玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法

摘要

本发明涉及一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法。本发明的方法包括：(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液(2)培养玉米幼苗；(3)将步骤(2)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤(1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为6X10

说明书

技术领域：

本发明涉及一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，属于玉米抗病性鉴定技术领域。

背景技术：

玉米丝黑穗病是世界性的重要玉米病害。在国外最早报道见于1875年，亚、非、欧洲各国家均有不同程度发生，给玉米生产带来一定的经济损失(王远路，2005)。该病在我国各玉米产区均有不同程度的发生，其中以北方春播区、西南丘陵山地区受害较重，一般发病率在5％～10％之间，个别重病地块发病率可达60％～70％以上。

可通过加强田间管理降低玉米丝黑穗病发病率，也可采用种子包衣等药剂防治措施使发病程度得到控制，但这些方法受气候和人为操作影响较大，稳定性不足，成本高，易造成感病和严重的减产，药物使用不当容易对玉米造成毒害，易污染环境，而且不同的品种间对玉米丝黑穗病的抗性存在极显著的差异。防治该病最有效的方法是种植抗病玉米品种，而抗病品种的选育依赖于抗病种质资源，为此需加强对玉米种质资源进行该病的抗性评价，进而选育抗病玉米自交系。

由于玉米丝黑穗病从种子萌发到七叶期都能侵染，并且各时期表现不同的特征，因此该病的抗性鉴定方法较多。主要包括：质壁分离法、接种后在乳熟期进行鉴定、乳酚油棉兰染色玉米生长锥鉴定法、丁布含量测定方法、叶片褪绿斑的有无鉴定法、通过观察生长锥中菌丝进行鉴定、PCR技术的玉米丝轴黑粉菌侵染率。其中，乳熟期进行田间菌土法鉴定是目前通用的鉴定方法(Kruger W，1962)，具体方法为：从上一年秋季的典型病株上采集病瘿，装布袋、置通风处越冬；播种前一周将病瘿上的菌粉抖落，用40目的筛子筛出冬孢子，按0.1％质量比与晒过的细土混合配成菌土；播种时先播种子，覆盖菌土100g，上面再上一层覆土，等玉米生长到乳熟期进行病株率调查。虽然鉴定结果相对准确可靠，但是存在一定的局限性：用地量大，需要时间长，要求材料纯度高，鉴定群体量大一般不少于50株，同时需在多年多点多个环境进行鉴定。通过观察生长锥中菌丝进行鉴定目前有6种常用的染色法，并且，张宝艳(2008)比较了姬姆萨氏色素(Giemsa)、考马斯亮兰组织透明染色、番红O-KOH、苯胺蓝-甘油、曲利苯兰酒精-乳酚酸和苯胺蓝-乳酚油染色法对玉米丝黑穗病菌不同生长发育阶段的染色效果。结果表明，在一定的染液浓度条件下，6种染色方法均可进行冬孢子、芽管、先菌丝、担子、担孢子等寄主组织内部菌体的原位染色。曲利苯兰组织透明染色方法更稳定、简捷和易于观察，能观察玉米丝黑穗病菌的整个生长发育阶段，因此适宜胞间菌丝的染色。此法对丝黑穗的鉴定也比较准确，每次鉴定的量少，并且，据檀国庆(2009)报道，发现玉米在接种后有带菌现象，即植物体内有菌丝存在但在乳熟期不发病。因此，这种状况就很难判断。

上面的每种方法都有其优点和局限性，如利用在苗期侵染叶片所产生的褪绿斑点来鉴定抗病性的方法仅适用于自交系且判断不准确；而乳熟期鉴定结果虽然准确可靠，但用地量大，工作效率低，群体不少于50株，同时需在多个环境鉴定，因此需要寻求一种能在室内准确快速鉴定资源抗性的方法。

发明内容：

本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，达到建立简便、快速、有效、准确的使用少量材料即可进行玉米丝黑穗病接种鉴定的目的。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，该方法包括如下步骤：

(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液：玉米丝黑穗病菌冬孢子粉在室温下干燥6-7天，无菌水清洗，甲醛+高锰酸钾熏蒸25min，接种至麦芽糖水琼脂培养基，28℃下倒置暗培养17h，挑取已经萌发的单个冬孢子，接种至马铃薯葡萄糖培养基，28℃下倒置暗培养15d，将培养好的丝黑穗病菌的菌落刮出，转入2％的蔗糖溶液中，28℃下振荡暗培养48h，调整菌液浓度为6.2×105cfu/ml；

(2)培养玉米幼苗：挑选发育良好玉米种子，放入铺好滤纸的发芽盒中，喷水后放入人工气候箱中，20℃下进行暗培养，直至芽长到3cm；

(3)接种玉米丝黑穗病菌：将步骤(2)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤(1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为6X10^-2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25℃/15℃变温处理；

(4)接种后幼苗的培养：在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20％；

(5)接种效果的检测：接种10d后，取接种部位下1cm下的玉米茎部组织，CTAB法提取DNA，依据玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，采用PCR的方法进行接种效果的检测。

所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，步骤(5)中所述的引物为：引物1：5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3′，引物2：5′-ATACACCTGTGACGGCTG-3′，PCR反应程序为预变性95℃3min，变性95℃30s，退火温度56℃40s，延伸72℃40s，循环37次，终延伸72℃延伸10min，最后4℃保存。

有益效果：

1.适应范围广：本发明的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定方法适用于玉米种质对玉米丝黑穗病的抗性鉴定及遗传研究，本发明对丝黑穗病菌接种浓度、接种部位、接种温度、土壤湿度等接种条件，进行了详细的研究，确立了适宜的范围，建立了玉米丝黑穗病接种室内快速接种鉴定方法，本发明的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法具有适用范围广的特点，适用于几乎所有的玉米种质。

2.本发明所需样本数量少，操作比较简便。本发明只需少量玉米材料，效率高，成本低廉。本发明步骤简单，不需将玉米播种至田间，接种鉴定周期短，鉴定效率高。

3.本发明易于掌握，不受环境条件影响，重复性高。本发明使用玉米幼苗中胚轴为接种部位，容易获得，在室内进行检测，条件可控，适于对大量玉米种质对玉米丝黑穗病的抗性检测及遗传研究。

附图说明：

附图1是本发明的步骤框图。

附图2是接种浓度各自交系变化分析图。

附图3是土壤湿度各自交系变化分析图。

附图4是接种部位各自交系变化分析图。

附图5是接种方法各自交系变化分析图。

附图6是接种温度各自交系变化分析图。

具体实施方式：

实施例1：

玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，该方法包括如下步骤：

(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液：玉米丝黑穗病菌冬孢子粉在室温下干燥6-7天，无菌水清洗，24ml甲醛+12g高锰酸钾熏蒸25min，接种至麦芽糖水琼脂培养基，28℃下倒置暗培养17h，挑取已经萌发的单个冬孢子，接种至马铃薯葡萄糖培养基，28℃下倒置暗培养15d，将培养好的丝黑穗病菌的菌落刮出，转入2％的蔗糖溶液中，28℃下振荡暗培养48h，调整菌液浓度为6.2×10⁵cfu/ml；

(2)培养玉米幼苗：挑选发育良好玉米种子，放入铺好滤纸的发芽盒中，喷水后放入人工气候箱中，20℃下进行暗培养，直至芽长到3cm；

(3)接种玉米丝黑穗病菌：将步骤(2)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤(1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为6X10^-2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25℃/15℃变温处理；

(4)接种后幼苗的培养：在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20％；

(5)接种效果的检测：接种10d后，取接种部位下1cm下的玉米茎部组织，CTAB法提取DNA，依据玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，采用PCR的方法进行接种效果的检测。

所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，步骤(1)中所述的麦芽糖水琼脂培养基的配比为麦芽糖1g，琼脂20g，水1000ml，所述的马铃薯葡萄糖培养基的配比为葡萄糖10g，马铃薯200g，琼脂15-20g，水1000ml。

所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，步骤(5)中所述的引物为：引物1：5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3′，引物2：5′-ATACACCTGTGACGGCTG-3′，PCR反应程序为预变性95℃3min，变性95℃30s，退火温度56℃40s，延伸72℃40s，循环37次，终延伸72℃延伸10min，最后4℃保存。

实施例2：

本试验选用经多年接种鉴定已知抗性的的高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、感病(S)和高感(HS)各2个玉米自交系为试验材料，试验材料的田间发病率及丝黑穗的抗感性见表1。

表1试验材料的田间发病率及丝黑穗的抗感性

  玉米自交系  田间发病率％  抗病性  齐319  0.00  HR  SH15  0.00  HR  Mo17  1.64  R  综31  1.40  R  B73  5.60  MR  HC  6.70  MR  X178  34.40  S  金黄96B  24.20  S  黄早四  76.81  HS  昌7-2  93.25  HS

采用正交设计，人工接种研究的因素包括丝黑穗病菌接种浓度、土壤湿度、接种部位、接种方法、接种温度，本试验的水平为3。选择L18(37)正交表，正交试验方案见表2。同时进行田间接种鉴定作为对照。

表2正交试验计划表

接种10d后，取接种部位下1cm下的玉米茎部组织，提取DNA，参照M.L.Xu(1999)所报道的玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，引物1为5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3′，引物2为5′-ATACACCTGTGACGGCTG-3′。PCR反应程序为预变性95℃3min，变性95℃30s，退火温度56℃40s，延伸72℃40s，循环37次，终延伸72℃延伸10min，最后4℃保存。

PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像系统记录结果。

根据PCR扩增结果计算材料被侵染率。材料如能扩增出特异片段，则说明材料已感病，反之则抗病。

侵染率＝感病材料数/接种材料总数×100％

主要研究结果如下：

(1)接种浓度对发病率的影响：

从图2可见，昌7-2、黄早四、X178、HC、B73、综31、Mo17的发病率都是随着接种浓度的增加而提高。表明高浓度有助于丝黑穗发病，但大多数的自交系的3个水平之间都不显著，说明了病菌接种浓度越高，对发病率的影响越不明显。也说明在丝黑穗侵染和生长过程中，接种浓度是必不可少的主要因素之一。

根据表3显示，15处理为接种浓度最佳处理，其浓度为6.2×10⁵cfu/ml。

表3各自交系各处理发病率(％)汇总表

(2)土壤湿度对发病率的影响：

如图3所示，昌7-2、黄早四、X178、金黄96B、HC、B73、综31、Mo17(SH15和齐319除外)的发病率都是随着土壤湿度水平的增加而提高，土壤相对湿度20％时达到最高。

(3)接种部位对发病率的影响：

从图4看昌7-2、黄早四、X178、金黄96B、HC、B73、综31、Mo17的发病率随着土壤湿度的变化均表现差异不显著，根据各个自交系的数据表来看，处理15为最优的接种组合，因此，中胚轴可看做一个接种的重要部位之一。

(4)接种方法对发病率的影响：

从图5可以看到，多数自交系的发病率在真空抽滤法时略高于其他两种，但是在金黄96B和Mo17中自交系下，摩擦法的略高些，这说明接种方法对发病率的影响不大，但是摩擦法和注射法需要的技巧较高，生手很难接上，并且其中摩擦法比较容易损伤茎尖和根尖，注射法的手上的力度和注射速度和注射的量较难掌握，注射的快、力度大就会使植物组织内的压力迅速升高，而引起进溅，从而导致接菌失败。所以，在大多数自交系的各水平表现相对优良的真空抽滤视为最好。根据表3各自交系各处理发病率汇总表显示，处理15是所有处理中最好的也是使用真空抽滤法中最好的。

(5)接种温度对发病率的影响：

图6中可以看到水平3(25℃/15℃变温)略高于其他，而水平2(25℃)最低，证明高温不利于丝黑穗在体内的侵染和生长，变温低温时有利于丝黑穗生长的。根据表3各自交系各处理发病率汇总表显示，25℃/15℃变温下的最佳处理为处理15。

(6)各影响因素对病菌接种效果影响的主次关系：

将本试验中病菌的接种浓度、土壤湿度、接种部位、接种方法和接种温度这5个因素进行了全面的分析，各影响因素对病菌接种效果影响的主次关系为土壤湿度＞接种浓度＞接种部位＞接种温度＞接种方法，其中土壤湿度和接种浓度为发病的主要因素。

(7)不同人工接种处理组合的比较分析：

对人工接种18个处理组合进行综合评分，当出现在最佳处理位置时加2份，次级处理加1分。通过表4所示，处理15出现最佳处理9次，次级处理3次。处理18出现最佳处理为4次，次级处理为5次。处理12在次级处理出现3次，9处理在次级处理出现1次。总评分汇总表见表5。15处理评分最高为21分，为最优处理，即接种浓度为6.2×10⁵cfu/ml、土壤湿度为20％、接种部位为中胚轴、接种方法为真空抽滤、接种温度为25℃/15℃。

表4各自交系与各接种条件最佳处理汇总表

  自交系  最佳处理  次级处理

 SH15  处理1-18  处理1-18 齐319  处理1-18  处理1-18 Mo17  处理15  处理18 综31  处理15  处理18 B73  处理15  处理12 HC  处理15  处理12 X178  处理18  处理15 金黄96B  处理15  处理12 黄早四  处理15  处理18 昌7-2  处理15、18  处理9

表5不同抗性玉米自交系，最佳接种方法综合评分表

(7)不同抗性玉米自交系的处理15与田间接种方法的相关性：

根据相关分析发现其回归方程Y＝-6.28450153+0.8616821547X 1，相关系数R值为0.97054(0.05水平的临界值是0.468，0.01水平的临界值是0.590)，处理15与田间接种方法存在极显著正相关。