一种流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法。本发明检测方法是将流感病毒神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒神经氨酸酶蛋白，可以与待检样品中的流感病毒神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应可以判定待检样品中是否存在流感病毒神经氨酸酶抗体。本发明方法简单、快速、稳定、灵敏性高，具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法。

背景技术

特定血清型流感病毒感染、感染后恢复、隐性感染、以及疫苗接种的人或动物，在其体液(如血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)中会出现流感病毒神经氨酸酶抗体，通过检测特定血清型流感病毒的抗体，可以判断、诊断或确诊该人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等。

流感病毒表面主要存在着2种抗原性较强的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神经氨酸酶NA，当流感病毒感染或隐性感染或接种疫苗后，人或动物的机体会针对HA和NA都产生抗体，正是如此，流感病毒中的甲型流感病毒根据HA的抗原性分为H1-H16等16个亚型，NA的抗原性分为N1-N9等9个亚型，在甲型流感病毒中根据HA和NA亚型的不同组合方式形成了众多亚型，如H5N1(即H5亚型与N1亚型组合)。因此，如检测流感病毒抗体，除需检测HA血清型外，还需要对NA血清型进行检测。

目前检测待检样品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗体的方法，主要有血凝抑制实验(HAI)和中和实验，即将某一特定血清型的流感病毒先与待检样品混合，然后加入红细胞或敏感细胞中，判断待检样品是否能够抑制该病毒的血凝反应或细胞病变效应来进行判定，其缺点是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隐患。而且上述方法只能用于流感病毒血凝素(HA)抗体的检测和血清型鉴定。

目前对NA血清型抗体的检测，主要有神经氨酸酶酶活性抑制的方法检测，以及ELISA方法和乳胶凝集实验方法来进行检测。其中，ELISA方法是利用重组表达和纯化的流感病毒NA来检测相应的抗体，这需要获保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，且由于流感病毒有众多亚型，即使同种亚型的血清交叉反应强度不一，对不同血清型的NA抗原都进行重组蛋白的表达与纯化，其工作量大、工艺要求高、批间稳定性差。乳胶凝集方法相对于现有的其它方法(如ELISA方法和NA活性抑制检测)而言，反应时间短、适合现场检测，但仍存在一些不足。乳胶凝集实验方法是将重组表达和纯化的流感病毒NA蛋白偶联在惰性乳胶颗粒表面，利用凝集反应进行检测流感病毒相应的抗体，这同样需要重组表达和纯化的流感病毒NA，并需要获得保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，如需要检测不同血清型的流感病毒NA抗体，就需要对不同毒株的NA进行重组表达和纯化，与ELISA方法一样，存在工作量大、工艺要求高、批间稳定性差等问题。而神经氨酸酶酶活性抑制的方法检测，需要纯化后的NA，且必需保持NA的生物活性，即NA消化特定糖链的酶活性，将待检样品加入，如含有相应的NA抗体，其NA活性将降低，通过特异性的底物进行检测，即可判断待检样品中是否含有NA抗体，该方法需要更加复杂的工艺已获得不同血清型的保持有酶活性的NA重组蛋白，同时需要特定处理(如含有荧光基团和荧光淬灭基团双标记)的纯化底物(2’，3’-唾液酸或2’，6’-唾液酸受体或衍生物等)，此外还需要借助荧光分光光度计或其它设备进行检测。

由于检测流感病毒抗体对人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等有重要意义，而且，目前尤其缺乏针对NA抗体的快速的适于现场检测的方法。而目前的NA酶活性抑制实验、ELISA以及乳胶凝集等检测手段，或需要特定的实验条件和设备，或工艺复杂，或检测耗时长等缺点，因此，一种简便、快速、工艺相对简单易控的流感病毒NA抗体检测方法具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中检测流感病毒神经氨酸酶抗体中存在的工作量大、耗时长等缺点，提供一种快速、简单的基于种族表达流感病毒神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

一种流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法，所述检测方法是将流感病毒神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒神经氨酸酶蛋白，以此为凝集反应基质，可以与待检样品中的流感病毒神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应可以判定待检样品中是否存在流感病毒神经氨酸酶抗体。

作为一种优选方案，所述流感病毒神经氨酸酶为完整全长的神经氨酸酶蛋白，或流感病毒神经氨酸酶的一部分，或流感病毒神经氨酸酶的抗原表位，或将流感病毒神经氨酸酶蛋白全长或部分肽段中的部分氨基酸进行突变或修饰。

流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病毒的NA可以分为9个亚型，同时，由于流感病毒NA的突变和进化，即使是同一亚型的NA，其交叉反应性的强弱不一。因此，检测某一特定血清型流感病毒抗体时，使用本发明的方法，将重组表达该特定血清型毒株的NA的真核细胞与待检样品进行凝集实验即可。上述的流感病毒NA，是指甲型流感病毒的N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型，以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的神经氨酸酶，可以根据检测目的的需要使用某一特定血清型的NA或其部分。

如是进行较广泛血清型的流感病毒抗体检测，则可以根据所检测的目的血清型毒株的NA进行抗原性分析，选用抗原性保守或抗原交叉性强的NA蛋白的一部分进行重组表达真核细胞的构建，利用凝集反应对较广泛血清型的流感病毒抗体检测。上述的流感病毒NA，可以是某一流感病毒毒株NA或其中一部分，也可以是不同流感病毒毒株的NA或其中一部分或不同NA的拼接或混合，也可以是对流感病毒NA进行了突变和修饰，也可以是人工合成的天然不存在的序列，但其核心是重组表达产物具有流感病毒NA的抗原性。

上述的重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞，是指将编码有流感病毒NA的基因片段导入真核细胞，在真核细胞表面重组表达流感病毒的NA。真核细胞可以是酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞，以及其它的真核细胞，重组表达的流感病毒NA位于细胞膜或细胞壁表面。其中，真核细胞优选哺乳动物细胞和昆虫细胞，其重组表达的流感病毒神经氨酸酶可以有更为接近病毒感染人或动物所获得翻译后修饰、空间构型和抗原性，其与流感病毒相应抗体的反应特异性更佳。进一步，优选哺乳动物细胞重组表达流感病毒NA。重组表达可以是瞬时表达，也可以是稳定表达。编码有流感病毒NA的基因片段可以是DNA，也可以是RNA，可以是单纯的含有启动子和编码序列的片段，也可以是质粒，也可以是病毒载体，其可以仅编码流感病毒NA，也可以同时或独立混合编码其它蛋白或多肽或肽段，其目的是将编码流感病毒NA的基因片段在真核细胞中获得重组表达。导入真核细胞的方式可以使用电击、脂质体转染、病毒介导等，目的是将编码流感病毒NA的基因片段进入真核细胞以得到重组表达。上述的重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞，其核心在于获得在细胞表面表达有流感病毒NA的真核细胞，其目的是利用所表达NA的抗原性，通过凝集实验，检测流感病毒抗体。在本发明的一个实施方案中，公布了重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞的方法。

上述的重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞，作为用于凝集反应的颗粒抗原基质，可以是天然的重组表达流感病毒神经氨酸酶的真核细胞，或是经过胰酶处理、机械分散、酶解分散、固定剂固定、稳定剂处理、防腐剂处理的等工艺同时或选择性处理后的重组表达流感病毒神经氨酸酶的真核细胞，以更好的使“凝集反应基质”进行保存、防止自凝、增加凝集反应检测的灵敏性和稳定性。在本发明的一个实施方案中，公布了重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞的处理方法，以提高凝集反应检测的灵敏性和稳定性。

作为一种优选方案，所述待检样品为人或动物体液，如血清、支气管灌洗液、血浆或组织液。

作为一种优选方案，所述流感病毒神经氨酸酶抗体为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的一种或几种的混合物。

作为一种优选方案，所述重组表达为瞬时表达或稳定表达。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明是以重组表达流感病毒NA的细胞为载体，利用凝集反应，检测待检样品中是否存在相应流感病毒的抗体。利用RT-PCR克隆特定血清型流感病毒的NA基因或其片段，构建真核表达载体，转染真核细胞，细胞表面会存在重组表达的NA，经醛化固定后，该细胞即成为表面含有NA抗原的致敏颗粒，与待检样品混合后，如待检样品中含有流感病毒的NA抗体，即会在数分钟发生凝集反应。该方法不涉及具有感染性的病毒颗粒；相比ELISA和NA酶活性抑制实验所需的数小时至数天，重组表达NA的细胞凝集反应仅需数分钟，反应时间快速；利用通用引物和载体可对不同血清型的NA基因进行克隆与转染表达，即可得到不同NA抗原的致敏细胞颗粒，可以更加广泛地对不同NA血清型流感病毒进行检测。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞的制备

本实施例以一株H5N1亚型的毒株A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1)为例，进行重组表达流感病毒神经氨酸酶NA真核表达细胞的制备。A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1)是2005年在广东省的鸡中分离得到的一株H5N1亚型流感病毒，其NA的基因序列可在公共数据库GenBank上获得，NA的序列号为EU874900.2。将该株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit提取病毒RNA，用Uni-12引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)和SuperScript III或M-MLV逆转录酶进行逆转录，得到病毒cDNA。根据该毒株NA的基因序列，设计一对用于NA全长基因克隆的引物，其引物序列具体如下：上游引物N 1NA-F：序列为5’-GTAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAGAAG-3’，从5’端依次为3个保护性碱基、Hind III酶切位点、KOZAK序列、起始密码子和配对区；下游引物N1NA-R，序列为：5’-CACGGATCCCTACTTGTCAATGGTGAATG-3’，从5’端依次为3个保护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。利用这对引物，用高保真Taq酶对病毒cDNA进行PCR扩增，扩增NA片段。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后NA基因片段后，与表达载体pcDNA3分别进行使用Hind III和BamH I双酶切，再次电泳回收后利用T4DNA连接酶将酶切回收后的NA片段与载体进行连接，分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布Amp抗性平板。菌落经PCR后，提取质粒酶切鉴定和DNA测序，获得含有NA基因片段的真核表达质粒即pcDNA-N1NA。

含有pcDNA-N1NA质粒的细菌，经含有50μg/ml的氨苄青霉素(Amp)的LB培养过夜后，用高纯度质粒提取试剂盒提取pcDNA-N1NA质粒。根据Lipofectamine 2000试剂盒说明，将3μg pcDNA-N1NA质粒和10μl Lipofectamine2000转染复合物，转染一个35mm直径培养皿含有生长密度约为80％-90％融合率的人胚肾HEK-239细胞，转染后6h去除转染复合物，更换新鲜的完全培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)。

转染后，HEK-239细胞即可瞬时重组表达NA，即得到瞬时重组表达流感病毒NA的细胞。

为进一步优化，可以筛选获得稳定重组表达NA的细胞：在转染72h后将转染细胞吹打分散，将细胞悬液的1/20接种一个新的35mm直径培养皿中，补充完全培养基至3ml，经过夜贴壁后，补加G418至浓度为600μg/ml。此后每3至5天的更换一次含有600μg/ml G418的完全培养基，约3周后可见筛选出现的抗性细胞集落。将抗性细胞集落经胰酶消化后，按10-20个细胞/ml接种96孔板培养，加入含有600μg/ml G418的完全培养基培养至长至单层后，进行传代，获得用于检测的备份培养96孔板。将检测用的96孔板的细胞用4％多聚甲醛室温固定5分钟，经PBS漂洗后，加入抗N1亚型NA的抗体为一抗、Cy3荧光标记的二抗进行免疫荧光检测，选择荧光阳性信号强、荧光阳性细胞比例高的孔，对细胞继续重复的克隆化和免疫荧光，至阳性细胞比例接近100％，即可得到稳定重组表达该毒株NA的细胞。

实施例2重组表达流感病毒神经氨酸酶(NA)的真核细胞的处理

瞬时或稳定重组表达该毒株NA的细胞，经培养后，用EDTA二钠(0.02％)室温温和处理细胞约2分钟，将细胞悬液进行离心，去除上清后用含有2％BSA的PBS进行重悬，获得EDTA处理后的细胞悬液。加入等体积的10％的冷甲醛，于4℃固定2小时。经离心、PBS重悬的方式进行3次洗涤。最后将细胞沉淀，按107个/ml的浓度重悬于含有0.2％尼泊尔金酯、2％BSA、15％甘油、0.5％肝素的PBS缓冲液中，使其能够稳定地长时间保存，即得到了处理后的重组表达NA抗原的真核细胞。

实施例3使用重组表达流感病毒神经氨酸酶的真核细胞进行凝集反应检测流感病毒抗体

将实施例2中的处理后的重组表达NA抗原的真核细胞悬液1滴(约50μl)加到洁净的载玻片上，然后加入50μl的待检样品(血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)，前后左右轻轻晃动载玻片或使用微量移液器吸头将其混匀，室温下1-3分钟观察是否出现细胞凝集。

设立阳性血清和阴性血清对照，如对照样品符合预期结果，待检样品发生未凝集时，说明待检样品中不含有与该毒株NA具有反应性的流感病毒NA抗体或抗体浓度低于该方法所能达到的检测浓度。

待检样品发生凝集时，说明待检样品中含有与该毒株NA具有反应性的流感病毒NA抗体。此时可以进一步进行相对定量分析，即，将待检样品1进行连续的倍比稀释，然后分别与实施例2中的处理后的重组表达NA抗原的真核细胞悬液进行凝集反应，得到所能发生凝集的最高稀释度，设为d1。同样方法可得到待检样品2的凝集反应阳性最高稀释度d2。以此横向比较不同待检样品中流感病毒NA抗体的浓度差异和相对比例。

一种流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法序列表

SEQUENCE LISTING

<110>汕头大学医学院

<120>一种流感病毒神经氨酸酶抗体的快速检测方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agcaaaagca gg    12

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gtaaagctta ccatgaatcc aaatcagaag    30

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cacggatccc tacttgtcaa tggtgaatg    29