表达细胞色素P还原酶的DE-Hep细胞的方法。
当分析肝脏的药物代谢和毒性时，在肝细胞的功能药物转运蛋白例如BSEP、MRP2、OATPs(例如OATP-2)、MDR1和3、NTCP和OCT-1是必需的。因此，本发明提供了用于制备表达功能转运蛋白的DE-Hep细胞的方法。
因此，在一个实施方案中，DE-hep可以表达选自CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、UGT1A6、UGT1A、OATP-2、MRD3和/或BSEP的I期酶，II期酶和药物转运，连同其他肝脏标记，例如醇脱氢酶Ia(ADH1A)和/或白蛋白。
肝脏相关转录因子如HNF1α、3α、3β、4α和6、PXR、CAR、FXR、RXR、C/EBP A和B的表达是获得成年肝表型必需的。因此，本发明提供了用于制备表达此种转录因子的DE-Hep细胞的方法。
因此，本发明涉及经由定型内胚层用于从人胚泡衍生干(hBS)细胞制备DE-Hep祖细胞的方法。本发明还涉及像这样的DE-Hep祖细胞和像这样的DE-Hep细胞。
根据本发明的DE-Hep祖细胞显示EpCAM、HNF1、HNF3b、HNF4a、AFP、结蛋白、CD133、c-kit、Notch2、ICAM1(＝CD54)、CK7、CK8、CK18和CK19中的一种或多种的基因表达(参见实施例8、表2和实施例9)。
发明详述
定义和缩写
如本文所使用的，术语“胚泡衍生干细胞”指BS细胞，并且人形式称为“hBS细胞”。在文献中，该细胞通常称为胚胎干细胞，并且更具体而言人胚胎干细胞。
如本文所使用的；
阶段I产物：定型内胚层(DE)细胞，
阶段II产物：经由定型内胚层衍生的DE-Hep祖细胞，例如成肝细胞样细胞。
阶段III产物：经由定型内胚层衍生的DE-Hep细胞，例如功能肝细胞样细胞。
术语“至少xx％的细胞或相关的细胞核显示yy的蛋白质和/或基因表达”意指“至少xx％的细胞显示yy的蛋白质和/或基因表达”或“至少xx％的细胞核显示yy的基因表达”
术语“固有分化”意指衍生自hBS细胞的肝细胞样细胞，所述hBS细胞已在MEFs上在无特定补充剂(例如，活化素A)的VitroHESTM中进行培养，但将bFGF加入培养基中并且培养基更换很少(参考专利申请WO2007/140968A1)。
术语“功能肝细胞”意指表达成熟肝细胞标记尤其例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、OATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的细胞类型。
在肝脏中的异生物质代谢通常分成3个时期：修饰(I期)、缀合(II期)和排泄(III期)。这些反应协同作用以使异生物质解毒且从细胞中去除它们。
在I期中，各种酶作用于将反应性和极性基团引入其底物内。最常见的修饰之一是由细胞色素P-450依赖性混合功能氧化酶系统催化的羟化。
如本文所使用的，“CYP”意指细胞色素P，且更具体而言细胞色素P450，由许多不同同工酶构成的肝脏主要I期代谢酶，例如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP7A1。
在肝脏中的II期反应由一大群广泛特异性的转移酶催化，所述转移酶组合可以代谢包含亲核或亲电子基团的几乎所有疏水化合物。这些基团中最重要的一种是谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)。
如本文所使用的，术语“GST”意指谷胱甘肽转移酶，并且其亚型的例子是GST A1-1、GST M1-1和GST P1-1。
如本文所使用的，术语“UGT”意指尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶，这是催化葡萄苷酸化活性的一群肝脏酶。
II期反应后，肝脏可能进一步代谢来自II期反应的产物。缀合物及其代谢产物可以在其代谢III期中从细胞中排泄，其中阴离子基团充当亲和标记用于多药抗性蛋白质(MRP)家族的各种膜转运蛋白。这些蛋白质是ATP结合盒转运蛋白家族的成员，并且可以催化大量的各种疏水阴离子的ATP依赖性转运，并且因此作用于去除II期产物至细胞外介质，在其中它们可以进一步代谢或排泄。
如本文所使用的，术语“OATP”意指有机阴离子转运多肽，其在肝脏中介导有机阴离子的钠(Na+)不依赖性转运，例如磺溴酞(BSP)以及缀合(牛磺胆酸盐)和未缀合(胆酸盐)胆酸(通过相似性)。OATP家族的3个重要成员是OATP-2(有时称为OATP-C或OATP1B1)、OATP-8(有时称为OATP1B3)和OATP-A(有时称为OATP1A2)。
如本文所使用的，术语“细胞色素P450还原酶”(也称为CPR)意指这样的蛋白质，它的生理功能是通过电子转移还原细胞色素P450酶并且因此是细胞色素P450酶介导的反应所需的。
术语“功能药物代谢酶”意指属于I期和II期酶的功能酶，其执行异生物质和药物的化学修饰，所谓的药物或异生物质代谢。
如本文所使用的，术语“功能活性”指通常在原代人肝细胞中检测出的有效可测量的肝细胞功能，例如对于药物转运蛋白可测量的药物转运和对于细胞色素P450s(CYPs)可测量的酶代谢。
如本文所使用的，术语“胚外内胚层(ExE)”意指分化的内胚层细胞，与定型内胚层相反，它将构成人发育中的胚胎外区室，例如卵黄囊。
如本文所使用的，术语“AAT”意指肝脏标记α-抗胰蛋白酶。
如本文所使用的，术语“载脂蛋白E”意指这样的一类脂蛋白，其携带胆固醇和其他脂肪作为小囊泡通过血流，并且是这些分子的正常分解所需的。载脂蛋白E是称为极低密度脂蛋白的特定脂蛋白的主要组分，其具有从血液中去除过量胆固醇并且将其携带至肝脏用于处理的主要功能。
如本文所使用的，术语“醇脱氢酶1”意指这样的一类脱氢酶，其促进醇和醛或酮之间的互换，伴随NAD+还原成NADH。醇脱氢酶1作用于分解否则可以是毒性的醇。
如本文所使用的，术语“AFP”意指肝脏标记甲胎蛋白。
如本文所使用的，术语“BSEP”意指胆汁转运蛋白胆汁盐输出泵。
如本文所使用的，术语“CK”意指肝脏标记细胞角蛋白(可互换使用)，具有不同亚型例如细胞角蛋白18(CK18)、细胞角蛋白19(CK19)、细胞角蛋白8(CK8)和细胞角蛋白7(CK7)。
如本文所使用的，术语“c-Met”意指肝细胞生长因子和/或散射因子受体。
如本文所使用的，术语“葡萄糖6磷酸酶”意指在糖质新生途径中使葡萄糖6-磷酸脱磷酸的酶，从而使得游离葡萄糖可以经由葡萄糖转运蛋白膜蛋白质从细胞中输出。葡萄糖-6-磷酸酶在肝脏和肾脏中发现，并且涉及器官的葡萄糖动态平衡作用。
如本文所使用的，术语“ICAM-1”意指细胞间粘附分子1(有时称为CD54)。
如本文所使用的，术语“LFABP”意指肝脏脂肪酸结合蛋白(可互换使用)。
如本文所使用的，术语“EpCAM”意指上皮细胞粘附分子(可互换使用)。
如本文所使用的，术语“FGF”指成纤维细胞生长因子，优选具有人和/或重组起源，和属于其的亚型是例如“bFGF”(指碱性成纤维细胞生长因子，有时也称为FGF2)和FGF4。“aFGF”指酸性纤维细胞生长因子(有时也称为FGF1)。
如本文所使用的，术语“BMP”指成骨蛋白，优选具有人和/或重组起源，并且属于其的亚型是例如BMP4和BMP2。
如本文所使用的，术语“HGF”指肝细胞生长因子，优选具有人和/或重组起源。
如本文所使用的，术语“Dex”指地塞米松。
如本文所使用的，术语“OSM”指制癌素M。
如本文所使用的，术语“ITS混合物”指胰岛素-转铁蛋白-硒混合物，例如来自Invitrogen的胰岛素-转铁蛋白-硒-A补充剂(100X)(目录号-51300-044)。
如本文所使用的，术语“DMSO”指二甲基亚砜。
如本文所使用的，可互换使用的“HNF3β”和/或“HNF3b”意指肝细胞核因子3，调节内胚层衍生组织例如肝脏、胰岛和脂肪细胞中的基因表达的转录因子。HNF3β有时也可以称为HNF3b或Fox2A，后面一个名称源于转录因子是叉头框(Forkhead box)转录因子家族成员。
如本文所使用的，可互换使用的“HNF4α”和/或“HNF4a”意指肝细胞核因子4α，对于肝脏发育、肝细胞特异性基因表达和胰脏β细胞基因表达调节关键的转录因子。
如本文所使用的，术语“NTCP”意指牛磺胆酸钠共转运多肽，并且是将胆酸从门静脉循环吸收到肝细胞内的转运蛋白。因此，胆酸的这种摄取是胆酸的肠-肝再循环的重要组分，并且因此对于足够的胆汁流动和正常肝脏功能是关键的。
如本文所使用的，术语“OCT-1”意指有机阳离子转运蛋白1。OCT-1是主要肝转运蛋白，其介导许多有机阳离子从血液摄取到肝脏内，在其中化合物可以代谢或分泌到胆汁内。
如本文所使用的，术语“MDR”意指多药抗性转运蛋白。MDR 1和3是转运蛋白ATP结合盒(ABC)家族成员，并且两者都是药物流出转运蛋白。MDR 1在调节药物、肽和异生物质进入体内的运输中以及在保护机体不受异生物质损伤和药物毒性中是重要的，而MDR 3是磷脂分泌到胆汁内必需的。
如本文所使用的，术语“Wnt3a”意指wingless相关的MMTV整合位点3A。
如本文所使用的，术语“活化素”意指TGF-β家族成员，其显示广泛范围的生物活性，包括细胞增殖和分化调节，例如“活化素A”或“活化素B”。活化素属于配体的常见TGF-β超家族。
如本文所使用的，术语“无异物”意指直接或间接暴露于非人动物组分的完全避免。
如本文所使用的，术语“分化诱导剂”意指诱导细胞分化的任何类型的因子，包括但不限于在围绕细胞的物理微环境中的化学制品、生物制品和组分；特别地，该术语用于外源性因子，即供应给培养物的因子。
如本文所使用的，术语“固有因子方案”指示分化通过暴露于分泌至培养基的固有因子诱导。可以采用下述方案：hBS细胞在IVF培养皿(Falcon)中的mEF细胞层上生长，并且在37℃、5％CO2和95％湿度下实施分化直至40天，以获得肝细胞样细胞。使用的培养基(具有加入的4ng/ml人重组bFGF[Invitrogen]的VitroHESTM[Vitrolife AB])每7至21天进行更换，通常每14天，通过弃去约1至2ml旧培养基并且加入1至2ml新鲜培养基。
饲养细胞
如本文所使用的，饲养细胞意指单独或组合使用的支持性细胞类型。细胞类型可以进一步具有人或其他物种起源。饲养细胞可以衍生自其的组织包括胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成人组织，并且它进一步包括衍生自皮肤的组织，包括包皮、脐带、肌肉、肺、上皮、胎盘、输卵管、腺、基质或乳腺。饲养细胞可以衍生自属于由人成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、角化细胞、内皮细胞和上皮细胞组成的群体的细胞类型。可以用于衍生饲养细胞的特定细胞类型例子包括胚胎成纤维细胞、胚外内胚层细胞、胚外中胚层细胞、胎儿成纤维细胞和/或纤维细胞、胎儿肌细胞、胎儿皮肤细胞、胎儿肺细胞、胎儿内皮细胞、胎儿上皮细胞、脐带间充质细胞、胎盘成纤维细胞和/或纤维细胞、胎盘内皮细胞、出生后包皮成纤维细胞和/或纤维细胞、出生后肌细胞、出生后皮肤细胞、出生后内皮细胞、成人皮肤成纤维细胞和/或纤维细胞、成人肌细胞、成人输卵管内皮细胞、成人腺子宫内膜细胞、成人基质子宫内膜细胞、成人乳腺癌实质细胞、成人内皮细胞、成人上皮细胞或成人角化细胞。当饲养细胞衍生自hBS细胞时，细胞可以是成纤维细胞。
在根据本发明的方法中(即，阶段I-III中的任何)，可以使用饲养细胞例如人或小鼠饲养细胞，或该方法可以没有任何饲养细胞的任何使用。在一个具体实施方案中，培养是无异物的。在另一个具体实施方案中(例如，当DE-Hep细胞用于治疗用途时)，细胞可以是自体细胞，即衍生自治疗的受试者。
如本文所使用的，术语“MEF细胞”意指小鼠胚胎成纤维细胞。
在本发明中，在本发明中使用特别考虑支持肝细胞生长的细胞培养基，例如HCM(肝细胞培养基)培养基、Williams E培养基和RPMIAdvanced培养基。
如由本文例子显而易见的，本发明涉及用于制备i)DE-Hep祖先(阶段II的结果)和ii)DE-Hep细胞(成熟DE-Hep祖细胞和阶段III的结果，还参见图1A和B)的分阶段方法。
DE-Hep祖细胞
根据本发明的DE-Hep祖先和DE-Hep细胞可以有利地用于治疗和/或预防几种肝疾病和病症。因此，根据本发明DE-Hep祖先和DE-Hep细胞可以在药剂中使用。
DE-Hep祖细胞是DE-Hep细胞的祖细胞，并且因此，它们适当地用于例如获得衍生自定型内胚层的代谢感受态肝细胞样细胞，或用于研究针对肝细胞样细胞的成熟。
如由下文描述显而易见的，本发明还涉及用于制备i)DE-Hep祖先和ii)DE-Hep细胞(其为成熟DE-Hep细胞)的分阶段方法。如图1中举例说明的，这种方法涉及DE细胞的形成，通过培养hBS细胞(阶段I)，其后从DE细胞获得DE-Hep祖细胞(阶段II)，和最终从祖先DE-hep形成成熟DE-Hep细胞(阶段III)。
阶段I
DE细胞通常通过在培养基中培养hBS细胞来获得，所述培养基包括活化素A和任选地一种或多种生长因子例如FGF2和血清尤其是FCS。还可以包括其他合适物质，例如Wnt3a。
该方法包括对hBS细胞实施培养条件，其中hBS细胞进行诱导以发育成定型内胚层细胞。阶段I包括在包括活化素的第一种阶段I培养基中培养hBS细胞2-6天，其中在培养1-2天后培养基由第二种阶段I培养基替换，所述第二种阶段I培养基包括活化素、一种或多种生长因子和在一个优选实施方案中血清。活化素A在某些情况下可以由类似物质例如活化素B或卵泡抑素替换。
第一种和/或第二种阶段I培养基都可以是RPMI高级培养基(RPMIadvanced medium)或DMEM培养基。这种第一种和/或第二种阶段I培养基可以进一步补充有一种或多种生长因子尤其是FGF2和/或Wnt3a，和血清尤其是胎牛血清(缩写为在本文中可互换使用的FBS或FCS)，如本发明的方案1、实施例2中显示的。
如实施例2(方案1-4)中显示的，hBS细胞可以根据下述方案之一进行培养：
第1天：第一种阶段I培养基包含活化素(例如，方案1)，
第1天：第一种阶段I培养基包含活化素和生长因子尤其是FGF2(例如，方案2和3)，
第1天：第一种阶段I培养基包含活化素(例如，方案4)。
第2天：第二种培养基包含活化素和血清(例如，方案1)，和任选地FGF2。
第2天：第二种培养基包含活化素、血清和生长因子尤其是FGF2(例如，方案2、3和4)。
第3和4天：第二种培养基包含活化素、FGF2和血清(例如，方案1)。
第3和4天：第二种培养基包含活化素、血清和生长因子尤其是FGF2(例如，方案2、3和4)。
在任何给定的上述培养基时供应给hBS细胞的活化素浓度可以在约80-120ng/ml范围中，例如90-110ng/ml、95-105ng/ml或100ng/ml。Wnt3A浓度将优选是约20ng/ml，例如25ng/ml、30ng/ml。最优选的是25ng/ml的浓度。
血清例如FBS的浓度可以在约0％至10％的范围中，例如0.1-5％或0.2-3％。如图1B中显示的，血清浓度在阶段I过程中可变，例如第一种阶段I培养基具有0％血清，例如随后为在第二种阶段I培养基中0.2％血清浓度，和在某些情况下甚至进一步增至例如1％FBS，如图1B中的方案4显示的。
阶段II-DE-Hep祖先
本发明涉及用于制备经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干(hBS)细胞的DE-Hep祖细胞的方法。
在阶段II时，繁殖得自阶段I的细胞，并且阶段II包括在阶段II培养基中培养来自阶段I的细胞，所述阶段II培养基包括一种或多种生长因子和任选地成骨蛋白，和任选地收获因此获得的DE-hep祖细胞。
通常，培养在培养基例如RPMI高级培养基或DMEM培养基、HCM培养基、基于William E的培养基或VitroHES等中进行。培养基通常补充有各种因子例如生长因子。FGF2、PEST和/或GlutaMAX是适当地包括在培养基中的物质例子。
培养基适当地例如每天或每隔一天进行更换。
此外，培养基可以包括一种或多种生长因子尤其是aFGF，和成骨蛋白尤其是BMP2。
在一个具体实施方案中，培养基进一步包括血清替代品或血清例如FBS，和在另一个具体实施方案中，培养基可以进一步包括HGF。
在一个具体实施方案中，DE-Hep祖先通过下述方法获得，其中DE细胞通过如上所述的方法获得，根据下述方案进行培养，如实施例2(方案1-4)中显示的：
阶段II的第1天至第4天：阶段II培养基包含FGF2、BMP4、一种或多种进一步的成骨蛋白尤其是BMP2、血清尤其是FBS、PEST和GlutaMAX、和任选地一种或多种进一步的生长因子尤其是aFGF(例如，方案1)，
阶段II的第1至8天：阶段II培养基包含HGF(例如，方案2)，
阶段II的第1至5天：阶段II培养基包含FGF4、BMP2(例如，方案3)，
阶段II的第1至3天：阶段II培养基包含FGF2、BMP4、血清尤其是FBS(例如，方案4)，
阶段II的第4至10天：阶段II培养基包含FGF2、BMP4、血清尤其是FBS、和HGF(例如，方案1)，
阶段II的第6至10天：HGF(例如，方案3)，
阶段II的第4至8天：阶段II培养基包含HGF、FGF2、EGF和血清例如FBS(方案4)
阶段II中的细胞优选培养8天，血清例如FBS的浓度在第6天时增加，并且生长因子尤其是EGF的补充剂在第6天时给予，并且从第6天到第8天培养基每天进行更换。
如实施例中显示的，浓度和优选实施方案可以包括：
方案1
补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有下述的RPMI高级培养基或DMEM培养基；
第5天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分别为100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)0.2％FCS。
第6天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分别为100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)0.2％FCS。
第7天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS。
第8天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS。
第9天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS。
相对高的HGF浓度(100-200ng/ml)可以用于第一天。
任选地第6-13天可以是；
第6天：BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2％FCS，
第7天：BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2％FCS
第8-9天：FGF1(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、1％FCS
第10天：HGF、FGF2(分别为50ng/ml、4ng/ml)、1％FCS
第11-13天：HGF、FGF2、EGF(分别为50ng/ml、4ng/ml、10ng/ml)、1％FCS
其中在第11至13天时可以给予更高的FCS浓度和EGF(10ng/ml)的补充剂。
备选地，BMP4、FGF2(分别为50ng/ml、4ng/ml)0.2％FCS可以用于第6-7天，随后为在第8-9天时的aFGF、FGF2(分别为50ng/ml、4ng/ml)1％FCS，和在第9-10天时的HGF、FGF2、EGF(分别为50ng/ml、2ng/ml、10ng/ml)1％FCS。
在另一个实施方案中，可以使用补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有HGF(20ng/ml)和0％FCS的HCM培养基或基于Williams E的培养基，其中HGF的浓度在第6-12天时是约20ng/ml。备选地，第6-15天可以通过(方案3)在第6-9天时使用FGF4、BMP2(分别为30ng/ml、20ng/ml)0％FCS，和在第10-15天时使用HGF(20ng/ml)0％FCS加以改变。
根据上文，当存在时，可见aFGF的浓度在约50至约200ng/ml的范围中，bFGF是约2-50ng/ml)，BMP2是约25-100ng/ml，BMP4是25-300ng/ml(一般而言，在阶段开始时采用比以后更高的浓度)，HGF是约25-300ng/ml)，FGF2是约1至约10ng/ml，FGF1是约25至约100ng/ml，EGF是约5-50ng/ml)，FCS是约0.1％-5％。
方案1的另一个实施方案可以包括
第1天：活化素A、bFGF(100ng/ml、5ng/ml)。
第2-5天：活化素A、bFGF(100ng/ml、5ng/ml)、0.2％FCS。
第5-7天：无培养基更换。
第8-14天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2％FCS。
第15-21天：补充有bFGF、HGF(2ng/ml、20ng/ml)的WME+SQ。
其中WME+SQ，补充有Dex、OSM bFGF、HGF(100nM、10ng/ml、2ng/ml、2ng/ml)。
其中Williams培养基E和SQ是包含谷氨酸、抗坏血酸、牛血清白蛋白、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素的SingleQuots。
DE-Hep祖先的表征
如本文例子中显示的，获得的DE-Hep祖细胞显示EpCAM、HNF1、HNF3b、HNF4a、结蛋白、CD133、c-kit、CAM1(＝CD54)、CK8、CK18和CK19中的一种或多种，例如2种或更多、4种或更多、6种或更多、8种或更多、10种或更多、12种或更多或全部的基因表达(参见实施例7、表2和实施例8)。
就DE-Hep祖先的表征而言的更多细节由段落“发明概述”、本文实施例和附图可见。
阶段III
如本文前文描述的，本发明的方法还提供经由hBS细胞衍生自DE细胞的DE-Hep细胞，即肝细胞样细胞。为了获得此种细胞，在上文描述的方法中包括进一步的阶段，即阶段III。阶段III涉及在培养基中培养如阶段II(和任选地阶段I)中所述获得的DE-Hep祖细胞，所述培养基例如基于Williams E的培养基、Leibovitz L-15培养基或HCM Cambrex培养基或可比较培养基，任选补充有单独或组合的分化和/或CYP诱导剂，例如DMSO、地塞米松、奥美拉唑、利福平、脱氧苯巴比妥、乙醇、异烟肼；
ITS混合物；
BMP和/或TGFP、OSM和/或EGF，尤其是BMP4和/或HGF。
在阶段III中，培养通常执行10-25天或更多天。
培养基通常每天更换直至第15天时，并且相关时，对于其余培养期每隔一天更换。
用于制备DE-hep祖细胞和DE-hep细胞的方法包括上文描述的合适阶段。
对于所有实施方案，如本文实施例1中所述的原材料可以适当地是以在下述专利申请中详细描述的下述4种不同方法获得的未分化的人胚泡衍生干细胞；
1.hBS细胞系建立和LOT制备(WO03055992)
2.hBS细胞转移至无饲养者的培养系统(WO2004099394)
3.无异物制备(WO2007042225)
4.酶促传代的hBS细胞(WO07107303)
当DE-hep细胞用于治疗用途时，无异物制备是特别重要的。
特别地，推荐作为原材料的hBS细胞或细胞系具有下述特征：对于碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81、Oct-4阳性对于SSEA-1阴性、端粒酶活性、以及在体外和体内的多能性(后者通过在免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤形成显示)。
如上所述，未分化的hBS细胞因此可以在本发明提及实施方案的任何中使用，这进一步包括下述具体5个实施方案：
实施方案1
实施方案2
实施方案3
实施方案4
实施方案5
上文提及的具体实施方案是本发明的举例说明。预期个别成分可以由具有相同功能性的物质替换，并且与所述浓度范围的偏离是可能的并且仍获得所需结果。
得自阶段III的DE-Hep细胞的表征
本发明还涉及通过上述阶段III获得的DE-Hep细胞，与使用相同种类的细胞但对细胞实施固有分化制备的细胞比较，其可能显示白蛋白、UGT2B7、CYP3A4、ADH1A、OATP-2、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6增加的蛋白质和/或基因表达，此处需要用于对照实验的方案的详述。
本发明进一步涉及这样的DE-hep细胞，其中与固有分化的细胞比较，白蛋白和/或UGT2B7和/或CYP3A4的蛋白质和/或基因表达中的增加是至少2倍，例如至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或更多倍。
本发明进一步涉及这样的DE-hep细胞，其中与固有分化的细胞比较，ADH1A和/或OATP-2和/或UGT1A6和/或CYP2C9和/或CYP2C19和/或CYP2D6的蛋白质和/或基因表达中的增加是至少2倍，例如至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或更多倍。
在一个具体实施方案中，本发明涉及这样的DE-hep细胞，其中与固有分化的细胞比较，白蛋白的蛋白质和/或基因表达中的增加是至少5倍，例如至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多倍，并且UGT2B7的蛋白质和/或基因表达中的增加是至少3倍，例如至少5倍、至少10倍、至少15倍或更多倍。
就DE-hep细胞的表征而言的更多细节由段落“发明概述”、本文实施例和附图可见。
在一个具体实施方案中，本发明涉及这样的DE-hep细胞，其中获得的细胞群体中至少20％的细胞或细胞核显示下述特征中的至少一种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种或全部：葡萄糖6磷酸酶、载脂蛋白E、CYP7A1(胆固醇7α羟化酶)、醇脱氢酶1、细胞色素P450还原酶、HNF4a、α-1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF3b、白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白和下述11种特征中的至少2种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种或全部
A.药物转运蛋白
i)至少1％的细胞或相关的细胞核显示BSEP的蛋白质和/或基因表达，
ii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MRP2的蛋白质和/或基因表达，
iii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OATP-2(＝OATP-C、OATP1B1)和/或OATP-8(OATP1B3)的蛋白质和/或基因表达，
iv)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OATP-A(＝OATP1A2)的蛋白质和/或基因表达，
v)至少1％的细胞或相关的细胞核显示NTCP的蛋白质和/或基因表达，
vi)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MDR1的蛋白质和/或基因表达，
vii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MDR3的蛋白质和/或基因表达，
viii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OCT-1的蛋白质和/或基因表达
B.药物代谢酶
ix)至少20％的细胞或相关的细胞核显示GST A1-1和GSTM1-1的蛋白质和/或基因表达，
x)至少5％的细胞或相关的细胞核显示下述CYPs-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4、-3A7和-7A1中的至少2种的蛋白质和/或基因表达，
xi)至少5％的细胞或相关的细胞核显示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。
在本发明的一个实施方案中，DE-Hep细胞可以经由I期细胞色素P450酶代谢药物。特别地，CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4可以在不存在诱导剂的情况下代谢药物。可以在研究DE-hep细胞代谢药物物质的能力的测定法中使用的物质是例如非那西丁、双氯芬酸和咪达唑仑，并且代谢产物可以通过LC-MS进行分析。必须指出DE-Hep细胞组成性表达药物代谢酶，并且因此能够代谢药物而无需诱导剂的影响。
在一个进一步的实施方案中，DE-Hep细胞具有与人原代肝细胞培养中的CYP活性组成相似的CYP活性组成。具体而言，在肝细胞样细胞中的CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9组成与人原代肝细胞培养中的组成可比较。与在人原代肝细胞培养中的组成比较，CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9之间的CYP活性组成可以相差30％、50％、75％和100％。
在本发明的一个实施方案中，DE-Hep细胞表达功能药物转运蛋白。特别地，通过ICG染料的摄取和释放测量OATP-2的表达，所述ICG染料指示细胞内功能药物转运蛋白的存在。此外，可以在DE-Hep细胞中发现其他药物转运蛋白例如OATP-8、OATP-A、MRP2、OCT-1、MDR1、MDR3和NTCP的蛋白质和/或基因表达。
此外，一部分DE-Hep细胞和DE-Hep祖先对于Notch-2可以是阳性的。Notch信号途径广泛用于胚胎发育以及成人和动态平衡维持中。它也是构成干细胞信号网络的关键途径之一。在哺乳动物中，迄今为止已鉴定了4种Notch受体(Notch1-Notch4)和5种结构上相似的Notch配体(Delta样1[也称为Deltal]、Delta样3、Delta样4、Jagged1和Jagged2)。Notch配体是单通道跨膜蛋白质。通过与在邻近细胞上表达的配体结合，激活Notch受体，这导致Notch细胞内结构域的蛋白酶解释放和核转位，这反过来调节分化。Notch-2在胚胎发育过程中广泛表达，并且在许多器官中具有关键作用。在肝脏中，Notch-2涉及肝内导管的形成和分化(Ader等人，2005，Kodama等人，2006)。因为肝脏样细胞通过干细胞产生，所以了解notch信号在这些细胞类型中的作用是重要的。
此外，DE-Hep细胞可以表达除UGTs和GSTs外的进一步II期酶，例如磺基转移酶。
DE-Hep细胞显示对于肝细胞的一般形态，即它们具有多边形细胞形状、大细胞直径(约25-50μM)，并且通常是具双核的。DE-Hep在培养中也以岛样簇亚组构。
葡萄糖6磷酸酶、载脂蛋白E、CYP7A1(胆固醇7α羟化酶)、醇脱氢酶1、细胞色素P450还原酶、HNF4a、α-1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF3b(HNF3B)、白蛋白和肝脏脂肪酸结合蛋白都是肝脏相关标记，并且像这样它们的表达指示肝细胞。然而，并非所有这些肝脏相关标记都必须在根据本发明的细胞群体的所有细胞中表达。即使仅表达这些标记之一的细胞也可以类似于肝脏细胞表现，并且因此可以用于上述目的，依赖于它们期望的用途。为了研究例如通过细胞的代谢，需要CYPs、GSTs和UGTs。为了研究摄取，OATPs是重要的，并且此外，对于排泄研究，例如BSEP或MRP-2可能是需要的。待执行的体内样研究越多，需要的这些特征越多。甚至更好的是潜在具有肝细胞样细胞连同其他肝脏细胞类型，例如巨噬细胞和枯否细胞，提供肝脏环境以及细胞间相互作用。这个类型的培养系统可以是一种或多种细胞类型包埋在其内的三明治(sandwich)形状。这个3D样和更体内的模拟情况可以潜在地进一步使得肝细胞样细胞显示极性，即显示一个细胞侧面朝向血液和一个细胞侧面朝向胆汁。对于毒性研究，由于其相互作用，I和II期代谢酶都是需要的。此外，希望细胞群体对已知药物诱导剂反应，由此可诱导例如I期和/或II期代谢酶。
在本发明的一个实施方案中，细胞群体中的至少约30％，例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％细胞具有上述特征i)-xi)中的至少3个。在一个具体实施方案中，至少一种，例如2种、4种、6种或全部特征属于药物转运蛋白组(即，特征i)-viii))和/或至少一种，例如2种、3种或4种特征属于药物代谢酶组(即ix)-xi))。
特征i)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白BSEP的蛋白质和/或基因表达。BSEP代表胆汁盐输出泵，并且是ATP结合盒(ABC)转运蛋白，其使用ATP水解的能量催化分子转运经过细胞外膜和细胞内膜，并且因此例如可以将药物输出到胆汁内(通常在体内位于称为肝细胞顶侧的侧面上)。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％细胞显示BSEP的蛋白质和/或基因表达。
特征ii)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白MRP2的蛋白质和/或基因表达。MRP2代表多药抗性蛋白质2，并且也是ABC转运家族成员且将药物代谢产物输出到胆汁内。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示MRP2的蛋白质和/或基因表达。
特征iii)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白OATP-2和/或OATP-8的蛋白质和/或基因表达。OATP-2和OATP-8代表有机阴离子转运蛋白2和8。两者都是OATP家族成员，已知例如吸收来自血液的毒性内源代谢产物和非生物物质。OATPs在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示OATP-2和/或OATP-8的蛋白质和/或基因表达。
特征iv)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白OATP-A的蛋白质和/或基因表达。OATP-A代表有机阴离子转运蛋白A，并且是OATP家族成员，已知例如吸收来自血液的毒性内源代谢产物和非生物物质。OATPs在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示OATP-A的蛋白质和/或基因表达。
特征v)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白NTCP的蛋白质和/或基因表达。NTCP代表牛磺胆酸钠共转运多肽，并且是将胆酸从门静脉循环吸收到肝细胞内的转运蛋白。胆酸的这种摄取是胆酸的肠-肝再循环的重要组分，并且因此对于足够的胆汁流动和正常肝脏功能是关键的。NTCP在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示NTCP的蛋白质和/或基因表达。
特征vi)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白MDR1的蛋白质和/或基因表达。MDR1代表多药抗性转运蛋白1，并且是转运蛋白ATP结合盒(ABC)家族成员。MDR1在调节药物、肽和异生物质进入体内的运输中以及在保护机体不受异生物质损伤和药物毒性中是重要的。MDR1在体内位于肝细胞朝向胆小管的顶侧上。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示MDR1的蛋白质和/或基因表达。
特征vii)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白MDR3的蛋白质和/或基因表达。MDR3代表多药抗性转运蛋白3，并且是转运蛋白ATP结合盒(ABC)家族成员。MDR 3是磷脂分泌到胆汁内必需的。MDR 3在体内位于肝细胞朝向胆小管的顶侧上。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示MDR 3的蛋白质和/或基因表达。
特征viii)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物转运蛋白OCT-1的蛋白质和/或基因表达。OCT-1代表有机阳离子转运蛋白1。OCT-1是主要肝转运蛋白，其介导许多有机阳离子从血液摄取到肝脏内，在其中化合物可以代谢或分泌到胆汁内。OCT-1在体内位于肝细胞朝向血液的底侧上。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示OCT-1的蛋白质和/或基因表达。
特征ix)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物代谢酶GST A1-1和/或GSTM1-1的蛋白质和/或基因表达。谷胱甘肽转移酶(GSTs)催化异生物质与谷胱甘肽的缀合，并且是II期解毒系统的重要部分。此外，在17种不同的人细胞溶质GST亚单位中分成命名为例如A、M、P和S的七个类别。GST A1-1是在体内成年人肝脏中最丰富的亚单位。GST M1-1也在成年人肝脏中表达，而GST P1-1在胎儿肝脏中表达至更高程度。在本发明的一个实施方案中，在包括肝细胞样细胞的细胞群体中的至少20％，例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示GST A1-1和/或GST M1-1的蛋白质和/或基因表达。此外，GST A1-1和/或GST M1-1的表达在特定情况下也可以由诱导剂诱导，因此，本发明还涉及这样的细胞群体，其中在添加诱导剂后，获得的至少20％，例如30％、40％、50％或更多细胞表达GST A1-1和/或GST M1-1蛋白质。
此外，细胞群体可以显示为展示GST酶促活性，这可以是在细胞群体的裂解物中0.01μmol/分钟/mg，例如至少0.03μmol/分钟/mg、至少0.05μmol/分钟/mg、至少1.0μmol/分钟/mg、至少0.07μmol/分钟/mg、至少0.09μmol/分钟/mg、至少0.11μmol/分钟/mg、至少0.13μmol/分钟/mg或至少0.15μmol/分钟/mg蛋白质。在另一个实施方案中，本发明涉及这样的细胞群体，其中GST酶促活性是在细胞群体的裂解物中至少0.4μmol/分钟/mg，例如至少0.6μmol/分钟/mg、至少0.8μmol/分钟/mg、至少1.0μmol/分钟/mg、至少1.2μmol/分钟/mg、至少1.4μmol/分钟/mg、或至少1.6μmol/分钟/mg蛋白质。
特征x)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示选自CYP450s-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4、-3A7和-7A1的药物代谢酶中的至少2种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种、至少12种或全部的蛋白质和/或基因表达。在本发明中，至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％获得的细胞显示上文提及的一种或多种CYP蛋白质的活性。此外，在一个具体实施方案中，获得的至少20％，例如至少30％、至少40％或更多细胞在添加诱导剂后可诱导表达至少一种上文提及的CYP蛋白质。
CYP代表细胞色素P450，并且是位于肝脏内质网中的一群酶。它们的作用是内源化合物和异生物质的代谢和解毒。高浓度的这些酶可以在肝脏和小肠中发现，但许多CYPs也在其他组织中发现。CYPs可以通过许多机制包括抑制和诱导加以改变，并且可以从人到人不同。CYP系统对于了解药物代谢、药物相互作用和药物诱导的肝毒性是重要的。
特征xi)涉及在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的细胞百分比，其在根据本发明的细胞群体中显示药物代谢酶UGT1A6和UGT2B7中的至少一种的蛋白质和/或基因表达。UGT代表尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶，并且是催化葡萄苷酸化活性的一群II期肝脏酶。在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。UGT也可以通过使细胞与诱导剂接触而诱导，并且因此，本发明还涉及如上所述的细胞组成，其中在添加诱导剂后可诱导UGT蛋白质的表达。
在本发明的一个实施方案中，在包括DE-Hep细胞的细胞群体中的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、至少90％或至少95％细胞显示下述CYP450s-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4、-3A7和-7A1中的至少2种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种、至少12种或全部的蛋白质和/或基因表达。
在一个具体实施方案中，在获得的细胞群体中的至少20％细胞具有所述药物转运蛋白特征i-viii)中的至少一种，和所述药物代谢特征ix-xi)中的至少一种，或获得的细胞群体的至少20％细胞具有所述特征中的至少4种，例如至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种或全部。
在本发明的一个具体实施方案中，细胞组成包括共表达CK18和上文提及的一种或多种CYP药物代谢酶，CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19组合，或CYP3A4和CYP3A7和/或CYP7A1组合的细胞。在一个具体实施方案中，获得的至少约5％，例如10％、15％、20％或更多细胞共表达CK18和CYP3A4和/或CYP3A7。
如上文中提及的，本发明提供了衍生自hBS细胞的改良DE-Hep细胞和DE-Hep祖细胞。改良DE-Hep细胞表达药物转运蛋白和/或代谢酶，确保与体内使用相同药物转运蛋白和代谢酶的肝细胞相似的药物摄取、分泌和代谢。因此，所有这些特征的表达是关于在药物开发和毒性测试中使用的细胞的所需特征，因为它们针对药物和化学制品的反应预期类似于在体内的肝细胞。
因此，本发明中公开的DE-Hep细胞和DE-Hep祖细胞有利地用于多种研究目的，例如，在药物开发过程中，在用于研究药物转运蛋白的体外模型中，在用于研究药物代谢酶的体外模型中，在用于研究肝生成例如早期肝生成的体外模型中，在用于研究人肝再生障碍的体外模型中，用于体外肝毒性测试。
其他方面
由于药物转运蛋白和药物代谢酶的表达，本发明的DE-Hep细胞和DE-Hep祖细胞良好地适合于在医学产品中使用。因此，在本发明中描述的细胞群体可以用于制造医学产品用于预防和/或治疗由组织退化引起的病理状态和/或疾病，例如肝脏组织退化，肝脏病症，例如选自下述的肝脏病症：自身免疫病症，包括原发性胆汁性肝硬化；代谢病症，包括血脂异常；由例如酒精滥用引起的肝脏病症；由病毒引起的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和甲型肝炎；由针对例如药学药物的急性中毒反应引起的肝脏坏死；和在患有例如肝细胞癌的患者中的肿瘤摘除，和代谢病理状态和/或疾病。
此外，根据本发明的DE-Hep细胞和DE-Hep祖细胞适当地用于筛选目的。例如，细胞可以在用于筛选化合物肝细胞毒性的方法中使用，所述方法包括使来自根据本发明的细胞群体的细胞暴露于化合物，并且测定化合物对细胞是否是毒性的。细胞还可以在用于筛选化合物调节肝细胞功能的能力的方法中使用，其包括使来自根据本发明的细胞群体的细胞暴露于化合物，测定细胞中起因于与化合物接触的任何表型或代谢变化，并且使变化与调节肝细胞功能的能力关联。
对于在再生医学中的用途，hBS细胞必须已衍生自无异物hBS细胞(参见实施例1)，并且此外，在分化、解离和潜在传代培养过程中从未直接或间接暴露于非人动物衍生的组分。这可以通过使用专一地人衍生组分例如重组培养基和添加剂来达到。
本发明在下述非限制性实施例和图中进一步举例说明。
图例
方法概述
图1a)。成为DE-Hep细胞的分化操作的示意性概述。分化方案分成3个主要阶段。关于基本方案的原材料由在小鼠胚胎饲养者(mEFs)上未分化的hBS细胞组成。在阶段I中，从第0天时的活化素A添加开始，hBS细胞经由中内胚层(MesEnd)诱导成定型内胚层(DE)。在阶段II中，DE经由原肠诱导成早期肝脏内胚层或肝脏祖细胞(DE-Hep祖先)。在阶段III过程中，DE-Hep祖先成熟为衍生自定型内胚层(DE-Hep细胞)的功能肝细胞样细胞，b)作为参考实施例2(即方案1)的本发明的一个具体实施方案，成为功能DE-Hep细胞的分化操作的示意性概述。方案2至4是参考实施例2在本发明中体现的备选方案。原材料的变化和/或在成为DE-Hep细胞的培养操作过程中的变化在实施例1和2中描述。
定型内胚层(DE)
图2。定型内胚层(DE)的形态；在培养第5天、阶段I时，用于衍生DE的活化素A处理hBS细胞的相衬图像。
图3。证实定型内胚层的免疫染色；通过活化素A诱导至定型内胚层的hBS细胞培养物的Sox17免疫荧光分析。在用活化素A4天后，绝大多数细胞是Sox17阳性和Sox7阴性的。
图4。图解显示在第5天时根据阶段I在生长因子的存在下培养的DE培养物(参见实施例2)、和对照培养物(不含活化素A的固有分化培养物)通过Q-PCR分析的HNF3b、Sox17、Cxcr4相对基因表达水平的代表性图。补充有活化素A和FGF2的培养物(灰色柱)与含活化素A的培养物(黑色柱)和不用补充剂衍生的对照培养物(白色柱)比较。
图5。图解显示在第5天时根据阶段I培养的DE培养物(参见实施例2)、和对照培养物(不含活化素A的固有分化培养物)通过Q-PCR分析的HNF4a、α-1-抗胰蛋白酶和AFP相对基因表达水平的代表性图。补充有活化素A和FGF2的培养物(灰色柱)与含活化素A的培养物(白色柱)和不用补充剂衍生的对照培养物(黑色柱)比较。
图6。如实施例2、阶段I中所述，与B)活化素A+bFGF处理的hESC培养物(SA002p70n＝7)比较，在A)活化素A中的基因表达QPCR分析的代表性图。在活化素和bFGF的存在下培养5天的DE培养物通过QPCR分析SOX17、SOX7、AFP、A1AT、CXCR4、FOXA2和CDX2的相对基因表达水平。补充有活化素A和bFGF/FGF2的培养物(条纹柱)与含活化素A的培养物(灰色柱)比较。用SA002 p29 n＝5也产生了可比较结果。
图7。所有小块都在log2尺度下用于显现关于所有样品的表达值。关于OCT4和Nanog的基因表达小块代表在这个实验中使用的所有未分化标记。为了检查培养物中的DE诱导，分析LEFTY1、LEFTY2、GOOSECOID、SOX17、HNF 3B、CXCR4，并且与固有分化培养物(EE)比较，在活化素A和bFGF处理的培养物中都是上调的。同时与固有分化培养物比较，AFP和CDX2在活化素A和bFGF处理的培养物中都是降低表达的。这产生活化素A和bFGF条件培养基诱导来自hBS细胞的DE。黑色箭头指向相关柱。
DE-Hep祖先
图8。来自阶段II的DE衍生的肝祖先(DE-Hep祖先)的形态。培养物强烈响应BMP4暴露，并且在阶段II培养基中2天后，获得相当异质的群体，在其中有许多上皮样细胞类型。在阶段II培养基中另外6-9天后，如图6中显示的，出现第一批多边形形状的细胞，其中某些是具双核的。
图9a-h)。hBS细胞衍生的DE-Hep祖先的EpCAM染色。a)根据阶段II在第8天时的DE培养物，用EpCAM抗体标记，b)相应区域的相衬图像。DE培养物强烈响应在阶段II中施加的生长因子，并且先前的同质上皮细胞使形态改变成多边形形状的细胞(也比较7c))。
c-h)DE-Hep祖先的EpCAM和CK19的形态和表达。c)在第17天时包含多边形形状细胞的DE培养物的相衬图像(白色箭头指向)，d)用EpCAM抗体和在e)中用CK19抗体标记的相应区域，f)EpCAM和CK19的重叠(在d、e和f中的白色箭头显示某些双阳性细胞)。g)在第14天时的DE-Hep细胞对于CD54是阳性的和，h)CK7。
图10a-b)。在阶段II/III中衍生自hBS细胞的晚期DE-Hep祖先/早期DE-Hep细胞。a，b)在阶段II培养基中在第8天时DE-Hep祖先的相衬图像，从传代当天计数总共培养20天。
功能DE-Hep细胞
图11a-b)。衍生自hBS细胞和c)衍生自SCED细胞的DE-Hep细胞。a，b)在阶段II培养基中在第12天时DE-Hep细胞的相衬图像，从传代当天计数总共培养23天。a)显示概观照片和在b)中相应更高倍的放大。应当指出细胞以簇排列，是具双核的并且显示肝细胞样形态。c)在培养第33天时，在阶段III时衍生自SCED细胞的DE-Hep细胞的相衬图像。应当指出白色箭头显示具有一般肝细胞样细胞形态的具双核的DE-Hep细胞。
图12a-b)。在MEFs上的hBS细胞的固有分化产生的肝细胞样细胞，例如无特定补充剂加入培养基和很少的VitroHESTM培养基更换(比较专利申请WO2007/140968A1)用作对照。a)肝细胞样细胞位于hBS细胞集落周围。b)在这些条件下衍生的肝细胞样细胞的特写显示细胞高度富含甘油三酯。
图13a-g)。在阶段III过程中DE-Hep培养物的CYP表达。在阶段III时的DE-Hep细胞的免疫荧光标记显示强CYP1A2免疫反应性a)，而在对照培养(固有分化)中的肝细胞样细胞显示较低的CYP1A2免疫反应性(未显示)，b)CYP1A2和用DAPI的核复染。DE-Hep细胞还显示c)CYP3A4免疫反应性，d)核DAPI和CYP3A4的重叠。用e)使CYP3A4、CK18和DAPI的在阶段III免疫荧光标记的相应DE-Hep细胞培养物更高倍放大会并成一个图，f)CYP3A4，和g)CK18。
图14a-c)。在显示细胞的功能活性的DE-Hep细胞中的有机阴离子转运蛋白MRP2基因的免疫荧光分析。MRP2免疫反应性在DE-Hep细胞中发现，并且显示一般的表达模式，a)显示形态的相衬图像，和b)在阶段III、21天时在DE-Hep细胞中的MRP2免疫反应性。c)在1小时温育后在DE-Hep细胞中的吲哚花青绿(ICG)摄取(环绕区域)的相衬图像。接着过夜后清除。
图15。在DE-Hep细胞中的糖原贮积显示细胞的功能性。在阶段III培养第21天时，在低a)和高放大率b)下DE-Hep细胞的相衬图像，显示糖原贮积的暗区。应当指出b)中的某些细胞是具双核的且贮存糖原(白色箭头)。
图16。在DE-Hep培养物中经由CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的功能药物代谢和CYP表达的诱导性。
衍生自几个hBS细胞系的DE-Hep细胞、从不同供体分离的人原代肝细胞和肝细胞瘤细胞系HepG2就其代谢CYP1A2底物非那西丁、CYP3A4底物咪达唑仑和CYP2C9底物双氯芬酸的能力进行分析。
A)在用不同DE方案衍生自不同hBS细胞系的DE-Hep培养物上的CYP活性测定法的代表性结果。应当指出，衍生自不同hBS细胞系的DE-Hep培养物在关于CYP1A2、3A4和CYP2C9的代谢活性方面不同，导致对于不同hBS细胞系一般的CYP活性谱。B)此外，来自不同供体的人原代肝细胞显示CYP活性谱的高个体间变异，类似于衍生自不同hBS细胞系的DE-Hep培养物。肝细胞瘤细胞系HepG2主要显示CYP1A2活性。C，D)在用CYP诱导剂的混合物处理后，DE-Hep培养物显示CYP1A2活性超过3倍的上调(C)，以及CYP1A2mRNA和CYP3A4mRNA水平的3-4倍增加(D)。结果呈现为nM代谢产物(B，C)、log[nM代谢产物](A)和RNA表达中的改变倍数(D；未处理的DE-Hep培养物设为1)。
图17。衍生自DE细胞的DE-Hep祖先的形态，所述DE细胞已从MEF转移到Matrigel包被平板上。在阶段II培养基(参见实施例2)的存在下，细胞朝向肝祖细胞快速分化以及增殖。在阶段II中第16天时，许多细胞是EpCAM、CK7、CK19和CD54免疫阳性的(数据未显示，关于在DE-Hep祖先中表达的标记比较表2)。
图18。在DE-Hep细胞中与人原代肝细胞和HepG2细胞的基因表达比较。关于进一步细节参见实施例13。
图19。在DE-Hep培养物中的II期酶表达。hBS细胞系SA167、SA002和SA461就II期酶谷胱甘肽转移酶GSTA1-1(A)和磺基转移酶SULT1E1(B)的表达进行分析。在未分化的hBS培养物(缩写为UD)中，2种II期酶的表达都很低，并且随后在DE-Hep培养物(缩写为DE)和固有分化的hBS培养物(缩写为EE)中，在hBS细胞培养物的分化过程中上调。hBS细胞培养物在第04、10和20天时进行分析。作为对照，使用HepG2和培养的人原代肝细胞(铺平板且培养48小时；缩写为PPH)。
图20。通过无饲养者的培养条件或通过延长培养期改善在DE-hep细胞中的CYP2C9 mRNA表达。在SA002(灰色柱)和SA348(黑色柱)中相对于看家基因CREBBP的CYP2C9mRNA表达。在1次实验中3次生物学重复，除仅以一个重复完成的42天的SA348外。
图21。在衍生自2个不同方案的细胞中相对于看家基因CREBBP的白蛋白、CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4的mRNA表达水平：我们的DE-Hep方案(黑色柱)和由Cai等人公开的方案(灰色柱)。显示相对于Cai方案的表达水平。
图22。相应同种型用作对照用于单克隆抗体的非特异性结合(图22，A)。约33.5％的所有计数细胞(DAPI)在DE-Hep培养物对于是CYP1A2阳性的(计数4218个细胞)(图22，BI/II)。原代肝细胞由52％CYP1A2阳性细胞组成(计数20000个细胞)(图22，CI/II)。有趣的是，DAPI谱描述了在DE-Hep和原代肝细胞中的单核、双核和多核细胞(图22，B，C)。
图23。在用活化素A(黑色柱)或活化素B(灰色柱)处理的hESCs中，相对于看家基因CREBBP，在定型内胚层中表达的基因(Foxa2、Sox17和CXCR4；DE)或在胚外组织中表达的基因(Sox7、CDX2和AAT；ExE)的mRNA表达。一次实验使用5次生物学重复。DE＝定型内胚层，ExE＝胚外组织。
材料与方法
方法
原材料
合适的材料，未分化的人胚泡衍生干细胞可以以在下述专利申请中详细描述的下述4种不同方法获得；
1.hBS细胞系建立和LOT制备(WO03055992)
2.hBS细胞转移至无饲养者的培养系统(WO2004099394)
3.无异物制备(WO2007042225A3)
4.酶促传代的hBS细胞(WO07107303)
当DE-hep细胞用于治疗用途时，无异物制备是特别重要的。
实施例
实施例1
原材料
用于本发明的原材料适当地是多能未分化的hBS细胞，例如未分化的hBS细胞系。此种材料可以得自Cellartis AB，www.cellartis.com。Cellartis AB是全世界限定hBS细胞系的最大来源，并且目前具有超过30种可用的hBS细胞系和亚克隆。2种细胞系在National Institutes of Health(NIH)Human Embryonic StemCell Registry，http://stemcells.nih.gov/research/registry/中列出，并且20种在UK Stem Cell Bank中。此外，Cellartis可以提供由主要市场例如日本、德国和法国批准用于研究用途的hBS细胞系。对于本发明，具体使用hBS细胞系SA002、SA002.5、SA034、SA167、SA181、SA348和SA461。推荐作为原材料的hBS细胞特征是下述：对于碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81、Oct-4阳性、对于SSEA-1阴性、端粒酶活性、以及在体外和体内的多能性(后者通过在免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤形成显示)。(方法和方案如先前显示的，Heins等人，WO03055992。)
LOT制备和表征程序
hBS细胞系的LOT制备构成hBS细胞在培养中的扩增和在单次传代中后续冷冻超过100根吸管，根据标准化方法(未决专利，WO2004098285)。在冷冻前和后以及在细胞从LOT解冻后在后续培养中的连续传代中监控hBS细胞系的形态。通过检查解冻恢复率验证LOT冷冻的质量，所述解冻恢复率应对于解冻的10根中的每一根吸管显示100％的解冻率，即细胞材料可以在解冻后从每个个别玻璃化的吸管传代培养。随后对在冷冻传代中的细胞和培养基执行关于微生物安全性的安全性测试，以确保细胞不含污染。执行的表征程序包括广泛范围的方法，以验证hBS细胞系的分化状态。首先，执行关于未分化细胞的通常公认标记的标记表达分析(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4和ALP)。通过核型分析和FISH检查细胞在传代和冻-融循环自始至终的遗传稳定性。使用Telo TAGGG Telomerase PCRELISAPLUS试剂盒测量端粒酶活性。通过体外分化经由胚状体步骤且通过体内分化通过将hBS细胞移植在免疫缺陷SCID小鼠的肾囊下检查hBS细胞的多能性。
此外，本文使用的原材料可以是完全无异物衍生的，由此可以获得完全无异物的肝细胞样细胞用于在再生医学中的潜在转移，并且因此显著减少移植物排斥的风险和非人病原体的潜在转移。对于hBS细胞的无异物衍生，使用的所有培养基和基质组分、饲养细胞和其他材料可能不衍生自任何非人动物材料或与任何非人动物材料接触。用于hBS细胞和进一步无异物肝细胞样细胞的无异物衍生的合适组分是无异物衍生的人成纤维细胞，例如人包皮成纤维细胞(HFF)，含人重组生长因子、分化因子和/或潜在的其他添加剂的无血清或基于人血清的培养基，和人重组酶或用于细胞解离和繁殖的无菌机械工具。
此外，用于衍生DE-Hep细胞的原材料是在饲养细胞例如小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞或在无饲养者的系统中在例如Matrigel或Collagen等表面上的hBS细胞。在实验前和/或在实验过程中在相同种类的基质或不同基质和相同种类的培养基或不同培养基上，hBS细胞可以进行酶促和/或手工传代。
实施例2
使未分化的hBS细胞诱导成DE且进一步成为功能肝细胞
在体外维持且繁殖未分化的hBS细胞。在传代后第4-7天时，根据基本分化程序处理未分化的hBS细胞集落。这个方案中的每个步骤的特征在于决定性的关键组分；
阶段I，定型内胚层(DE)：低血清和活化素A
阶段II，DE-Hep祖细胞：蛋白质TGFβ超家族成员，特别是BMP4
阶段III，功能DE-Hep细胞：HGF
已测试了生长因子暴露时间、浓度、它的各种组合和处理长度中的变化
基本方法和变化的概述呈现于图1a中。通过在RPMI Advanced培养基或DMEM培养基或可比较培养基(阶段I，第0天)中与活化素A(100ng/ml)一起温育3-5天，使未分化的hBS细胞诱导为DE。培养基每天进行更换。活化素A诱导的第一天，血清浓度是零，并且培养基补充有或没有Wnt3A(25ug/ml)和/或FGF2。从阶段I的第二天开始，培养基补充0.2％FCS、活化素A和/或FGF2。在活化素诱导后，使细胞在其条件培养基中温育另外1-3天，而无培养基更换，这之后阶段II开始(基本方案的变化)。在阶段II过程中，细胞在RPMIAdvanced培养基或DMEM培养基或可比较培养基中温育，所述培养基在顺次步骤中补充有BMP4和FGF2和/或不同浓度的aFGF、bFGF、BMP2和HGF(参见基本方案的变化，图1a)。培养基每天至每隔一天进行更换。在阶段III过程中，使DE衍生的肝细胞(DE-Hep细胞)成熟。
阶段I：分化成定型内胚层
先前已显示在暴露于定义明确的生长因子(活化素A)后，hBS细胞可以分化成定型内胚层细胞类型。在本发明中，几种细胞系(SA001、SA002、SA002.5、SA034、SA167、SA181、SA348和SA461)已通过生长因子(GFs)诱导，以经由定型内胚层(DE)产生肝细胞，这随后称为DE-Hep细胞。我们的策略涉及模拟肝脏发育中的重要步骤的3个分化阶段，如下所述。在第一个分化阶段中(阶段I，参见图1a)，活化素A诱导hBS细胞成为DE，这花费1至5天。在阶段II中，通过BMP4和/或其他因子诱导早期肝脏细胞类型，并且这些早期肝脏细胞扩增且成熟。在最后一个阶段中，阶段III，通过HGF、OSM、DEX达到终末成熟，共高达数天(图1a)。
使用活化素A以及活化素A与Wnt3a和/或FGF2组合以产生DE。在阶段1中4至5天后，hBS细胞集落分化，并且使用定量实时实时PCR(Q-PCR)检查关于早期DE的遗传标记。在第3至5天时，活化素A诱导强早期内胚层波，并且通过Sox17、HNF3β(HNF3b或HNF3b)和Cxcr4表达的高表达水平突出(图4)，并且随后减少至接近基线水平(数据未显示)。有趣的是，与单独的活化素A比较，活化素A和FGF2的组合产生Sox17(高超过2倍)、HNF3b(高超过1.5倍)和Cxcr4(高将近1.5倍)的更高表达(图4)。未处理的hBS细胞具有比生长因子处理的培养物明显更少的Sox17、HNF3b和Cxcr4。此外，对照培养物具有明显更少的Sox17、HNF3b和Cxcr4基因表达。此外，它们上调早期肝脏标记如AFP或AAT。在分化和发育的这个早期阶段时，这指示在固有分化集落中胚外内胚层(ExE)的存在(图5和10)。表达数据通过Sox17/Sox7、Sox17/Cxcr4、Sox17/Oct4、Sox7/HNF3b的共染色加以证实(数据未显示)。在活化素A中4天后，超过70％的其余细胞是Sox17阳性，并且仅发现少数是Sox7或对于HNF3b和Oct4是双阳性的。在活化素A处理后的基因表达改变与集落的形态改变和不同的分化模式相关(图2)。在用含活化素A培养基诱导4至5天后，细胞集合在一起，并且在集落周围形成上皮细胞环。这些同质生长的细胞扩展跨过平板，并且可以传代给包含小鼠饲养细胞的平板和/或其他基质。这些发现一起显示在暴露于活化素A后，本文使用的所有细胞系都能够分化成定型内胚层细胞类型。此外，早期出现的高AFP表达水平指示未处理的固有分化的hBS细胞培养物主要产生胚外内胚层(ExE)。参见图4和5、实施例5。
阶段II：肝诱导
在阶段II中(图1)，使细胞暴露于生长因子组合以诱导肝脏发育。培养物强烈响应生长因子添加的培养基，并且形成以小簇成群的同质上皮细胞。在更多天后，相当异质的肝脏样细胞群体发展，在其中许多细胞类型以簇集合在一起(图6)。此外，在第二个阶段中，在6-9天后(在通过活化素A诱导后)，出现具有少数具双核的细胞的第一批多边形形状的细胞(图6)。
通过基因表达分析评估这些形态改变是否与在分子水平上的不同分化模式相关。通过Q-PCR分析整个切断的集落，显示在两者中，对照与生长因子诱导的培养物一样，可以检测出早期肝脏标记AFP、HNF4a、HNF3b、白蛋白、CK7、CK8、CK18、CK19和HNF1a的表达。在暴露于肝脏特异性因子后(阶段II)，与对照培养物比较，肝脏标记的水平明显更高。
为了支持通过Q-PCR获得的发现，执行免疫组织化学分析。对照以及阶段II培养物都表达早期肝脏标记。
阶段III：肝成熟
在阶段III中，培养物随后更换成包含HGF、FGF2和FGF1的培养基2-3天。在方案1，本发明的一个具体实施方案中(图1b)，培养基在阶段II过程中更换成包含不同浓度的aFGF、bFGF、BMP2、BMP4、HGF且含0.2％血清的不同培养基。在这些阶段时，出现许多DE-Hep细胞，并且显示具有多边形形状、包含具有核仁的特征性核的一般肝细胞形态。有趣的是，在中至晚期阶段II时开始，它们以小岛样簇排列(图6和9)。
在阶段III过程中，细胞在HCM培养基中进一步培养用于成熟。在这个阶段时，切断整个集落且通过Q-PCR进行分析。结果显示与固有衍生的肝细胞样细胞比较，肝细胞标记(白蛋白、CYP3A4和UGT2B7)的表达明显上调。在2个方案中在末期时的免疫染色显示许多DE-Hep细胞对于是CYP1A2、CYP3A4/7、CK18、CK8、CK19和HNF4α阳性的(表2)。有趣的是，可以在DE-Hep培养物而不是未处理的对照培养物中检测出极化转运蛋白MRP2的表达。对照培养物是固有分化的细胞，参见定义。
本发明的一个具体实施方案，方案1：
下述具体条件在这个具体实施方案，方案1中使用，参见图1b。
阶段I：DE诱导
通过补充有1％PEST、1％Glutamax和FGF2(4或5ng/ml)且另外具有下述的RPMI高级培养基或DMEM培养基或可比较培养基中培养在阶段I中诱导定型内胚层；
第1天：活化素A、Wnt3A(100ng/ml、25ng/ml)0％FCS
第2天：活化素A(100ng/ml)0.2％FCS
第3天：活化素A(100ng/ml)0.2％FCS
第4天：活化素A(100ng/ml)0.2％FCS
细胞无需培养基更换培养2-3天。该方案使培养基补充剂活化素A和bFGF组合。
阶段II：DE-Hep祖先扩增
对于DE-Hep祖先的衍生和扩增，使用补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有下述的RPMI高级培养基或DMEM培养基或可比较培养基；
第5天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分别为100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)0.2％FCS。
第6天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分别为100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)0.2％FCS。
第7天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS。
第8天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS。
第9天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS。
DE-Hep祖先在阶段II培养基中从第9天培养直到第20天，伴随每隔一天的培养基更换。相对高的HGF浓度(100-200ng/ml)用于第一天。
任选地；
第6天：BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2％FCS，
第7天：BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2％FCS
第8-9天：FGF1(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、1％FCS
第10天：HGF、FGF2(分别为50ng/ml、4ng/ml)、1％FCS
第11-13天：HGF、FGF2、EGF(分别为50ng/ml、4ng/ml、10ng/ml)、1％FCS
考虑到在第11至13天时较高的FCS浓度和EGF(10ng/ml)的补充，每天更换50％的培养基。
阶段III：DE-Hep成熟
对于衍生自定型内胚层(DE-Hep细胞)的肝细胞成熟，使用基于Williams E的培养基或HCM培养基或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax，并且在第10天时另外具有：OSM、Dex、ITS混合物、BMP4、HGF(分别为10ng/ml、10-7M、1x、200ng/ml、50ng/ml)、0％FCS。直至第15天时，培养基每天进行更换。
高HGF浓度(100-200ng/ml)用于长于6天的温育。使用高浓度的地塞米松(Dex)(100μm)。在第15天后，使用补充有丁酸钠、HGF(分别为2.5mM，2.5ng/ml)和0％FBS的基于Williams E的培养基(1％PEST，1％Glutamax)。从第16到21天每隔一天更换培养基。
本发明的一个具体实施方案，方案2：
下述具体条件在这个具体实施方案，方案2中使用，参见图1b。
阶段I：DE诱导
通过补充有1％PEST、1％Glutamax、bFGF(4或5ng/ml)且另外具有下述的RPMI高级培养基或DMEM或可比较培养基中培养在阶段I中诱导定型内胚层；
第1天：活化素A(100ng/ml)0％FCS
第2-3天：活化素A(100ng/ml)0.2％FCS
细胞无需培养基更换培养2天。该方案使培养基补充剂活化素A和bFGF组合。
阶段II：DH-Hep祖先扩增
对于DE-Hep祖先的衍生和扩增，使用HCM培养基(在某些情况下，省去HCM-抗生素混合物GA1000)或基于Williams E的培养基或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有HGF(20ng/ml)和0％FCS。
第6-12天：HGF(20ng/ml)0％FCS
DE-Hep祖先在阶段II培养基中从第6天培养直到第12天，伴随每2-3天的培养基更换。
阶段III：DE-Hep成熟
对于衍生自定型内胚层(DE-Hep细胞)的肝细胞成熟，使用HCM培养基(在某些情况下，省去HCM-抗生素混合物GA1000)或基于Williams E的培养基或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax，并且在第13天时另外具有：OSM、Dex(10ng/ml、10-7M)、0％FCS。每2-3天更换培养基。DE-Hep细胞在这种培养基中培养最少22天且直至35天。
在某些情况下，在分析DE-Hep培养物的最后数天或最后一周过程中省去EGF或抗坏血酸，并且观察到对细胞成熟和功能性的正面作用。不含EGF和抗坏血酸，增殖不再受刺激，相反这导致增加的成熟。
本发明的一个具体实施方案，方案3：
下述具体条件在这个具体实施方案，方案3中使用，参见图1b。
阶段I：DE诱导
通过补充有1％PEST、1％Glutamax、bFGF(4或5ng/ml)且另外具有下述的RPMI高级培养基或DMEM或可比较培养基中培养在阶段I中诱导定型内胚层；
第1天：活化素A(100ng/ml)0％FCS
第2-3天：活化素A(100ng/ml)0.2％FCS
细胞无需培养基更换培养2天。该方案使培养基补充剂活化素A和bFGF组合。
阶段II：DE-Hep祖先扩增
对于DE-Hep祖先的衍生和扩增，使用HCM培养基(在某些情况下，省去HCM-抗生素混合物GA1000)或基于Williams E的培养基或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有下述。
第6-9天：FGF4、BMP2(分别为30ng/ml、20ng/ml)0％FCS
第10-15天：HGF(20ng/ml)0％FCS。
DE-Hep祖先在阶段II培养基中从第6天培养直到第15天，伴随每2-3天的培养基更换。
阶段III：DE-Hep成熟
对于衍生自定型内胚层(DE-Hep细胞)的肝细胞成熟，使用HCM培养基(在某些情况下，省去HCM-抗生素混合物GA1000)或基于Williams E的培养基或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax，并且在第16天时另外具有：OSM、Dex(10ng/ml、10-7M)、0％FCS。每2-3天更换培养基。DE-Hep细胞在这种培养基中培养最少22天且直至35-40天。
在某些实验中，在分析DE-Hep培养物的最后数天或最后一周过程中省去EGF或抗坏血酸，并且观察到对细胞成熟和功能性的正面作用。不含EGF和抗坏血酸，增殖不再受刺激，相反这导致增加的成熟。
本发明的一个具体实施方案，方案4：
下述具体条件在这个具体实施方案，方案4中使用，参见图1b。
阶段I：DE诱导
通过补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有下述的RPMI高级培养基或DMEM或可比较培养基中培养在阶段I中诱导定型内胚层；
第1天：活化素A(100ng/ml)0％FCS
第2-3天：活化素A、FGF2(分别为100ng/ml，4ng/ml)0.2％FCS
第4-5天：活化素A、FGF2(分别为100ng/ml，4ng/ml)1％FCS
每天更换50或100％培养基。该方案使培养基补充剂活化素A和bFGF组合。
阶段II：DE-Hep祖先扩增
对于DE-Hep祖先的衍生和扩增，使用RPMI高级培养基或DMEM或或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax且另外具有下述；
第6-7天：BMP4、FGF2(分别为50ng/ml、4ng/ml)0.2％FCS。
第8-9天：aFGF、FGF2(分别为50ng/ml、4ng/ml)1％FCS。
第10-12天：HGF、FGF2、EGF(分别为50ng/ml、2ng/ml、10ng/ml)1％FCS。
DE-Hep祖先在阶段II培养基中从第6天培养直到第12天，伴随每1-3天50或100％的培养基更换。
阶段III：DH-Hep成熟
对于衍生自定型内胚层(DE-Hep细胞)的肝细胞成熟，使用HCM培养基(在某些情况下，省去HCM-抗生素混合物GA1000)或基于Williams E的培养基或可比较培养基，并且补充有1％PEST、1％Glutamax，且另外具有下述；
第13-14天：OSM、ITS混合物、HGF(分别为10ng/ml、1x、50ng/ml)、0％FCS
第15-26天：OSM、ITS混合物、HGF、Dex(分别为10ng/ml、1x、50ng/ml、10-7M)、0％FCS
每1-3天更换50或100％培养基。
在某些实验中，在分析DE-Hep培养物的最后数天或最后一周过程中省去EGF或抗坏血酸，并且观察到对细胞成熟和功能性的正面作用。不含EGF和抗坏血酸，增殖不再受刺激，相反这导致增加的成熟。
实施例3
定型内胚层的形态，阶段I
活化素A处理与集落的形态改变和不同的分化模式相关。在通过含活化素A培养基处理3-5天后，细胞集合在一起，并且在集落周围形成上皮细胞环(图2)。这些同质生长的细胞扩展跨过平板，并且可以传代给包含小鼠饲养层的平板。
实施例4
用免疫细胞化学和定量分析表征定型内胚层
在早期分化阶段时，Sox7可以视为关于胚外内胚层(ExE)的标记，并且在定型内胚层(DE)中不表达(D′Amour等人，2006)。Sox17阳性细胞存在于ExE和DE中。这暗示Sox17+/Sox7-细胞具有DE起源。执行用Sox7和Sox17的免疫染色，以证实DE-Hep细胞已由定型内胚层产生。用活化素A4天后，绝大多数细胞是Sox17阳性和Sox7阴性的(图3)。
活化素A诱导通过Sox17+/Sox7-组合检测出的定型内胚层，活化素A或活化素A/FGF2处理的培养基中80-90％的总细胞估计是Sox17阳性且对于Sox7阴性的(显微镜中的人工计数)。对照培养物主要诱导其为Sox17/Sox7阳性的胚外内胚层。
实施例5
通过定量实时PCR的定型内胚层的基因表达
为了研究在不同细胞类型中的基因表达水平，使用TaqMan低密度阵列(384-孔Micro Fluidic Cards，Applied Biosystems)。对于比较，平行分析来自胎儿肝脏、人成年肝脏、铺平板的人原代肝细胞、新鲜分离的人原代肝细胞和HepG2的商购可得的总RNA。使用Superscript 3(目录号18080-051 Invitrogen)执行cDNA分析。相对基因表达水平针对CREBBP的表达进行标准化。
在补充有活化素A的培养基中诱导5天的hBS细胞的Q-PCR分析显示8种基因的表达水平。活化素A诱导强早期内胚层波，并且通过Sox17、HNF3b和Cxcr4的高表达水平突出。有趣的是，与单独的活化素A比较，活化素A和bFGF产生Sox17、HNF3b和Cxcr4的更高表达。未处理的hBS细胞具有比生长因子处理的培养物明显更少的Sox17、HNF3b和Cxcr4。此外，对照培养物(固有分化)具有明显更少的Sox17、HNF3b和Cxcr4基因表达，加上早期肝脏标记如AFP和A1AT的上调。在分化和发育的这个早期阶段时，这指示在固有分化集落中胚外内胚层的存在。CXCR4在中胚层和定型但不在原始内胚层中表达[McGath KE.等人Embryonic expression and function of the chemokine SDF-1 and its receptor，CXCR4.Dev.Biol.213：442-45(1999)]，并且因此与Sox17和/或HNF3b组合是关于DE的极佳标记。Sox17和HNF3b是关于早期定型和原始内胚层的2种标记。TGFβ超家族成员Noda1是在小鼠中的原肠胚形成过程中内胚层指定所需的。高水平的Noda1信号指定定型内胚层，并且较低水平的Noda1信号指定中胚层[Lowe，LA.，Yamada，S.，Kuehn，N.R.，Genetic dissection of noda1 functionin patterning the mouse embryo.Development 128，1831-1843(2001)；Brennan，J.等人Nodal signalong in the epiblastpatterns the early mouse embryo.Nature 411，965-969(2001)]。活化素也是TGFβ家族成员，并且与和Noda 1相同的受体结合(除共受体cripto外)，触发与LEFTY1和LEFTY2诱导相似的细胞内信号事件[de Caestecker，M.The transforming growth factor-betasuperfamily of receptors.Cytocine Growth Factor Rev.15，1-11(2004)]，并且因此可以用于在体外模拟Noda1活性。关于基因表达数据，参见图4和5。
通过QPCR在几个实验中更广泛显示进一步证据，与单独的活化素A比较，活化素A和bFGF的组合产生DE标记的更高表达和胚外内胚层标记的更低表达(SA002 p70n＝7，SA002p29n＝5)(图6)。与单独的活化素A比较，Sox17、HNF3B/HNF3b和CXCR4在活化素A和bFGF处理的培养物中全都明显更高。与单独的活化素A比较，DE细胞数目在活化素A和bFGF处理的培养物中更高(图6)。与活化素A和bFGF处理的培养物比较，活化素A处理的培养物具有胚外内胚层标记AFP、A1AT和CDX2的更高表达，显示与单独的活化素A比较，活化素A与bFGF组合产生更定型的内胚层。关于基因表达数据，参见图6。
实施例6。
总体基因表达：DE与EE诱导的肝细胞比较
用于一种基因的几种探针
一种探针代表特定mRNA转录物(剪接变体)，并且这些转录物可以显示完全不同的表达谱。因为这是关于转录水平的数据，所以当对蛋白质表达作图时，它有时引起混乱。为了了解何种剪接变体编码目的蛋白质，可以使用不同策略：1)可以选择具有最高表达的变体；2)可以计算平均值；3)可以选择预期表达谱的“生物学”解释。如果基因是众所周知的，那么已使用第三种备选方案。关于了解较少的基因，已使用第一种策略。每个探针具有指示探针如何特异的标记。探针名称包括在图表中的左侧上。关于缺乏非常特异的探针的基因，已显示最特异的可用探针。小于1的值在log2范围中是负值，参见下表。
使用使光刻法和固相化学组合的技术制造GeneChip探针阵列。以这种方式，产生包含以极高密度包装的成百上千种寡核苷酸探针的阵列。目前，Affymetrix提供GeneChips用于监控基因在酵母、拟南芥属、果蝇、小鼠、大鼠和人中的总体活性。为了补充总体能力，可以使用QPCR，因为这种方法更加灵敏。相对基因表达水平针对CREBBP的表达进行标准化。分析下述基因以表征未分化的细胞：POU5F1(Oct-4)、NANOG、GDF3、GAL、LECT1、FOXH1、CER1、DNMT3B、DPPA5、FOXD3、TERT、TERF1、TDGF1///TDGF3、SOX2、PODXL和LIN28。所有这些基因在暴露于活化素A和bFGF共5天的培养物中急剧减少。图7显示关于OCT4和Nanog的表达但所有其他标记都具有相同谱。分析下述基因以表征DE细胞：LEFTY1、LEFTY2、BRA、AFP、SOX7、SOX17、SERPINA1(A1AT)、HNF4α、GOOSECOID、HNF3B、CXCR4、CDX2，其中某些在图7中标绘。可以清楚看出LEFTY1、LEFTY2、GOOSECOID、SOX17、HNF3B、CXCR4全部在用活化素A和bFGF处理5天后的培养物中上调。这不如对照培养物中一样清楚(固有分化，EE)。参见图7。来自这个实验的结果概括在图7中。选择基因实验对象组以区分定型和胚外内胚层。
阵列实验和数据分析的描述
使用3种细胞系SA167、SA002和SA461。实验设置如下：未分化的hBS细胞(UD)、在第5天时的定型内胚层(DE5)、在第5天时的固有分化的hBS细胞(EE5)、在第10天时的DE诱导的肝细胞祖先(DE10)、在第10天时的固有分化的hBS细胞(EE10)、在第20天时的DE诱导的肝细胞(DE20)、在第20天时的固有分化的hBS细胞(EE20)。作为对照，使用胎儿肝脏(FL)、成年肝脏(AL)、铺平板的原代肝细胞(PH)和新鲜的原代肝细胞(FPH)和HepG2。
使用Agilent Bioana lyzer测试通过体外转录标记的RNA和cDNA的质量。断裂的cDNA在45℃下与GeneChip Human，HGU 133 Plus 2.0(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交16小时。每种样品以生物学一式两份与阵列杂交(对于每种样品2个阵列)。关于数据提取，使用MAS5软件(Affymetrix，Santa Clara，CA)，并且数据进行中值标准化和log2转化用于后续数据分析。所有图表在log2尺度中。
通过用于分析DE细胞的良好质量的多种标记分析在活化素A和bFGF的存在下hBS细胞衍生的DE富集培养物的产生。因此，我们显示已从hBS细胞制备DE而不是原始内胚层。我们的数据还显示与仅给予活化素A的培养物比较，与活化素A连同bFGF一起培养的hBS细胞产生更多DE细胞。
实施例7
DE-Hep祖细胞的形态
培养物强烈响应在阶段II中的因子(关键组分BMP4)，并且先前的同质上皮细胞以小簇成群。在再多2天后，获得相当异质的群体，在其中有许多上皮样细胞类型。此外，在第二阶段中，在6-9天后，出现含有少数具双核的细胞的第一批多边形形状细胞(图8)。这些细胞通常定位接近于成纤维细胞样细胞的三维脊(图8)。
实施例8
用免疫细胞化学表征DE-Hep祖细胞
通过免疫荧光标记证实DE-Hep祖先群体。参见概括来自阶段II的早期DE-Hep祖细胞通过免疫细胞化学标记的分析的表2，也描述于图8和实施例7中。DE-Hep祖细胞通常在具有表达EpCAM的细胞的区域中发现，图9。
表2：对DE-Hep祖先的免疫细胞化学分析(阶段II)。
实施例9
DE-Hep祖先的基因表达
使用NanoDrop ND-1100测定样品的RNA浓度。在逆转录中使用来自不同样品的相同量RNA，所述逆转录一式两份地进行以产生cDNA。作为关于基因组DNA量的对照，执行在其中不添加逆转录酶(RT)的NoRT对照。NoRT对照中的信号反映基因组DNA的量。对来自一式两份样品和NoRT对照的cDNA执行基因的qPCR。使用的测试法是：HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、AAT、结蛋白、CD133、Notch2、ICAM-1、CK7、CK18和CK19。
分析：计算相对量，假定90％PCR功效和使具有最低表达水平的样品设为值1。随后可以直接比较且标绘其他样品。
实施例10
DE-Hep祖先的扩增和培养
对于DE-Hep祖细胞的扩增和纯化，在阶段II第5天时(方案1和4)用0.2％胰蛋白酶-EDTA酶促处理或人工切断培养物，并且转移至Matrigel包被的组织培养平板用于根据下文描述的方案重新铺平板。对于DE-Hep祖先的Matrigel培养，使用RPMI Advanced培养基或DMEM，并且补充有1％PEST，1％Glutamax且另外具有；
第5天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分别为100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)5％FCS；
第6天：aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分别为100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)0.2％FCS；
第7天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS；
第8天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS；
第9天：bFGF、BMP4、HGF(分别为50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0.2％FCS；
进一步成熟为DE-Hep细胞如实施例2中执行。DE-Hep祖细胞也可以通过胶原酶IV切断，并且在MEF包被平板上重新铺平板。
实施例11
在新方案1的阶段III中DE-Hep细胞的形态
在阶段III中，培养物更换成HCM培养基(参见图1a和实施例2)。在这个阶段时，出现许多DE-Hep细胞，并且显示具有多边形形状、包含具有核仁的特征性核的一般肝细胞形态(图11)。有趣的是，它们以由成纤维细胞样细胞包围的小岛样簇排列(图12)。这种形态不同于由固有分化衍生的肝细胞样细胞的形态(图12；还比较等人，2007)。
实施例12
用免疫细胞化学和定量分析表征DE-Hep细胞
整个集落通过免疫细胞化学进行固定且分析。表1中的数据显示在DE-Hep培养物中，许多细胞对于CYP1A2、CYP3A4/7、CK18、CK8、CK19和HNF4α是阳性的。有趣的是，可以在DE-Hep培养物而不是未处理的对照培养物(固有分化)中检测出极化转运蛋白MRP2的表达。表3A概括了迄今为止已对在阶段III时的DE-Hep细胞、对照培养物、从Vitro Technologies商购可得的HepG2和原代人肝细胞执行的免疫细胞化学分析。空框未进行染色或分析。
表3A：与对照培养物(固有分化的hBS培养物)、HepG2和原代人肝细胞比较，对在阶段III时的DE-Hep细胞的免疫细胞化学分析。
在阶段III中通过免疫组织化学和ELISA表征DE-Hep培养物。关于肝细胞的良好特异性标记是尿素的合成，所述尿素仅由肝细胞而不由卵黄囊制备，并且因此可以用于区分真正的肝细胞和卵黄囊细胞。
*固有分化的hBS培养物
该表涵盖了阶段III DE-Hep培养物的表征数据，这与固有分化的hBS细胞培养物、HepG2细胞系和人原代肝细胞培养物进行比较。“+”和“-”是半定量测量，并且描述分析标记的近似水平。
表3B：在DE-Hep培养物中人白蛋白阳性核的计算
*因为发现特定百分比的DE-Hep细胞是具双核的(如人肝细胞)，所以核数目与细胞数目不相等。
实施例13
DE-Hep细胞的生物活性
为了评估这些DE-Hep细胞是否是功能的，就吲哚花青绿摄取和分泌进行测试(实施例17)、糖原贮积(实施例18)、白蛋白分泌(实施例15)、LDL-摄取、不同药物的代谢能力(实施例16)和氨代谢(实施例20)测试它们。
发现DE-Hep培养物能够摄取且分泌吲哚花青绿(参见实施例17)。
因为人肝细胞可以贮存且制造糖原，所以经由阶段III细胞和未处理培养物的过碘酸-Schiff染色分析糖原水平。在2种培养物都发现阳性染色(参见实施例18和图15)。
为了进一步测定DE-Hep细胞的分化状态和功能感受态，就白蛋白基因表达和白蛋白分泌评估细胞(参见实施例15)。
为了测定阶段III的DE-Hep细胞是否摄取LDL，这在肝细胞中观察到，通过使培养物与DilAc-LDL(1，1γ-双十八基-3，3，3δ，3γ-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(C59H97CIN2O4)乙酰化人低密度脂蛋白)温育评估LDL摄取。在阶段III中的培养物吸收LDL，而在未处理的对照培养物中仅某些细胞显示LDL摄取。
对于非那西丁、双氯芬酸和咪达唑仑通过DE-Hep细胞的药物代谢参见实施例16，并且关于氨代谢参见实施例20。
实施例14
DE-Hep细胞通过Q-PCR和LDA卡的基因表达分析
通过QPCR就肝相关基因的表达分析hBS细胞衍生的DE-Hep培养物和适当对照(伴随很少的VitroHESTM培养基在MEFs上更换的固有分化的hBS细胞或HepG2细胞)样品。如表4中指定的分析白蛋白、HNF4a、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1和UGT2B7的表达。
此外，如表5A和B中列出的，在LDA微流动性卡上表征DE-Hep细胞的基因表达。衍生自样品总RNA的cDNA与LDA卡杂交，并且在PCR设置中运行实验，并且使用合适软件进行进一步分析。所有样品在重复实验中在LDA卡上用适当对照平行运行，根据指导手册(Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card Getting StartedGuide)且根据下述缩短方案：
从总RNA制备cDNA，并且在无RNA酶/DNA酶的水中稀释它，以接受合适浓度(参见下文)。使下述组分混合：cDNA(1-100ng)，5
1，无RNA酶/DNA酶的水，TaqMan Universal PCR，45μl，Master混合物(2X)，50μL，总共：100μl。其后将样品装载到LDA卡上(每个样品混合物是100ul和170ng cDNA/样品)且离心，随后使LDA卡密封。最后，根据手册中的指导，使卡在ABI 7900HT实时PCR系统上运行，并且通过使用SDS 2.2.1软件和相对定量方法分析结果。
通过QPCR或LDA分析对DE-Hep细胞的基因表达分析概括呈现于表4(QPCR)和5(LDA)，并且在下文中描述。
表4：通过QPCR的基因表达分析。
方案1(无任何修改)
方案2(无任何修改)
方案3(无任何修改)
样品C用EGF和抗坏血酸执行
样品D不用EGF和抗坏血酸执行
方案4(无任何修改)
样品E修饰：阶段1：无活化素A、bFGF和FCS；阶段2：DMEM代替RPMI A和一直0.2％FCS；阶段3：在第17-30天时无ITS和HGF。
样品F：无EGF和抗坏血酸。
来自Cai等人2007的方案(无任何修饰)
-＝未测试；0＝未检测出表达。
*DE-Hep细胞(DE-Hep)中的表达对固有分化的对照hBS细胞中的表达进行标准化。
*在培养21-38天后分析DE-Hep细胞和固有分化的对照hBS细胞。
与固有分化的对照hBS细胞比较，用方案1-4衍生的DE-Hep细胞显示增加的成年肝脏相关基因表达。重要的是，通常发现功能基因如CYP3A4的表达在DE-Hep细胞中明显更高。在所有测试样品中检测出成年肝脏相关基因如CYP7A1的表达，并且通常在DE-Hep培养物中比固有分化的对照hBS细胞中更高。在许多样品中，检测出CYP1A2表达(数据未显示)。
当比较我们的方案1-4与由Cai等人2007(G)公开的方案时，HNF4a、白蛋白和UGT2B7明显更高。
表5：在LDA卡上DE-Hep细胞的基因表达分析
表5A
*针对HPRT1进行标准化。*固有分化的hBS细胞是对照样品；dCT值给出，以防在对照样品不表达测试基因的情况。执行方案1无任何修改。
在表5A中，通过方案1衍生自hESC系SA002的在阶段III时DE-Hep细胞与来自hESC系SA002的固有分化的hBS细胞(设为1)进行比较。DE-Hep细胞显示与固有分化的hBS细胞比较几乎所有基因增加的表达。
表5B
*针对HPRT1进行标准化。
*培养48小时的HepG2细胞和人原代肝细胞是对照样品。HepG2设为1，并且所有其他样品对其表达进行标准化。
；+＝检测出的表达，但并未标准化，因为HepG2细胞是阴性
“Cai 07”＝根据Cai等人2007的方案(参见参考文献)
在方案1和2中不执行修饰，并且与Cai等人2007比较
在表5B中，通过方案1衍生自hESC系SA002.5、通过方案2衍生自hESC系SA348和通过Cai等人2007的方案衍生自hESC系SA348在阶段III时的DE-Hep细胞与培养24小时的原代人肝细胞和HepG2细胞(设为1)进行比较。
有趣的是，发现与用Cai-方案衍生的DE-Hep细胞比较，UGT2B7、CAR、HNF4a和白蛋白在通过方案1和2衍生的DE-Hep细胞中在更高水平下表达。在用Cai-方案衍生的DE-Hep细胞中未检测出CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、UGT1A6、OATP-2和醇脱氢酶1的表达。
用人原代肝细胞和HepG2细胞在DE-Hep细胞中的基因表达比较(参见图18)
用方案2(3次独立实验)衍生的DE-Hep细胞显示与培养48小时的人原代肝细胞同样高的CYP3A4表达，和比HepG2细胞高约100倍的表达。与DE-Hep培养物比较，在固有分化的hBS细胞培养物中的肝细胞样细胞(3次独立实验，与方案2平行运行)显示CYP3A4较低的表达水平。发现用方案2衍生的DE-Hep细胞表达成年肝脏相关基因CYP7A1和葡萄糖6磷酸酶(参见表5A和B)。应当指出DE-Hep培养物不是同质细胞群体，并且如果从混合培养中富集DE-Hep细胞，表达水平将更高。
实施例15
在来自DE-Hep细胞的培养基上清液中的白蛋白分泌的Elisa分析
在Klinisk Kemi，C-lab，Sahlgrenska University Hospital，Gothenburg使用Albumin Quantification试剂盒(目录号03576108，Cobas)分析白蛋白分泌。白蛋白在肝脏实质细胞以14g/天的速率合成，并且在血浆中具有2种主要功能：维持胶体渗透压(80％由于血浆中的白蛋白)和转运。它是用于具有低水溶性物质(例如，游离脂肪酸、胆红素、金属离子、激素和药物)最重要的转运蛋白质。测试原理基于免疫比浊测定法，使用抗白蛋白抗体。这些抗体与样品中的抗原反应，以形成抗原/抗体复合物，这在凝集后用浊度计进行测量。血清/血浆中的预期值是35-52g/L(532-790μmol/L)。
在不同阶段时分析细胞，阶段II培养基样品A-E。在第一个分化期中(阶段I，参见图1a)，活化素A诱导hBS细胞成为DE，这花费1至5天。在阶段II中，通过BMP4和/或其他因子诱导早期肝脏细胞类型，并且这些早期肝脏细胞扩增且成熟。在最后一个阶段中，阶段III，通过HGF、OSM、DEX达到终末成熟，共高达数天(图1a)。定型内胚层诱导的DE-Hep细胞分泌白蛋白。根据等人2007，表6，在固有分化的hBS细胞的对照中未检测出白蛋白。人原代肝细胞和HepG2细胞都不分泌白蛋白超过这个测定法的检测水平。应当指出样品A-D已在其培养基中温育2天，而样品E在其培养基中温育1天，表6。
表6：来自DE-Hep细胞(SA002)的白蛋白分泌。
实施例16
DE-Hep细胞显示经由CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的功能药物代谢
在阶段III时的hBS衍生的DE-Hep细胞就其代谢3种探测药物的能力就I期酶CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4进行测试。26μM非那西丁(由CYP1A2代谢；购自Aldrich)、9μM双氯芬酸(由CYP2C9代谢；购自SIGMA)和3μM咪达唑仑(由CYP3A4代谢；购自SIGMA)作为混合物在37℃和5％CO2下在无酚红培养基中温育12-17小时。收集培养上清液的样品，并且以500-4000g的速度离5-20分钟，以去除任何细胞碎片。将100-120μl澄清的上清液样品转移至96孔平板，并且将15μl乙腈加入每个孔中。需要时，可以省略乙腈添加。使样品冷冻在-20℃下，并且通过LC-MS(乙氨酚用于CYP1A2，1羟基-咪达唑仑(1OH-咪达唑仑)用于CYP3A4和羟基-双氯芬酸(OH-双氯芬酸)用于CYP2C9)测量在培养上清液中的代谢产物浓度。
DE-Hep细胞代谢测试的所有3种探测药物(表7和图14A)。有趣的是，衍生自不同hBS细胞系的DE-Hep培养物在关于CYP1A2、3A4和CYP2C9的代谢活性方面不同，导致对于不同hBS系一般的CYP活性谱，例如在衍生自hBS细胞系SA001、SA002和SA002.5的DE-Hep细胞中高的CYP1A2和较低的CYP3A4活性，并且在hBS细胞系SA348中反之亦然(图14A)。这与在文献中描述且在我们手中重现的众所周知的CYP表达在人中的个体间变异相一致(当在从不同供体中分离的人原代肝细胞中分析CYP活性时(图14B))。
除未处理的DE-Hep培养物中的组成性CYP表达外(图14A)，DE-Hep细胞中的CYP表达可通过用CYP诱导剂混合物处理诱导，所述CYP诱导剂混合物包含25μM利福平、25μM奥美拉唑、100μM异烟肼、100μM地塞米松、10μM扑米酮(脱氧苯巴比妥)和88mM乙醇；在与CYP诱导剂混合物温育24小时后，CYP1A2活性以及CYP1A2和CYP3A4mRNA水平比未处理的对照培养物中高3-4倍(图4C，D)。
与DE-Hep细胞形成对比，肝瘤细胞系HepG2主要显示CYP1A2活性，而仅可以检测出低CYP3A4活性且无CYP2C9活性(表7和图14B)。然而，当比较在DE-Hep培养物与HepG2和人原代肝细胞中的CYP活性时，应当考虑HepG2和人原代肝细胞都是纯细胞群体，而DE-Hep培养物是混合细胞群体，并且包含除DE-Hep细胞外的其他细胞类型。总之，DE-Hep细胞显示组成性和诱导性CYP表达，在不同hBS细胞系之间在CYP表达水平中很大的个体间变异，并且因此与人原代肝细胞的高相似性。
表7：DE-Hep细胞的细胞色素P450活性
“ECD”＝酶促簇解离。
*对于HepG2细胞和人原代肝细胞，计算4次独立实验的平均值。在加入药物前使人原代肝细胞培养48小时。
小鼠胚胎饲养细胞显示接近于检测水平的极低CYP活性水平，因此不显著促成在小鼠胚胎饲养细胞上的DE-Hep培养物中测量的CYP活性。
实施例16
DE-Hep细胞，阶段III的转运蛋白分析
经过肝细胞质膜的转运是肝清除中的关键参数，并且通常通过不同载体介导的系统发生。
多药抗性蛋白质2(MRP2)
阴离子化合物的胆汁消除由多药抗性蛋白质2(MRP2)介导。MRP2免疫荧光在DE-Hep细胞培养物中在阶段III时发现(参见图14a和b)。MRP2在DE-Hep细胞中的表达在LDA卡上在mRNA水平上加以证实(参见表5A+B)。
吲哚花青绿(ICG)
吲哚花青绿(ICG，也称为靛氰绿，Sigma，I2633)是有机阴离子，其是无毒的，并且通过肝细胞专一地消除，并且因此通常在临床上用作测试物质以评估肝脏功能。(Shinohara等人1996)。ICG在5ml溶剂中在无菌小瓶中溶解，并且随后加入包含10％FBS的20ml DMEM。所得到的吲哚花青绿(ICG)溶液的终浓度是1mg/ml。将ICG溶液加入细胞培养皿中，并且在37℃下温育60分钟。在皿用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗3次后，用立体显微镜检查ICG的细胞摄取。在检查后，用包含10％FBS的DMEM装满皿。ICG从细胞中过夜消除。
分析吲哚花青绿通过功能DE-Hep细胞的摄取，并且显示事实上在与ICG温育接近60分钟后，DE-Hep培养物的许多细胞是阳性的，显示主动摄取ICG的能力(参见图14c)。此外，在24小时后，大多数ICG已从细胞中排泄。ICG摄取和排泄仅在少数对照培养物中出现，显示固有分化的培养物也能够产生功能肝细胞样细胞。已知ICG的摄取和排泄经由药物转运蛋白OATP-2发生，所述OATP-2在DE-Hep细胞中的表达在LDA卡上在mRNA水平上加以证实(参见表5A+B)。
实施例17
功能DE-Hep细胞的糖原贮积
人肝细胞合成且贮存糖原。通过在阶段III中的DE-Hep细胞和固有分化细胞中的过碘酸-Schiff染色分析糖原水平。在2种培养物都发现阳性染色(DE-Hep细胞的糖原染色：图15；固有分化细胞的糖原染色：参见等人2007)。在DE-Hep细胞中发现比在固有分化的细胞中明显更高的糖原贮积，并且可以与具有肝细胞样形态的细胞相关。应当指出在图15B中的某些糖原阳性细胞是具双核的。
通过PAS-染色(过碘酸-Schiff染色系统，SIGMA-ALDRICH，目录号395-B)检测出在细胞中的糖原贮积检测。使细胞在甲醇中稀释的4％多聚甲醛中在室温下固定15分钟，并且随后在PBS中洗涤3次。作为技术阴性对照，培养物用人唾液在室温下处理20分钟，并且随后在PBS中洗涤。人唾液包含消化糖原的α-淀粉酶。将使二醇氧化成醛的过碘酸加入处理和未处理的培养物中在室温下5分钟，随后在PBS中反复洗涤。随后，培养物在Schiff′s试剂中在室温下温育15分钟，允许副蔷薇苯胺和焦亚硫酸钠之间的反应，这导致使含二醇细胞区室染成亮粉色的副蔷薇苯胺产物。在PBS中洗涤后，细胞在苏木精中在室温下复染90秒，并且在固定培养基中固定前在H2O中漂洗。苏木精染色细胞的核(蓝色)。
实施例18
定型内胚层、肝祖先和肝脏相关基因以及药物代谢酶和药物转运蛋白的免疫细胞化学检测
使用的一抗：
白蛋白(兔)1∶500，DAKOCytomation，A0001
AAT(兔)1∶200，DAKOCytomation，A0012
CD133(小鼠)1∶50，Miltenyi，克隆AC141
c-kit(山羊)1∶100，R&D，AF332
CK7(兔)1∶200，Novocastra，NCL-CK7560
CK8(小鼠IgG1)1∶200，Santa Cruz，sc-52324
CK18(小鼠)1∶200，DAKOCytomation，M7010
CK19(小鼠IgG1)1∶150，Novo Castra，NCL-CK19
结蛋白(小鼠IgG1)1∶200，Chemicon，MAB 1698
EpCAM(小鼠IgG1)，1∶50，GeneTex，Inc.VU-ID9
EGFR-1(小鼠IgG2b)，1∶100，abcam，ab30
e-钙粘蛋白(小鼠IgG1)，1∶500，ZYMED，13-1700
LFABP(山羊)1∶500，Santa Cruz，sc-16064
HNF3b(山羊)1∶250，Santa Cruz，sc-6554
HNF4a(兔)1∶500，Santa Cruz，sc-8987
HNF1a(兔)，1∶400，Santa Cruz，sc-22840
Nestin(小鼠IgG1)，1∶250，BD Biosciences，611658
Notch2(兔)1∶100，SantaCruz，25-255
Oct-4(小鼠)1∶500，Santa Cruz，sc-5279
c-Met(HGF受体，小鼠)1∶100，upstate，05-237
α6-整联蛋白(CD49f，rat)1∶250，BD Biosciences，555736
ICAM-1(CD54，小鼠)1∶500，BD Pharmingen，559047
PDGFRa(小鼠)1∶500，Chemicon，CBL1366
Sox17(兔)1∶2000，(来自E.Baetge的友情赠予)
波形蛋白(小鼠IgG1)1∶300，SIGMA，V-6630
使用的二抗：
-驴抗-山羊-Alexa 488，1∶500，Molecular Probes，#A-11055
-驴抗小鼠-Cy3，1∶1000，Jackson Immuno Research，#715-165-151
-驴抗-小鼠-Cy2，1∶100，Jackson Immuno Research，#715-225-151
-驴抗-兔-Alexa488，1∶1000，Molecular Probes，#A-21206
-驴抗-兔-Alexa594，1∶1000，Molecular Probes，#A-21207
-驴抗-大鼠-Cy3，1∶500，Jackson Immuno Research，#712-165-153
-驴抗-大鼠-Cy2，1∶100，Jackson Immuno Research，#712-225-153
免疫染色方案：
对于细胞内蛋白质：
在4％PFA中15分钟固定，2xPBS洗涤，在0，1％PBT中的5％FBS 30分钟，一抗在PBS中的1％FBS中于4℃温育过夜，二抗在PBS中的1％FBS中在RT下温育1小时，全都在PBS、以0.05mg/ml的DAPI中在RT下洗涤5分钟，在DAKOCytomation固定培养基中固定。
对于细胞外蛋白质：
在4％PFA中15分钟固定，2xPBS洗涤，在PBS中的5％FBS 30分钟，一抗在PBS中的1％FBS中于4℃温育过夜，二抗在PBS中在RT下温育1小时，全都在PBS、以0.05mg/ml的DAPI中在RT下洗涤5分钟，在DAKOCytomation固定培养基中固定。
I期代谢酶：
药物在人/哺乳动物中通过2种顺次途径进行代谢或分解。I期酶由细胞色素P450家族组成。来自这类酶的蛋白质催化反应，导致给其异生物质底物添加官能团和反应中心，例如SH、OH、-NH2和-COOH基团。DE-Hep细胞显示对于下述CYPs的免疫反应性：1A2、3A4/7(在2个亚型之间的潜在抗体交叉反应)。
使用的一抗：
-CYP1A2(兔)1∶100，Biomol，CR3130；针对人CYP1A2的合成十三肽产生，并且因此可能不与CYP1A1交叉反应
-CYP1A2(兔)1∶200，Cypex，PAP021；根据制造商的信息，在蛋白质印迹中不与CYP1A1交叉反应
-CYP3A4(绵羊)1∶100，Biomol，CR3345；根据制造商的信息，可能与CYP3A7交叉反应
-CYP3A4(兔)1∶200，Cypex，PAP011；可能与CYP3A7交叉反应
使用的二抗：
-驴抗-兔-Alexa488，1∶1000，Molecular Probes，#A-21206
-驴抗-绵羊-Alexa488，1∶1000，#A-11015
免疫染色方案：
在4％PFA中15分钟固定，2xPBS洗涤，在0，1％PBT中的5％FBS 30分钟，一抗在PBS中的1％FBS中于4℃温育过夜，二抗在PBS中在RT下温育3小时，全都在PBS、以0.05mg/ml的DAPI中在RT下洗涤5分钟，在DAKOCytomation固定培养基中固定。
药物转运蛋白
DE-Hep细胞显示对于转运蛋白MRP2的免疫反应性(图14B)。MRP2在肝细胞样细胞培养物和DE-Hep细胞培养物中都表达。
使用的一抗：
MRP2(兔)1∶50，Santa Cruz，sc-20766
使用的二抗：
-驴抗-兔-Alexa 488，1∶1000，Molecular Probes，#A-21206
免疫染色方案：
在4％PFA中15分钟固定，2xPBS洗涤，在0，1％PBT中的5％FBS 30分钟，一抗在PBS中的1％FBS中于4℃温育过夜，二抗在PBS中在RT下温育1小时，全都在PBS、以0.05mg/ml的DAPI中在RT下洗涤5分钟，在DAKOCytomation固定培养基中固定。
实施例19
在阶段III时在DE-Hep细胞中的尿素排泄
尿素的测定是用于评估肾脏功能的最广泛使用的测试。尿素是蛋白质和氨基酸代谢的最终降解产物。在这个过程中形成的氨在肝脏中合成为尿素，并且构成用于消除人体中的过量氮的最重要的分解代谢途径。Roche UREA/BUN测定法基于Talke和Schubert的方法，使用总体酶促操作用于测定尿素，使用偶联的尿素酶/谷氨酸脱氢酶(GLDH)酶系统。简言之，尿素通过尿素酶水解以形成CO2和氨。形成的氨随后在GLDH的存在下与α-酮戊二酸和NADH反应，以产生谷氨酸盐和NAD+。动态测量由于NADH消耗在吸光度中的减少。血清/血浆中的正常值是10-50mg/dL(1.7-8.3mmol/L)。在Klinisk Kemi，C-lab，Sahlgrenska University Hospital，Gothenburg，使用用于尿素/尿素氮的动态uV测定法试剂盒(Roche/Hitachi)分析尿素分泌。发现DE-Hep细胞、对照肝细胞样细胞、HepG2和人原代肝细胞产生尿素(参见表3)。
实施例20
通过计算CYP免疫阳性细胞或细胞核数目/培养物定量特定CYP活性/细胞
因为DE-Hep培养物包含除DE-Hep细胞外的其他细胞类型，所以希望确定表达CYP细胞的数目，以便能够计算特定CYP活性/细胞/细胞核。一个可能性是计数对于特定CYP是免疫阳性的这些人核(用核染剂如DAPI和抗人核抗体共标记)，使用自动细胞分析系统(例如，在Cell分析仪中)。
使用此种系统，已测定用方案2衍生的DE-Hep培养物包含约19％CYP3A4免疫阳性细胞核(其中约6％是高度免疫阳性的；参见表8)，而具有肝细胞样细胞的对照培养物包含约2％CYP3A4免疫阳性细胞核(其中约0.3％是高度免疫阳性的；参见表8)。根据人CYP3A4阳性和高度阳性核的绝对数目，可以计算代谢产物浓度/1000个CYP3A4阳性核或/1000个高度CYP3A4阳性核。相同分析可以对于对照细胞类型如人原代肝细胞和HepG2细胞执行，并且随后在这些细胞类型之间的直接比较是可能的。在此种实验中，来自3个不同个体的人原代肝细胞(培养120小时)包含平均8，8％CYP3A4阳性核。与这比较，DE-Hep培养物包含19.4％超过2倍的CYP3A4阳性核。
表8：在DE-Hep培养物中人CYP3A4阳性核的计算
*计算来自2个等同处理孔的平均值/方案。
*因为发现特定百分比的DE-Hep细胞和肝细胞样细胞都是具双核的(如同人肝细胞)，所以核数目与细胞数目不相等。
实施例21
作为单细胞和细胞簇的hBS细胞的活化素处理
在起始分化方案前，用胶原酶使hBS细胞解离成单细胞和细胞簇。其后，使单细胞和细胞簇在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或其他基质上铺平板，并且根据DE-Hep分化策略或根据固有分化策略进行培养。在下文中，描述了此种实验的4个例子，并且指定为方案A-D。这些方案全都具有在培养中5-7天的长度。其后，根据方案1-4继续细胞培养(参见图1B)。
方案A涉及用胶原酶使hBS细胞解离，以便获得单细胞和/或小细胞簇。它们随后在阶段I培养基中在MEFs或其他基质上培养3-7天，并且这之后根据方案1-4进行培养(参见图1B和实施例2)，从阶段II培养基开始。
在方案B，前3天完全如对于方案A所述。其后将培养基更换成VitroHESTM培养基，补充有4ng/ml FGF2连同或不连同10％FBS，并且培养另外2天。细胞随后根据方案1-4进行培养(参见图1B和实施例2)，从阶段II培养基开始。
方案C涉及如方案A中所述用胶原酶使hBS细胞传代，这之后使hBS细胞在补充有4ng/ml FGF2的VitroHESTM中铺平板，并且在根据方案1-4培养细胞前允许生长至70％汇合(参见图1B和实施例2)，从阶段I培养基开始。
方案D涉及如上所述用胶原酶或TrypleSelect使hBS细胞在MEF上传代，并且如上所述在VitroHESTM培养基中培养。它们固有分化成肝细胞样细胞(参见图11C)。
实施例22
DE-Hep细胞的分选和精制
因为DE-Hep培养物是混合群体，所以可能必须使所需细胞群体纯化为例如DE-Hep祖先或DE-Hep细胞。可以用基于抗体的方法如磁活化细胞分选(MACS)或荧光活化细胞分选(FACS)，或基于梯度离心的方法如FICOLL或PERCOLL来执行纯化。对于基于抗体的方法(如FACS和MACS)，需要针对细胞外表位的抗体，例如无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR1)或药物转运蛋白。对于FACS，抗体的备选物是使用关于药物转运蛋白的荧光底物，例如关于OATP-8的Fluo-3，或关于CYPs例如7-苄氧基-4-三氟甲基-香豆素(BTC)。这些无毒的荧光底物暂时标记所需细胞群体，并且因此允许细胞分选而无细胞的永久改变或损害。
实施例23
在活化素诱导后转移至胶原/Matrigel
在阶段I中在第5天时，用TripleSelect使在MEF上衍生自hBS细胞的DE细胞解离，并且转移至Matrigel和/或胶原包被平板。接种密度是250000个细胞/cm2。在阶段II培养基的存在下(参见图1B和实施例2)，细胞快速朝向肝祖细胞分化以及增殖(关于形态参见图17)。在第16天时，在阶段II中，许多细胞是EpCAM、CK7、CK19和CD54免疫阳性的(数据未显示，关于在DE-Hep祖先中表达的标记比较表2)。
实施例24
其他内胚层细胞类型的衍生
除DE-Hep细胞外，其他内胚层细胞类型如肠细胞或其他肠细胞也可以衍生自hBS细胞。用于检测此种细胞类型的合适标记是caudal相关同源异形盒2(Cdx2)和肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)。Cdx2在肠上皮和结肠癌细胞系Caco-2中高度表达(数据未显示)。IFABP在小肠肠细胞中表达(数据未显示)。通过免疫组织化学在肝脏切片上检测不出Cdx2和IFABP(数据未显示)，并且因此适合于区分在DE-Hep培养物中的肠细胞和肝细胞。
实施例25
3D系统改善DH-Hep细胞的功能性
当应用简单的3D系统例如所谓的三明治构型时，这意指Matrigel或胶原覆盖放置在细胞上，已知原代人肝细胞在2D细胞培养中显示改善的功能性。因此，也对DE-Hep细胞测试此种三明治构象，并且在最后1-2周过程中将Matrigel覆盖放置在培养物上。如表9中显示的，这增加CYP1A2和CYP3A4活性，并且因此对DE-Hep细胞的功能性具有正面作用。还考虑了其他3D系统如珠、凝胶或基质以改善功能性。
表9：在三明治构型中的DE-Hep细胞改善的细胞色素P450活性。值是nM代谢产物，参见实施例15。
如表10中所示，当存在Matrigel覆盖时，相同细胞显示对于某些关键肝基因增加的基因表达。
表10：在三明治构型中的DE-Hep细胞改善的基因表达。值是相对于固有分化细胞的倍数变化。
实施例26
在DE-Hep培养物中II期酶的表达
异生物质通过2个顺次系统代谢：I期和II期酶系统。I期系统由细胞色素P450酶(CYPs)组成，并且II期系统由例如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和磺基转移酶(SULTs)组成。
分析在DE-Hep培养物中某些选择的II期酶的表达。在DE-Hep培养物中，可以检测出UGT1A6/4/3、UGT1A8和UGT2B7的表达(表5B；方案1和2)以及GSTA1-1和SULT1E1的表达(图19；方案4)。GSTA1-1和SULT1E1在未分化的hBS细胞中都以极低水平表达，并且在DE-Hep培养物中在分化过程期间强烈上调。
实施例27
在hBS衍生的DE-hep细胞中改善CYP2C9表达
应用培养条件的不同变化，以便改善DE-hep细胞中的CYP2C9表达。
使衍生自2种不同细胞系SA002和SA348的DE-hep细胞在阶段III中在培养中维持延长时间段，共另外2周，直至第42天时，并且在第28天时与DE-heps比较。延长在阶段III中的培养期导致CYP2C9mRNA表达中的急剧增加(对于SA0026.6倍和对于SA3485.0倍)。
DE-heps细胞在无饲养者系统中衍生自2种不同细胞系SA002和SA348，其中通过将未分化的hBS细胞转移至滤器(Millipore#PICMO1250，Lot R5PN16454)，并且在不存在饲养者的情况下在培养基中在空气-液体界面上培养，如对于DE-hep方案描述的。这些细胞与在饲养者上培养相同时间段——28天的DE-hep细胞比较。与在饲养者上的通常生长条件比较，在不存在饲养者的情况下，CYP2C9mRNA表达急剧增加(对于SA002和SA348分别3.0和4.0倍)。
使用ABI/TaqMan方法通过实时PCR测量CYP2C9的mRNA表达。简言之，通过使用Qiagen′s RNeasy系统从细胞培养物中分离RNA。通过使用ABI高能力cDNA合成试剂盒合成cDNA。通过使用TaqMan探针在ABI 7500中执行RT-PCR。表达水平针对CREBBP表达进行标准化。参见图20。
实施例28
与根据由Cai等人公开的方案分化的hBS细胞比较，DE-hep细胞的基因表达
为了比较我们的方案与由Cai等人公开的方案，对hBS细胞应用2种方案，并且分析几种重要肝基因的mRNA表达。通过我们的DE-Hep方案分化的细胞表达更高mRNA水平的白蛋白、CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4，图21。
方法：
通过用TryLe Select酶促解离成单细胞使来自细胞系SA002的SCED(酶促解离的单细胞)细胞与饲养细胞分开，同时使大多数HFFs与平板附着。hBS细胞转移至悬滴用于在包含30％纤维素的VitroHes培养基中重聚集5天，并且在胶原包被细胞培养皿上铺平板。随后使hBS细胞暴露于我们的DE-hep方案以及由Cai等人公开的方案。所得到的细胞培养物通过实时PCR就几种肝标记的肝基因表达进行分析。
实施例29
流式细胞术
使用CYP1A2抗体执行流式细胞术，以定量在阶段3时在DE-Hep培养物(SA002，d28)和原代肝细胞中的CYP1A2阳性细胞百分比。DE-Hep细胞用TriPIS在37℃下解离20分钟。原代肝细胞是新鲜分离的。
使细胞在0.5％PFA中固定30分钟。使用0.5％Triton/PBS在细胞渗透化后5分钟完成细胞内染色。所有细胞已对于DAPI进行染色。所有离心步骤在60g下进行3分钟。相应的同种型用作对照用于单克隆抗体的非特异性结合(图22，A)。约33.5％的所有计数细胞(DAPI)在DE-Hep培养物中对于CYP1A2是阳性的(计数4218个细胞)(图22，BI/II)。原代肝细胞由52％CYP1A2阳性细胞组成(计数20000个细胞)(图22，CI/II)。有趣的是，DAPI谱描述了在DE-Hep和原代肝细胞中的单核、双核和多核细胞(图22，B，C)。
实施例30
用活化素B代替活化素A用于诱导内胚层
在5ng/ml bFGF的存在下使未分化的hESC系SA002暴露于活化素A(100ng/ml)或活化素B(100ng/ml)5天，并且就基因表达进行分析。与活化素A比较，在活化素B暴露后，内胚层标记Foxa2、Sox17和CXCR4的mRNA表达相同或甚至更高。此外，与活化素A比较，在用活化素B培养的细胞中，胚外内胚层(ExE)标记Sox7、CDX2和AAT相同或更低。这显示对于内胚层的诱导，活化素B与活化素A同样好或甚至更好。参见图23。
方法：
使用ABI/TaqMan方法通过实时PCR测量Foxa2、Sox17、CXCR4、Sox7、CDX2、AAT的mRNA表达。简言之，通过使用Qiagen′s RNeasy系统从细胞培养物中分离RNA。通过使用ABI高能力cDNA合成试剂盒合成cDNA。通过使用TaqMan探针在ABI 7500中执行RT-PCR。表达水平针对CREBBP表达进行标准化。
References
·Heins N，Englund MCO，Sjoblom C等人Derivation，characterization，and differentiation of human embryonic stemcells.STEM CELLS 2004；22：367-76.
·WO03055992，A method for the establishment of apluripotent human blastocyst-derived stem cell line，CellartisAB
·WO2004098285，Cryopreservation of human blastocyst stemcells by use of a closed straws vitrification method
·WO2004099394，A method for the efficient transfer of humanblastocyst-derived stem cells from a feeder-supported to afeeder-free culture system
·Noaksson K，Zoric N，Zeng X，Rao MS，Hyllner J，Semb H，Kubista M，Sartipy P，Monitoring differentiation of humanembryonic stem cells using real-time PCR.Stem Cells.2005Nov-Dec；23(10)：1460-7.Epub 2005 Aug 4.
·Sjogren-Jansson E，Zetterstrom M，Moya K，Lindqvist J，Strehl R，Eriksson PS.Large-scale propagation of fourundifferentiated human embryonic stem cell lines in afeeder-free culture system，Dev Dyn.2005Aug；233(4)：1304-14.
·D′Amour KA，Bang AG，Eliazer S，Kelly OG，Agulnick AD，Smart NG，Moorman MA，Kroon E，Carpenter MK，Baetge EE.，Productionof pancreatic hormone-expressing endocrine cells from humanembryonic stem cells.，Nat Biotechnol.2006Nov；24(11)：1392-401
·D′Amour KA，Agulnick AD，Eliazer S，Kelly OG，Kroon E，Baetge EE.，Efficient differentiation of human embryonic stemcells to definitive endoderm.，Nat Biotechnol.2005 Dec；23
(12)：1534-41.
·Cai J，Zhao Y，Liu Y，Ye F，Song Z，Qin H，Meng S，ChenY，Zhou R，Song X，Guo Y，Ding M，Deng H.，Directed differentiationof human embryonic stem cells into functional hepatic cells.，Hepatology.2007May；45(5)：1229-39.
·Soderdahl T，Kuppers-Munther B，Heins N，Edsbagge J，Bjorquist P，Cotgreave I，Jernstrom B.″Glutathione transferasesin hepatocyte-like cells derived from human embryonic stemcells.″Toxicol In Vitro.2007Aug；21(5)：929-37.Epub 2007Feb 2.
本发明的具体实施方案是：
阶段II-DH-Hep祖先
1.用于制备经由定型内胚层衍生自人胚泡衍生干(hBS)细胞的DE-Hep祖细胞的方法，所述方法包括
i)在培养基中培养衍生自hBS细胞的定型内胚层细胞，共5天或更多天，所述培养基包括生长因子尤其是FGF2和成骨蛋白尤其是BMP4，
ii)任选地，收获因此获得的成肝细胞样祖细胞。
2.根据条款1的方法，其中所述培养基是RPMI高级培养基或DMEM培养基。
3.根据条款1和2的方法，其中所述培养基补充有FGF2、PEST和/或GlutaMAX。
5.根据前述条款中任一项的方法，其中所述培养基每天或每隔一天进行更换。
6.根据前述条款中任一项的方法，其中所述培养基进一步包括一种或多种生长因子尤其是aFGF和成骨蛋白尤其是BMP2。
7.根据前述条款中任一项的方法，其中所述培养基进一步包括血清例如FCS。
8.根据前述条款中任一项的方法，其中所述培养基进一步包括HGF。
9.根据前述条款中任一项的方法，其中所述细胞根据下述方案进行培养：
第1和2天：所述培养基包含FGF2、BMP4、一种或多种进一步的成骨蛋白尤其是BMP2、血清尤其是FCS、PEST和GlutaMAX、和任选地一种或多种进一步的生长因子尤其是aFGF。
10.根据前述条款中任一项的方法、其中所述细胞根据下述方案进行培养：
第3天：所述培养基包含FGF2、BMP4、血清尤其是FCS、PEST、GlutaMAX、和任选地肝细胞生长因子。
11.根据前述条款中任一项的方法，其中所述细胞根据下述方案进行培养：
第4天：所述培养基包含FGF2、BMP4、HGF、血清尤其是FCS、PEST、GlutaMAX和肝细胞生长因子，或备选地所述培养基包含FGF1、FGF2和血清尤其是FCS。
12.根据前述条款中任一项的方法，其中所述细胞根据下述方案进行培养：
第5天：所述培养基包含FGF2、BMP4、HGF、血清尤其是FCS、PEST、GlutaMAX，或备选地所述培养基包含HGF、FGF2和血清尤其是FCS。
13.根据前述条款中任一项的方法，其中所述细胞根据下述方案进行培养：
第6-8天：所述培养基包含FGF2，HGF，血清尤其是FCS，PEST，GlutaMAX。
14.根据前述条款中任一项的方法，其中所述细胞培养8天，所述FCS浓度在第6天时增加，并且生长因子尤其是EGF的补充剂在第6天时给予，并且从第6天到第8天所述培养基每天进行更换。
DE-Hep祖先的表征
15.根据前述条款中任一项的方法，其中获得的所述细胞显示HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、结蛋白、CD133、Notch2、ICAM1、CK7、CK18和Ck19中的一种或多种的基因表达。
16.根据前述条款中任一项的方法，其中获得的所述细胞显示HNF1、HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、结蛋白、CD133、、ICAM1、CK8、CK18和Ck19中的一种或多种的基因表达。
17.根据前述条款中任一项的方法，其中所述细胞群体包括显示条款15-16中限定的标记的至少25％例如至少50％细胞。
阶段I的包括
18.根据前述条款中任一项的方法，其中所述定型内胚层细胞通过在培养基中培养hBS细胞来获得，所述培养基包括活化素A和任选地一种或多种生长因子Wnt3a和血清尤其是FCS。
19.根据条款18的方法，其中所述培养基是RPMI高级培养基或DMEM培养基。
20.根据条款18或19的方法，其中所述培养基补充有一种或多种生长因子尤其是FGF2。
21.根据条款18-20中任一项的方法，其中所述hBS细胞根据下述方案进行培养：
第1天：所述培养基包含活化素、Wnt3A和生长因子尤其是FGF2。
22.根据条款18-21中任一项的方法，其中所述hBS细胞根据下述方案进行培养：
第2天：所述培养基包含活化素、血清和生长因子尤其是FGF2。
23.根据条款18-22中任一项的方法，其中所述hBS细胞根据下述方案的培养物：
第3和4天：所述培养基包含活化素、血清和生长因子尤其是FGF2。
24.根据前述条款中任一项的方法，其中所述定型内胚层细胞的培养在条款18-23中限定的条件下培养hBS细胞4天后开始，用于获得定型内胚层细胞。
25.根据条款1-17或24中任一项的方法，其中从定型内胚层细胞开始的所述培养继续5天或更多天。
阶段III
26.根据前述条款中任一项的方法，其进一步包括在培养基中培养如条款1-23中任一项中限定的获得的所述DE-hep祖细胞的步骤，所述培养基例如基于Williams E的培养基或HCM Cambrex培养基，任选补充有单独或组合的分化诱导剂，例如地塞米松、奥美拉唑、利福平、脱氧苯巴比妥、乙醇、异烟肼；
ITS混合物；
BMP和/或TGFP，尤其是BMP4和/或
HGF。
27.根据条款26的方法，其中所述培养执行10-25天或更多天。
28.根据条款27的方法，其中所述培养基每天更换直至第15天时，并且相关时，对于其余培养期每隔一天更换。
得自方法24-26的DE-Hep细胞的表征
29.根据条款26-28中任一项的方法，其中在获得的细胞群体中的至少20％细胞或细胞核显示下述特征中的至少一种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种或全部：葡萄糖6磷酸酶、载脂蛋白E、CYP7A1(胆固醇7α羟化酶)、醇脱氢酶1、细胞色素P450还原酶、HNF4a、α-1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF3b、白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白和下述11种特征中的至少2种，例如至少4种、至少6种、至少8种、至少10种或全部
A.药物转运蛋白
i)至少1％的细胞或相关的细胞核显示BSEP的蛋白质和/或基因表达，
ii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MRP2的蛋白质和/或基因表达，
iii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OATP-2(＝OATP-C、OATP1B1)和/或OATP-8(OATP1B3)的蛋白质和/或基因表达，
iv)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OATP-A(＝OATP1A2)的蛋白质和/或基因表达，
v)至少1％的细胞或相关的细胞核显示NTCP的蛋白质和/或基因表达，
vi)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MDR1的蛋白质和/或基因表达，
vii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示MDR3的蛋白质和/或基因表达，
viii)至少1％的细胞或相关的细胞核显示OCT-1的蛋白质和/或基因表达
B.药物代谢酶
ix)至少20％的细胞或相关的细胞核显示GST A1-1和GSTM1-1的蛋白质和/或基因表达，
x)至少5％的细胞或相关的细胞核显示下述CYP s-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4、-3A7和-7A1中的至少2种的蛋白质和/或基因表达，
xi)至少5％的细胞或相关的细胞核显示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白质和/或基因表达。
30.根据条款26-29中任一项的方法，其中在获得的细胞群体中的至少20％细胞显示下述特征中的至少一种：α-1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF3β、白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白和下述6种特征中的至少2种
A.药物转运蛋白
i)至少1％的细胞显示BSEP的蛋白质和/或基因表达，
ii)至少1％的细胞显示MRP2的蛋白质和/或基因表达，
iii)至少1％的细胞显示OATP-2和/或OATP-8的蛋白质和/或基因表达，
B.药物代谢酶
iv)至少20％的细胞显示GST A1-1的蛋白质和/或基因表达，
v)至少20％的细胞显示下述CYP450s-1A2、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4和-3A7中的至少2种的蛋白质和/或基因表达，
vi)至少5％的细胞显示GST M 1-1的蛋白质和/或基因表达。
31.根据条款26-30中任一项的方法，其中在获得的细胞群体中的至少20％细胞具有至少一种所述药物转运蛋白特征和至少一种所述药物代谢特征。
32.根据条款29-31中任一项的方法，其中在获得的细胞群体中的至少20％细胞具有至少4种例如至少5种所述特征。
33.根据条款29-32中任一项的方法，其中在获得的细胞群体中的至少20％细胞具有所有6种所述特征。
34.根据条款29-33中任一项的方法，其中特征i)对于至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％所述细胞有效。
35.根据条款29-34中任一项的方法，其中特征ii)对于至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％所述细胞有效。
36.根据条款29-35中任一项的方法，其中特征iii)对于至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％所述细胞有效。
37.根据条款29-36中任一项的方法，其中特征iv)对于至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％所述细胞有效。
38.根据条款29-37中任一项的方法，其中特征v)对于至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％所述细胞有效。
39.根据条款29-38中任一项的方法，其中特征vi)对于至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％所述细胞有效。
40.根据条款29-39中任一项的方法，其中在所述细胞群体中的至少约30％，例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％所述细胞表达下述特征中的至少一种：α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3β、白蛋白或肝脏脂肪酸结合蛋白。
41.根据条款29-40中任一项的方法，其中获得的至少约5％所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP3A4和/或CYP3A7。
42.根据条款29-41中任一项的方法，其中获得的至少20％所述细胞表达CYP450蛋白质中的至少一种，可在添加诱导剂后诱导。
43.根据条款29-42中任一项的方法，其中获得的至少20％所述细胞表达GST A1-1和/或GST M1-1蛋白质，可在添加诱导剂后诱导。
44.根据条款29-43中任一项的方法，其中所述UGT蛋白质的表达可在添加诱导剂后诱导。
45.根据条款29-44中任一项的方法，其中获得的至少25％所述细胞显示特征v)的CYP450蛋白质中的至少一种的酶促活性。
46.根据条款29-45中任一项的方法，其中获得的至少25％所述细胞显示GST酶促活性。
47.根据条款46的方法，其中所述GST酶促活性是在所述细胞群体的裂解物中0.4μmol/分钟/mg，例如至少0.6μmol/分钟/mg、至少0.8μmol/分钟/mg、至少1.0μmol/分钟/mg、至少1.2μmol/分钟/mg、至少1.4μmol/分钟/mg、或至少1.6μmol/分钟/mg蛋白质。
48.根据条款29-47中任一项的方法，其中所述细胞群体显示UGT酶促活性。
49.根据条款29-48中任一项的方法，其中获得的所述细胞在体外培养至少24小时，例如至少72小时并具有维持特征。
50.根据条款29-49中任一项的方法，其中获得的至少25％所述细胞进一步表达α-1-抗胰蛋白酶、L-FABP和CK-18。
51.根据条款29-50中任一项的方法，其进一步包括饲养细胞例如人或小鼠饲养细胞的使用。
52.根据条款29-50中任一项的方法，其不包括饲养细胞的任何使用。
53.根据条款29-50中任一项的方法，相关时，其包括自体饲养细胞的使用。
54.根据条款29-53中任一项的方法，其中所述细胞的培养涉及塑料细胞培养瓶的使用，所述塑料细胞培养瓶在内部包被有单独或组合的一种或多种蛋白质。
55.根据条款54的方法，其中所述一种或多种蛋白质选自胶原、层粘连蛋白及其组合。
56.根据条款54或55中任一项的方法，其中所述细胞群体使用3D环境例如多孔滤器获得。
57.DE-hep祖细胞，其可通过条款1-15中任一项中限定的方法获得。
58.DE-hep祖细胞，其如条款15-17中限定的表征。
59.DE-hep细胞，其可通过条款26-56中任一项中限定的方法获得。
60.DE-hep细胞，其具有条款29-56中任一项中限定的特征。
61.如条款58-68中任一项中限定的细胞群体用于在药物开发过程中使用的用途。
70.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体在用于研究药物转运蛋白的体外模型中的用途。
71.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体在用于研究药物代谢酶的体外模型中的用途。
72.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体在用于研究肝生成例如早期肝生成的体外模型中的用途。
73.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体在用于研究人肝再生障碍的体外模型中的用途。
74.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体用于体外肝毒性测试的用途。
75.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体在药剂中的用途。
76.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于预防和/或治疗由组织退化(例如肝脏组织退化)引起的病理状态和/或疾病的用途。
77.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于治疗肝脏病症的用途。
78.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于预防和/或治疗选自下述的肝脏病症的用途：自身免疫病症，包括原发性胆汁性肝硬化；代谢病症，包括血脂异常；由例如酒精滥用引起的肝脏病症；由病毒引起的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和甲型肝炎；由针对例如药学药物的急性中毒反应引起的肝脏坏死；和在患有例如肝细胞癌的患者中的肿瘤摘除。
79.如条款57-61中任一项中限定的细胞群体用于制造医学产品用于治疗和/或预防代谢病理状态和/或疾病的用途。
80.来自如条款57-61中任一项中限定的细胞群体的一种或多种细胞用于获得代谢改善的肝细胞样细胞的用途。
81.来自如条款57-61中任一项中限定的细胞群体的一种或多种细胞用于研究朝向肝细胞样细胞成熟的用途。
82.用于就肝细胞毒性筛选化合物的方法，其包括使来自如条款57-61中任一项中限定的细胞群体的细胞暴露于所述化合物，并且测定所述化合物对所述细胞是否是毒性的。
83.用于就调节肝细胞功能的能力筛选化合物的方法，其包括使来自如条款57-61中任一项中限定的细胞群体的细胞暴露于所述化合物，测定所述细胞中起因于与所述化合物接触的任何表型或代谢变化，并且使所述变化与调节肝细胞功能的能力关联。
机译： 通过定形内胚层（DE-hep）从人胚泡衍生干细胞衍生的新型肝细胞群体
机译： 通过定形内胚层（DE-hep）从人胚泡干细胞衍生出新的肝细胞群体
机译： 通过定形内胚层（DE-hep）从人胚泡干细胞衍生出新的肝细胞群体
