长双歧杆菌和海马BDNF表达

摘要

本发明总体上涉及包含益生菌剂的食用组合物。本发明的一个实施方案涉及包含长双歧杆菌ATCC BAA-999的食用组合物。这种组合物可以用于减轻海马BDNF表达的降低和/或用于治疗或预防焦虑以及相关的疾病。

说明书

本发明总体上涉及包含益生菌剂的食用组合物。更具体地，本发明涉及包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ATCC BAA-999的食用组合物，及其用于增强海马BDNF表达和/或用于治疗或预防焦虑和相关疾病的用途。

焦虑症影响了大约4千万18岁和更大年龄的美国成年人。这代表平均大约18％的成年人群。短暂时期的焦虑可以例如由压力性事件如考试或者由被认为是些微尴尬的环境引起。然而，焦虑可以持续更长时间，如至少半年，并且如果不治疗，焦虑疾病可以继续变得更严重并成为废人。焦虑症也可以伴随其它精神或生理疾病发生，包括酒精或物质滥用。一般的焦虑症是惊恐症、强迫症(OCD)、创伤后应激症(PTSD)、社交恐惧症(或者社交焦虑症)、特定恐惧症和广泛性焦虑症(GAD)。

一些用于焦虑相关疾病的治疗目前是可以获得的。焦虑症通常用药物例如抗抑郁剂、抗焦虑药或β阻断剂治疗。

药物改变了大脑化学，且有时具有严重的副作用。它们也可以与经常服用的药物具有不期望的相互作用。

选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)改变了大脑中支持脑细胞通信的神经递质血清素的水平。SSRI具有比以往的抗抑郁剂更少的副作用，但当人们第一次开始服用它们的时候，它们有时会产生轻微的恶心或神经过敏。一些人用SSRI也经历了性功能障碍。

三环药作为抗抑郁剂有时会引起头晕、倦睡、口干和体重增加。

单胺氧化酶抑制剂(MAOI)是一类最古老的抗抑郁药物。服用MAOI的人群不能食用含有酪胺的多种食物和饮料(包括奶酪和红葡萄酒)或者不能服用某些药物。它们也可以与咖啡因相互作用。MAOI也可以引起意识模糊、幻觉、多汗、肌肉僵硬、癫痫、血压或心律改变和其它潜在地威胁生命的疾病。

苯二氮杂类可以引起倦睡，且患者可能会习惯于它们。在停用苯二氮杂类后常常报道出现戒断症状。它们也增加食物摄取并损害记忆。

β阻断剂可以预防伴随某些焦虑疾病，特别是社交恐惧症的身体症状。

所有这些药物可能产生不想要的副作用。考虑到大量的人们都受到焦虑相关疾病影响的事实(严重程度或多或少)，那么可以安全施用而无副作用危险的可用组合物应当是期望的。

WO2004098622描述了包括对受试者施用细菌菌株来治疗抑郁的方法。

然而，本发明人已经发现，治疗和/或预防焦虑、焦虑相关疾病和/或神经变性疾病的有效性取决于所用细菌的属、种和株系。

因此，本发明的目的是改善本领域的现状，并且具体地是提供本领域以包含细菌菌株的组合物，所述细菌菌株是有效的、容易获得的、低价且施用安全无不要想的副作用，所述组合物可以用于治疗或预防与低海马BDNF表达有关的疾病，例如焦虑、焦虑相关疾病或神经变性疾病。

本发明人已经满足了这种需求。他们惊奇地发现，他们可以通过独立权利要求的主题来达到该目标。从属权利要求进一步发展了本发明的意图。

因此，本发明的一个实施方案是包含长双歧杆菌，特别是长双歧杆菌ATCC BAA-999的食用组合物。长双歧杆菌ATCC BAA-999是商业可获得的。

长双歧杆菌ATCC BAA-999(BL999)可以例如在商标BB536下获自日本的Morinaga Milk Industry有限公司。它可以根据任一合适的方法培养并制备用于胶囊封装或者用于添加至例如冷冻干燥或喷雾干燥形式的产品中。

尽管本发明公开的是关于优选的长双歧杆菌菌株，长双歧杆菌ATCC BAA-999，应当理解，本公开通常同样应用于长双歧杆菌物种。

发现长双歧杆菌ATCC BAA-999是特别有效的。

“食用的”意指经批准的用于人类或动物消耗的物质。

术语“长双歧杆菌ATCC BAA-999”意为包括该细菌、该细菌的部分和/或被该细菌发酵的生长培养基。

食用的组合物可以是药物，但优选的是食物组合物、宠物食物组合物、饮食补充剂、营养品和/或饮品。

如果本发明的组合物是食物组合物，那么这将具有优势，该种组合物可以分布于药房、药店，也可以在正规的超级市场，在组合物对每个人而言都是容易得到的地方。

食物组合物的总体上可口的味道将会进一步有助于产品的接受。特别是儿童或宠物更喜欢乐意地消费具有广泛喜欢的味道的组合物。

应用于本发明的食物产品的例子是酸乳、乳、调味乳、冰淇淋、速食甜品、用于用如乳或水重构的粉末、巧克力奶饮品、麦芽饮品、速食食品、适合于人类的速溶食品或饮品或者代表欲用于宠物或家畜的完全或部分饮食的食物组合物。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合物是欲用于人类、宠物或家畜的食物产品。具体而言，组合物欲用于选自狗、猫、猪、牛、马、山羊、绵羊、家禽或人类，并且在一个优选的实施方案中，组合物是欲用于成年物种，特别是人类成年人的食物产品。

本发明的组合物可以进一步含有保护性亲水胶体(hydrocolloids)(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、黏合剂、膜形成剂、包囊剂/物质、壁/壳物质、基质化合物、涂层、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、运载体、填充物、共化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、加重剂、凝胶剂、胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。组合物也可以含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任一来源的明胶、植物胶、磺化木质素(ligninsulfonate)、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、染色剂、湿润剂、填充物等。总之，此类进一步的组分根据它们对目的接受物的适宜性而选择。

组合物可以是营养完全制剂。

根据本发明的组合物可以包含蛋白质源。

可以使用任一合适的饮食蛋白质，例如动物蛋白质(例如乳类蛋白质、肉类蛋白质和蛋类蛋白质)；植物蛋白质(例如大豆蛋白质、小麦蛋白质、稻蛋白质和豌豆蛋白质)；游离氨基酸的混合物；或者它们的组合。特别优选的是乳类蛋白质例如酪蛋白和乳清以及大豆蛋白质。

蛋白质可以是完整的或者经水解的或者是完整的和水解的蛋白质的混合物。可能希望提供部分水解的蛋白质(水解程度在2％和20％之间)，例如对于有发生牛乳过敏症危险的人类受试者和/或动物。如果需要经水解的蛋白质，那么水解方法可以根据需要和根据本领域所已知来实施。例如，可以通过一步或多步酶促地水解乳清级分来制备乳清蛋白水解物。如果用作起始物质的乳清级分是基本上无乳糖的，那么发现在水解过程中，蛋白质经历了少得多的赖氨酸阻滞(lysine blockage)。这使赖氨酸阻滞的程度从大约15％总赖氨酸重量减少到少于大约10％赖氨酸重量；例如大约7％赖氨酸重量，这极大地改善了蛋白质源的营养质量。

组合物也可以含有碳水化合物源和脂肪源。

如果组合物包括脂肪源，脂肪源优选地提供了5％至40％的组合物能量；例如20％至30％能量。合适的脂肪谱可以使用调和菜籽油、玉米油和高油酸向日葵油获得。

可以向组合物加入碳水化合物源。

碳水化合物源优选地提供了40％至80％的组合物能量。可以使用任一合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精和它们的混合物。根据需要也可以加入可食纤维。可食纤维未经酶消化地通过小肠，且如天然膨胀剂和缓泻药那样发挥功能。可食纤维可以是可溶的或者不溶的，且一般而言，优选的是两种类型的掺合。合适的可食纤维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔豆胶、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、寡果糖、酸性寡糖、寡聚半乳糖、唾液酰乳糖和来源于动物乳的寡糖。优选的纤维混合物是具有短链寡果糖的菊粉的混合物。优选地，如果存在纤维，那么纤维含量在所消耗的组合物的2g/l至40g/l之间，更优选地在4g/l至10g/l之间。

根据政府机构例如USRDA的推荐，组合物也可以含有矿物质和微量营养物例如痕量元素和维生素。例如，组合物可以含有每日剂量的一种或多种以下给出了范围的微量营养物：300至500mg钙、50至100mg镁、150至250mg磷、5至20mg铁、1至7mg锌、0.1至0.3mg铜、50至200μg碘、5至15μg硒、1000至3000μgβ-胡萝卜素、10至80mg维生素C、1至2mg维生素B1、0.5至1.5mg维生素B6、0.5至2mg维生素B2、5至18mg烟酸、0.5至2.0μg维生素B12、100至800μg叶酸、30至70μg维生素H、1至5μg维生素D、3至10μg维生素E。

根据需要，可以将一种或多种食品级乳化剂掺入到组合物中；例如二乙酰酒石酸单甘油酯和二乙酰酒石酸二甘油酯、卵磷脂和单甘油酯和二甘油酯。类似地，也可以包括合适的盐和稳定剂。

组合物优选地是经口的或经肠的施用；例如以用于用乳和水重构的粉末形式。

根据本发明的一个优选的实施方案，组合物包含至少一种其它种类的其它食品级的微生物。

“食品级”微生物是在食物中使用的安全的微生物。

食品级微生物优选的是食品级细菌或食品级酵母。食品级细菌可以选自乳酸细菌、双歧杆菌属(bifidobacteria)、丙酸杆菌属(propionibacteria)或者它们的混合物。对于食品级酵母，可以使用例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)。

食品级细菌可以是益生菌。

“益生的”意指具有对宿主的保健或健康起有益的作用的微生物细胞制备物或微生物细胞的组分。(Salminen S、Ouwehand A.Benno Y.等“益生菌剂：应当怎样定义它们(Probiotics：how should they bedefined)”Trends Food Sci.Technol.1999：10107-10)。

益生菌优选地选自乳酸细菌、双歧杆菌属、丙酸杆菌属或它们的混合物。益生菌可以是具有已建立的益生特性的任一乳酸细菌或双歧杆菌。例如，它们也可能促进双歧杆菌肠道小型生物群(bifidogenic intestinal microbiota)的形成。

合适的益生菌剂可以选自双歧杆菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)和酵母属(Saccharomyces)或者它们的混合物，特别地选自长双歧杆菌、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、布拉氏酵母和路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)或者它们的混合物，优选地选自约汉逊氏乳杆菌(NCC533；CNCM I-1225)、长双歧杆菌(NCC490；CNCM I-2170)、长双歧杆菌(NCC2705；CNCM I-2618)、乳双歧杆菌(2818；CNCM I-3446)、类干酪乳杆菌(NCC2461；CNCM I-2116)、鼠李糖乳杆菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌(NCC4007；CGMCC 1.3724)、屎肠球菌SF 68(NCIMB10415)和它们的混合物。

在本发明的一个优选的实施方案中，组合物进一步含有至少一种益生素。“益生素”意指目的为促进益生菌在肠中生长的食物物质。

因此，益生素可以促进某些食品级细菌，特别是益生菌在肠中的生长，并且可以因此增强长双歧杆菌ATCC BAA-999的作用。此外，几种益生素对例如消化具有积极的影响。

优选地，益生素选自寡糖并任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；可食纤维；或者它们的混合物。

可以将长双歧杆菌ATCC BAA-999作为活细菌以及灭活的细菌物种二者使用。

优选的是至少一部分长双歧杆菌ATCC BAA-999在组合物中是活的，且优选地活着到达肠道。这样，它们可以存留在肠道中并可以通过增殖来增加它们的有效性。它们也可以通过与共生菌和/或宿主相互作用来发挥作用。

对于特殊的无菌食物产品或药物，例如优选地，长双歧杆菌ATCC BAA-999在组合物中不是活的。因此，在本发明的一个实施方案中，至少一部分长双歧杆菌ATCC BAA-999在组合物中不是活的。

长双歧杆菌ATCC BAA-999以任一浓度都是有效的。

对于本发明的组合物，一般优选地，组合物的每日剂量包含10⁴和10¹²cfu(菌落形成单位)的长双歧杆菌ATCC BAA-999。长双歧杆菌ATCC BAA-999的特别合适的每日剂量是10⁵至10¹¹cfu，更优选地10⁷至10¹⁰cfu。

本发明的组合物也可以包含对于组合物的每克干重而言的10²和10¹⁰cfu之间，优选地10³至10⁸菌落形成单位，更优选地10⁵至10⁸cfu的长双歧杆菌ATCC BAA-999。

在灭活的长双歧杆菌ATCC BAA-999的情况下，本发明的组合物一般优选的包含对于组合物的每克干重而言的10²和10¹⁰之间的长双歧杆菌ATCC BAA-999非复制细胞。长双歧杆菌ATCC BAA-999的特别合适的剂量是对于组合物的每克干重而言的10³至10⁸个非复制细胞，更优选地10⁵至10⁸个非复制细胞。

本发明人特别惊奇的发现，本发明的组合物可以成功用于显著地增加海马BDNF表达。

BDNF(脑源性神经营养因子)是来自影响神经和非神经细胞的增殖、分化、存活和死亡的多肽生长因子独特家族的生长因子。BDNF和其它神经营养因子例如NGF(神经生长因子)、NT-3(神经营养蛋白-3)和NT-4(神经营养蛋白-4)对神经系统的健康和安宁是必不可少的，且除了其在细胞存活中的作用外，还介导高级活动例如学习、记忆、行为。神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病，以及包括抑郁和物质滥用在内的精神疾病牵涉到神经营养蛋白水平的改变(Chao等，2006，Clin.Sci.，110：167-173)。

因此，本发明的一个实施方案是包含长双歧杆菌ATCC BAA-999和/或其生长培养基的食用组合物以增加海马BDNF表达。

本发明也涉及上述组合物用于制备增加海马BDNF表达的制剂的用途。

因此，本发明的长双歧杆菌ATCC BAA-999和/或组合物可以用于治疗或预防与减少的海马BDNF表达相关的疾病。施用有效剂量的长双歧杆菌ATCC BAA-999也将有助于减弱海马BDNF表达的减少。

因此，本发明的组合物可以用于治疗或预防焦虑和/或焦虑相关疾病以及它们的症状。它也可以用于治疗或预防神经变性疾病。

焦虑相关疾病可以选自抑郁、物质滥用例如酒精滥用、可卡因滥用、阿片剂滥用、强迫性进食、和压力的有害影响例如睡眠失调和认知损伤。

神经变性疾病优选地选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、脑炎和糖尿病。

重要地，本发明的主题也可以用于改善大脑性能，特别是在老年人和/或在变老过程中。

值得注意的，本发明的长双歧杆菌ATCC BAA-999和/或组合物也可以用于降低治疗或预防与减少的海马BDNF表达有关的疾病所需药物的量。

本领域技术人员清楚，在本说明书中所描述的任一特征可以在没有超出本发明所公开的范围内自由的组合。具体而言，对本发明组合物所描述的所有特征适合于本发明的用途，反之亦然。

本发明进一步的特征和优点由以下实施例和附图产生：

图1显示了暗箱/亮箱(Black box/bright box)测试的结果：感染了鼠鞭虫(Trichuris muris；Tm)的小鼠花费在亮箱中的总时间和重新进入亮箱的等待时间以及跳台测试的等待时间。Tm-培养基和Tm-长双歧杆菌是分别用新鲜培养基(阴性对照)和长双歧杆菌ATCC BAA-999处理的Tm感染小鼠；显示了用鼠李糖乳杆菌(L.rh)处理的Tm组用于比较。

图2显示了在用鼠鞭虫(Tm)感染的小鼠的脑海马区域中的原位杂交的结果。Tm-长双歧杆菌是用长双歧杆菌ATCC BAA-999处理的Tm感染小鼠；显示了用鼠李糖乳杆菌菌株处理小鼠的Tm组用于比较。³⁵S信号的定量通过放射自显影和图像分析进行(右上图)。

图3显示了在用鼠鞭虫感染的小鼠中通过髓过氧化物酶活性测定法(左图)和单核细胞浸润(右图)测量的结肠炎症获得的结果。Tm-培养基和Tm-长双歧杆菌是分别用新鲜培养基(阴性对照)和长双歧杆菌ATCCBAA-999处理的Tm感染小鼠；显示了用鼠李糖乳杆菌菌株处理小鼠的Tm组用于比较。

图4显示了暗箱/亮箱测试的结果：患慢性DSS诱导的结肠炎的小鼠花费在亮箱中的总时间和重新进入亮箱的等待时间以及跳台测试的等待时间。DSS-培养基和DSS-长双歧杆菌是分别用新鲜培养基(阴性对照)和长双歧杆菌ATCC BAA-999处理的患DSS诱导的结肠炎的小鼠。

图5显示了在患慢性DSS诱导的结肠炎的小鼠的脑海马区域中的原位杂交的结果。DSS培养基和DSS长双歧杆菌是分别用新鲜培养基(阴性对照)或长双歧杆菌ATCC BAA-999处理的患DSS诱导的结肠炎的小鼠。³⁵S信号的定量通过放射自显影和图像分析进行(右上图)。

图6显示了在患慢性DSS诱导的结肠炎的小鼠中通过髓过氧化物酶活性测定法(左图)和单核细胞浸润(右图)测量的结肠炎症获得的结果。DSS培养基和DSS长双歧杆菌是分别用新鲜培养基(阴性对照)或长双歧杆菌ATCC BAA-999处理的患DSS诱导的结肠炎的小鼠。

图7显示了在患慢性DSS诱导的结肠炎和进一步用新鲜的培养基(MRS，阴性对照)处理的或者用不同的长双歧杆菌属物种处理的小鼠中进行的焦虑样行为测试(跳台测试)的结果。测试的长双歧杆菌菌株是长双歧杆菌ATCC BAA-999；显示了用乳双歧杆菌(B.lactis)、动物双歧杆菌(B.animals)和婴儿双歧杆菌(B.infantis)菌株获得的结果用于比较。

实施例

用寄生虫鼠鞭虫慢性感染的小鼠在两种行为测试中显示出增加的焦虑样行为：1)在暗箱/亮箱测试中，感染小鼠表现出在亮箱中花费的时间减少，且重新进入亮箱的等待时间增加；2)在跳台测试中，感染增加了从台上下来的等待时间(图1)。仅在用长双歧杆菌处理的小鼠中观察到了对与鼠鞭虫介导的在海马中BDNF水平的减少的正常化有关的对行为的影响(图2)。与此相反，用长双歧杆菌以及鼠李糖乳杆菌处理导致了先前由鼠鞭虫感染诱导的髓过氧化物酶活性和单核细胞浸润的下降(图3)，表明行为的正常化与细菌的抗炎症作用是相互独立的。

长双歧杆菌的作用在慢性DSS诱导的结肠炎的小鼠模型中得到了验证。虽然不及鼠鞭虫感染的影响重要，但是DSS增加了焦虑(图4)并倾向于减少海马中BDNF水平(图5)。在暗箱/亮箱测试中，通过在亮箱中花费的总时间的增加和重新进入亮箱的时间以及穿越次数的减少(图4)，以及通过在跳台测试中观察到的从台上跳下的等待时间的降低(图4)证明了用长双歧杆菌处理DSS小鼠减少的焦虑甚至低于对照小鼠的水平。此外，根据行为测试，用长双歧杆菌处理，在海马中增加的水平超过了基本水平(图5)。与在鼠鞭虫感染的模型中观察到的结果类似，长双歧杆菌缓解了结肠炎(图6)。

为了确定长双歧杆菌正常化改变的行为的能力是否对其它双歧杆菌也是共有的，我们使用DSS诱导的结肠炎模型和跳台测试平行测量了长双歧杆菌和其它双歧杆菌属物种—一种乳双歧杆菌、一种动物双歧杆菌和一种婴儿双歧杆菌对行为的影响(图7)。除长双歧杆菌外，其它测试的双歧杆菌属物种无一能够降低从台上跳下的等待时间，明确表明了不可能将长双歧杆菌的该特定特征外推至双歧杆菌属的其它物种。

材料和方法：

细菌培养条件

将益生菌剂在厌氧条件下在Man-Rogosa-Sharpe(MRS，BioMerieux)肉汤(双歧杆菌和0.5％半胱氨酸)中生长。在37℃24小时后，通过在600nm处测量光密度来估计细菌的数量(1OD600＝10⁸个细菌/mL)。通过在4℃5000×g离心15分钟沉淀细菌细胞，并在其用过的培养基中以10¹⁰个/mL的浓度进一步重悬。等分为1mL冷冻保存直到使用。

动物

购买6-8周龄的雄性BALB/c或者AKR小鼠(Harlan，加拿大)并饲养在McMaster大学中心动物研究所的常规无特定病原体区。所有实验都经McMaster大学动物保护委员会批准。

设计

慢性鼠鞭虫感染(参阅图8，A部分)：

用鼠鞭虫(300个卵/小鼠)(n＝26)或者用安慰剂(n＝9)管饲雄性AKR小鼠。然后从第30天开始，将感染的小鼠每日管饲鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌或者新鲜的MRS 10天。从第30天至第40天，将未感染的小鼠每日用新鲜的MRS管饲。在益生菌剂或安慰剂施用的最后，将小鼠进行暗箱/亮箱和跳台测试。然后，将小鼠处死并获取组织样品。将结肠样品固定在福尔马林中用于组织学分析或者快速冷冻用于MPO测定。将脑快速冷冻于液氮中并保存用于原位杂交。

慢性DSS结肠炎(参阅图8，B部分)：

用3个循环的3％葡聚糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulphate)(MP Biomedicals，Solon，Ohio，美国)(一个循环由1周的DSS然后1周的洗脱时期组成)处理雄性AKR小鼠(n＝20)。另外的小鼠组(n＝10)仅接受安慰剂饮用水。在DSS处理的最后一个循环期间，将感染小鼠用长双歧杆菌或者其它双歧杆菌属菌管饲2周。对照小鼠每日用MRS管饲2周。在益生菌剂或安慰剂施用的最后，将小鼠进行暗箱/亮箱和跳台测试。然后，将小鼠处死并获取组织样品。将结肠样品固定在福尔马林中用于组织学分析或者快速冷冻用于MPO测定。将脑快速冷冻于液氮中并保存用于原位杂交。

行为测试

暗箱/亮箱(参阅图8，C部分)：

使用在文献中所述的暗箱/亮箱在小鼠中单独地评估焦虑行为。简而言之，将每只小鼠置于发光的白箱(30×30cm)的中央，该白箱通过开口(10×3cm)与较小的暗箱(30×15cm)相连。通过数字摄像机记录每只小鼠在白箱中的移动行为10分钟并保存在计算机中用于离线分析。通过盲观察者评估几个参数，包括在白箱中的总花费时间、重新进入白箱的等待时间(在第一次进入后在暗箱中花费的时间)和穿越的次数(从暗箱到白箱穿越的次数)。

跳台测试(参阅图8，D部分)：

使用在文献中所述的跳台实验来评估焦虑行为。简而言之，将每只小鼠置于位于黑色地板的中间的高台(直径7.5cm，高3cm)的中央。通过停表测量从台上跳下来的等待时间；测试的最大持续时间是5分钟。

组织学

将结肠样品固定于10％福尔马林中，然后用苏木精-伊红染色。在光学显微镜下检查切片以对急性和慢性炎性浸润分级。

髓过氧化物酶活性测定法

为了评价急性肠炎，如之前所述在冰冻的组织上进行了髓过氧化物酶活性(MPO)测定。MPO活性以每mg组织中的单位数表示，其中一个单位的MPO定义为在室温1分钟能转化1μmol的过氧化氢成水的酶的量。

在CNS中原位杂交

如之前所述，通过原位杂交使用³⁵S-标记的RNA探针在冰冻的脑切片上评估海马中BDNF的水平(Whitfield等，1990；Foster等，2002)。简而言之，将脑摘掉并通过浸没在-60℃的2-甲基丁烷中迅速冷冻，并且保存于-70℃。将恒冷切片机切割的12-μm厚的冠状切片放在明胶包被的载玻片上解冻、干燥并保存于-35℃。将组织切片用4％甲醛固定，用在0.1M三乙醇胺-HCl，pH 8.0中的0.25％乙酸酐乙酰化、脱水和用氯仿脱脂。使用Riboprobe System(Promega Biotech，Burlington，ON)分别用α-³⁵S-UTP(比活性＞1000Ci/mmol；Perkin-Elmer，Boston，MA)以及T3和T7聚合酶从线性化质粒转录反义BDNF核糖核苷酸探针。将放射性标记的探针在杂交缓冲液(0.6M NaCl、10mM Tris pH 8.0、1mM EDTApH 8.0、10％葡聚糖硫酸盐、0.01％经剪切的鲑鱼精子DNA、0.05％总酵母RNA、类型XI、0.01％酵母tRNA、1×Denhardt溶液)中稀释并应用于脑切片(约500,000CPM/切片)。将切片在湿度小室中55℃温育过夜。为了降低探针的非特异性结合，将切片在室温的20μg/ml RNase溶液中洗涤30分钟，然后在50℃的2×SSC中、55℃和60℃的0.2×SSC中各1小时。将切片脱水并风干用于放射自显影。将切片和¹⁴C塑料标准品置于X-射线盒中，胶片(BioMax MR；Eastman Kodak，Rochester，NY)上5天并显影(Kodak Medical X-Ray Processor)。使用QCapture软件(Qicam；Quorum Technologies有限公司，Guelph，ON)和具有图像软件的基于Macintosh计算机的图像分析系统(http://rsb.info.nih.gov/nih-image)，将脑切片和标准品的放射自显影胶片图像用具有60mm Nikon镜头的固态照相机数字化。经过胶片的透光率通过描画监视器上的结构来测量。对于BDNF mRNA，使用应用于标准品的Rodbard曲线，将透光率转换成放射性水平。然后，将经计算的DPM乘以面积以产生积分密度(integrated density)的测量值。图示直接来自所捕获的图像。

统计分析

数据视情况而定表示为平均值±标准偏差或者为具有四分位数间距(interquartile range)的中位数。视情况而定，使用双尾ANOVA检验或者非成对t检验分析数据。认为p值＜0.05是统计上显著的。