一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗。本发明利用热灭活的表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞作为乙肝疫苗，其中HBsAg是疫苗的抗原部分，汉逊酵母细胞为疫苗的佐剂部分。动物免疫实验证实：该疫苗能够诱导免疫细胞向脾脏聚集，促进DCs的成熟，该疫苗不但能够在小鼠体内诱生Th1方向的免疫应答，而且还能够增强Th2方向的免疫应答，包括总IgG，IgG1，IgG2a，特异性CTL活性，抗原特异的IFN-γ产生能力。本发明能弥补以氢氧化铝作为佐剂的传统乙肝疫苗不能诱生Th1型免疫应答的缺陷，有助于控制HBV的持续性感染。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及汉逊酵母细胞增强HBsAg诱生Th1型免疫应答的新型策略，具体涉及一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗。

背景技术

研究显示，疫苗是控制乙肝传播最有效的手段之一。目前国内外使用的乙肝疫苗主要由乙肝表面抗原(HBsAg)和佐剂两部分组成，单独乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫原性较弱，佐剂用于增强抗原的免疫原性。目前被批准应用于临床的佐剂只有氢氧化铝(alum)，其主要增强Th2型免疫应答，以体液免疫为主。

对于HBV慢性感染者而言，实践显示，机体免疫反应不能有效清除病原体，一般认为机体对HBV产生了免疫耐受。打破慢性HBV感染的免疫耐受状态，有效地激活机体特异性体液免疫和细胞免疫是治疗慢性肝炎的关键之一。研究表明，Thl型免疫以较强的细胞免疫和适度的体液免疫反应为特点，在宿主抵抗病毒、胞内菌感染方面起重要作用。因此，研发一种安全的，能够诱生有效Thl型免疫应答的乙肝疫苗对控制乙肝具有重要的意义。

TOLL样受体(TLRs)属于病原相关分子模式识别受体(PRR)，PRR识别某些病原微生物或其产物所共有的高度保守的特定分子结构称为病原相关分子模式(PAMP)。TLRs与PAMP相互作用，不仅能激活先天性免疫应答，而且还能促进抗原提呈细胞(APCs)识别病原体，产生共刺激信号而启动获得性免疫反应，是联系先天免疫和获得性免疫的桥梁。现在已经有11种不同的TLRs配体被识别，许多种TLRs配体被用作疫苗佐剂的研究，如R.848和CpG分别是TLR7和TLR9的配体。

树突状细胞(DCs)表面表达多种TLRs，在识别病原微生物表面PAMP及基因如CpG-ODN、单链和双链RNA方面起重要作用。激活后的DCs转向成熟阶段，MHC I、II类分子及共刺激分子CD40，CD80，CD86表达增高，并分泌IL-12、IFN-γ等细胞因子，促进NK细胞、巨噬细胞吞噬杀伤病原体的活性，增强天然免疫应答。此时DCs抗原摄取能力大为降低，而抗原提呈能力增强，DCs迁移至次级淋巴组织，将抗原以MHC-抗原肽形式递呈给T、B淋巴细胞，激活特异性细胞和体液免疫反应。TLRs还可决定获得性免疫的类型，大多数TLRs配体能够诱生Thl型获得性免疫反应。

已有研究表明，酵母细胞壁有很多佐剂成分，其能够与DCs和巨噬细胞受体相互作用，这些受体包括TLR-2，TLR-4，TLR-6，CD14，Dectin-1，Dectin-2，DEC-205和甘露糖受体家族。酵母细胞被DCs吞噬以后，可以上调很多细胞表面分子的表达，包括粘附分子(ICAM-1，CD54)，协同刺激因子(B7-1，B7-2，CD80，CD86)，MHC I和MHC II类分子，并刺激细胞因子IL-12的分泌(Stubbs AC，Martin KS，Nat Med2001；7(5)：625-9.)。临床研究表明，酿酒酵母本身没有致病性，热灭活的重组酵母在机体中没有明显的副作用。利用热灭活的表达肿瘤相关抗原的酿酒酵母细胞免疫小鼠能够产生针对肿瘤抗原特异性的T细胞免疫应答和抗肿瘤活性(Bernstein MB，Vaccine2008；26(4)：509-21.Wansley EK，Chakraborty M，Clin Cancer Res 2008；14(13)：4316-25.)。肿瘤相关抗原可通过MHC I和MHC II类分子交叉提呈，从而产生针对肿瘤相关抗原特异性Th和CTL介导的免疫应答。然而，酿酒酵母表达体系中还存有不足之处，例如酿酒酵母产生的糖基化蛋白中，N-连接的聚糖可以产生过敏反应。此外，这种酵母所用碳源有限。汉逊酵母是一种甲基营养型酵母，在汉逊酵母表达的糖蛋白中，N-连接的聚糖不会产生过敏反应。汉逊酵母的碳源比较丰富，其蛋白的产量比传统的酿酒酵母高，并且汉逊酵母本身没有致病性，目前尚无应用汉逊酵母细胞增强HBsAg诱生Th1免疫应答的报道。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种能增强HBsAg诱生Th1免疫应答的新型乙肝疫苗及其实际用途。尤其涉及一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗。

本发明采用热灭活的表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞(Yeast-HBsAg)作为乙肝疫苗，其中HBsAg是疫苗的抗原部分，汉逊酵母细胞为疫苗的佐剂部分。并评价了Yeast-HBsAg在小鼠体内诱导的特异性的体液免疫(检测血清中抗HBsAg的抗体)和细胞免疫(HBsAg特异性的IFN-γ分泌能力和CTL活性)。结果表明，汉逊酵母细胞是一种更加安全有效的疫苗载体和/或佐剂，以汉逊酵母细胞为HBsAg的载体和/佐剂，能在小鼠体内产生HBsAg特异性T细胞免疫应答，从而诱生针对HBsAg的Th1免疫应答，可增强Yeast-HBsAg在体内产生的免疫反应。所述的疫苗经动物免疫实验证实：能够诱导免疫细胞向脾脏聚集，促进DCs的成熟，此外，该疫苗不但能够在小鼠体内诱生Th1方向的免疫应答，而且还能够增强Th2方向的免疫应答。包括总IgG，IgG1，IgG2a，特异性CTL活性，抗原特异的IFN-γ产生能力。本发明弥补了传统乙肝疫苗(以氢氧化铝作为佐剂)不能诱生Th1型免疫应答的缺陷，有助于控制HBV的持续性感染。

本发明的的目的通过下述技术方案实现：

1.表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞(Yeast-HBsAg)的诱导表达。

参照现有技术构建并诱导HBsAg的表达。首先，优化HBsAg密码子，采用汉逊酵母细胞的偏爱密码子。常规PCR方法扩增HBsAg片断，用搭桥PCR法合成优化后的基因序列。通过酶切连接，将目的基因亚克隆到多拷贝表达载体pDGXHP2.0中，形成一个4拷贝的重组表达质粒。将上述重组表达质粒及pDGXHP2.0质粒阴性对照以电转化方法转化汉逊酵母细胞ATCC26012(Ura3-)宿主菌，转化细胞涂于MDL平皿上，33℃孵箱培养1周，将转化菌落转接入无氨基酵母氮源液体培养基中传代培养。最后将PCR筛选为稳定整合有外源基因的重组菌株接入YPD培养基中33℃摇床培养，加入冻存液制成主代种子批于-70℃保存菌种。选择生长性能较稳定的重组菌株进行MDL培养，OD值长至15～18，将其离心转接到含有1％甲醇的MM培养基中经甲醇诱导72h，检测表达产物。同时制备热灭活Yeast-HBsAg，单独的汉逊酵母细胞(Yeast vector)，后者作为实验组Yeast-HBsAg的阴性对照。然后将上述2种细胞利用PBS洗3遍，放在-20℃冰箱中保存。

2.ELISA检测汉逊酵母细胞内HBsAg的表达。

采用HBsAg检测试剂盒测定Yeast-HBsAg内，以及分泌到细胞外的HBsAg水平。取Yeast vector，Yeast-HBsAg液，反复冻融，玻珠振荡，再超声裂解细胞。将Yeast-HBsAg破碎上清液及Yeast-HBsAg培养上清分别加入HBsAg检测板孔中，并设阳性和阴性对照孔，空白对照孔，Yeast vector组也作为阴性对照2复孔。然后加入酶结合物每孔50μl，空白对照孔不加，混匀，封板，置37℃孵育。弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置，甩干，反复5次，扣干。每孔加显色剂A，显色剂B，置37℃暗处10min。每孔加终止液。酶标仪上读取各OD 450值。

3.Western blot鉴定并定量汉逊酵母细胞表达的HBsAg。

将重组HBsAg(rHBsAg)，Yeast-HBsAg，Yeast vector经SDS处理，然后热变性，冷却，离心。取经热变性后的rHBsAg，Yeast-HBsAg，Yeast vector样品上样，其中，Yeast-HBsAg样品中含有表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞数为5×10⁷，Yeast vector样品中含有的汉逊酵母细胞数为5×10⁷。rHBsAg样品中含有rHBsAg 1μg，每种样品3复孔，在恒流下电泳后，以160mA的恒定电流转膜2h，将转移后的PVDF膜置封闭液中4℃封闭过夜。加入HBsAg多克隆抗体作为第一抗体，与PVDF膜37℃结合2h，然后加入HRP-羊抗鼠IgG第二抗体，37℃作用1h，加入发光液显色，直至出现清晰条带，去离子水终止。扫描X光片的目的条带，凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

4.小鼠免疫和免疫指标的检测

免疫动物(见Figure 1-1，Table1-1)：取6周龄BALB/c雌鼠，随机分为5组，每组10只小鼠，分别利用PBS，HBsAg，HBsAg+alum，Yeast vector，Yeast-HBsAg免疫小鼠。先用戊巴比妥钠麻醉后，用100u胰岛素注射器(购自BD公司)于双侧胫前肌进针，分别缓慢注入PBS 100μl，每侧50μl；2μg HBsAg溶于100μl PBS，每侧50μl；2μg HBsAg+100μg alum溶于100μl PBS，每侧50μl；2×10⁸Yeast vector溶于100μlPBS，每侧50μl；2×10⁸Yeast-HBsAg溶于100μl PBS，每侧50μl。共免疫3次，每4周免疫1次，每2周采血1次。第3次免疫1周后，收集脾脏细胞，检测脾脏细胞群变化及细胞免疫应答。

眼眶后静脉丛插管采血：常规小鼠静脉丛插管采血结束后，将输液针中的血液推至离心管中，室温放置，析出血清，离心，吸取血清到离心管内，-20℃保存。每隔2周采血1次。

ELISA方法测定抗-HBs IgG、IgG1和IgG2a：用含有10％小牛血清的0.01M pH 7.2的PBS按一定稀释度稀释免疫血清，加到已包被HBsAg的检测板孔中，封板，37℃水浴2小时，PBST洗涤5次。每孔加入PBS稀释的羊抗鼠IgG-HRP或IgG1-HRP或IgG2a-HRP。封板，37℃水浴孵育。PBST洗板5次。加显色剂A和显色剂B。37℃避光条件下显色，加终止液终止显色反应，酶标仪读取OD 450值。为检测抗-HBs IgG滴度，将各组组内同一时点小鼠血清等比例混合，作梯度稀释，用同上ELISA方法检测，结果根据如下标准判断：样品OD450/阴性对照孔OD450＞2.5判断为阳性，以出现阳性的最高血清稀释度为滴度。

制备小鼠脾脏淋巴细胞：第3次免疫后1周，每一免疫组取5只BALB/c鼠，无菌制成脾脏单细胞悬液，计数并调整细胞浓度至4×10⁶/ml。预准备一无菌平皿，加入Hank’s液后将一尼龙网浸泡其中。每组取BALB/c鼠5只，无菌取脾脏，置于尼龙网上，将脾细胞悬液用吸管移至离心管内，1500rpm离心。弃上清，往细胞沉淀中加ddH₂O，振荡，低渗裂解红细胞，立即加入Hank’s液，恢复溶液渗透压，离心，弃上清，用Hank’s液洗涤细胞，离心。弃上清，用无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞沉淀，离心。弃上清，细胞沉淀用完全RPMI 1640培养液悬浮并计数。调整细胞浓度至4×10⁶/ml。

细胞表面分子检测：第3次免疫后1周，收集脾脏细胞，脾脏细胞调整为2×10⁶cells/ml.PBS洗涤2遍，分别用anti-CD11c-FITC，anti-CD80-PE，anti-CD86-PE，anti-MHCII-PE为DCs染色；anti-CD3-PerCP，anti-CD4-FITC，anti-CD8-FITC为脾脏T细胞染色30分钟，然后用PBS洗涤2遍，2％多聚甲醛固定，应用FACS-callibar流式细胞仪(BD公司，美国)测定DCs(CD11c⁺)，以及表达CD80，CD86，MHC II的DCs；T细胞(CD3⁺)，以及CD4⁺T，CD8⁺T。用CELLQUEST软件进行分析。

细胞内细胞因子染色：将制得的4×10⁶/ml脾细胞悬液加至6孔细胞培养板，每孔加1ml。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20μg/ml，每孔加1ml。细胞终浓度为2×10⁶/ml，HBsAg终浓度为10μg/ml。同时以不加HBsAg刺激的细胞作为对照。恒温培养箱中(37℃，5％CO2)培养4小时后，加入Brefeldin A，继续培养24小时。收集细胞，1500rpm离心5分钟，PBS洗涤两遍，CD3，CD4，CD8细胞表面因子染色30分钟，4％对聚甲醛固定20分钟，将细胞悬浮于0.5％的皂角酸钠中破膜30分钟，anti-IFN-γ-APC染色，最后加入4％多聚甲醛固定细胞。应用FACS-cafibar流式细胞仪(BD公司，美国)测定IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的百分比，CELLQUEST软件分析结果。

检测细胞因子分泌：将制得的4×10⁶/ml脾细胞悬液加至96孔细胞培养板，每孔100μl。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20μg/ml，每孔加100μl。细胞终浓度为2×10⁶/ml，HBsAg终浓度为10μg/ml。恒温培养箱中(37℃，5％CO2)培养72小时。收集培养上清，ELISA方法测定上清中的IFN-γ，IL-4的浓度。采用晶美公司试剂盒测定。加入细胞因子标准品(作7个倍比稀释度)或待测样品，100μl每孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。洗板4次。加入100μl辣根过氧化物酶标记抗细胞因子抗体。封板，室温孵育60分钟。洗板4次，扣干。加入酶结合物工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30分钟，洗板4次。加显色液100μl/孔，避光37℃孵育15分钟。加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值。在对数坐标纸上以细胞因子标准品的OD 450值对细胞因子浓度(pg/ml)作图，画出标准曲线，根据待测样品的OD 450值，在标准曲线上查出对应的浓度值。

小鼠脾脏细胞增殖试验：分别取2×10⁵上述各组小鼠脾脏细胞接种于96孔板(100ul/孔)。在其他孔加入细胞标准品(作6个倍比稀释度)，各组内加入10μg/ml的重组HBsAg，每个样本设3复孔，同时设只加培养液的对照孔，ConA设为阳性对照。置37℃5％CO2培养箱中孵育72小时。各孔内加入CCK-8溶液20μl，继续培养4小时，在450nm波长下读取吸光值。在对数坐标纸上以细胞标准品的OD 450值对细胞数作图，画出标准曲线，根据待测样品的OD 450值，在标准曲线上查出对应的细胞数。

Calcein AM的CTL杀伤实验：将制备的4×10⁶/ml小鼠脾细胞加入六孔培养板中2ml/孔。以7000cGy的γ射线灭活对数生长期P815-s细胞，调整浓度为2×10⁵/ml制备成刺激细胞，在上六孔培养板中加入刺激细胞2ml/孔，培养3天后加入IL-2 25u/ml，37℃ 5％CO2共培养6天。收集六孔板中经诱导的效应细胞，用Ficoll分离液纯化，以含10％FCS的PF-RPMI1640(无酚红)调整浓度调至2.5×10⁶/ml，制备成效应细胞。获取对数生长期P815-s，P815细胞，调节细胞浓度至1×10⁶/ml，加入calcein AM终浓度为5uM，37℃水浴30mins，用Hank’s液洗二次，以含10％FCS的PF-RPMI1640在荧光显微镜下调节细胞浓度至5×10⁴/ml，制成标记好的靶细胞。在96孔培养板(圆底)中按E/T比例：50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各100μl/孔，每个比例3复孔。自发释放组3复孔由100ul靶细胞加100μl含10％FCS的PF-RPMI1640。完全释放组先加3复孔100ul靶细胞，96孔培养板37C 5％CO2孵育4小时后加入100ul lysis buffer(50mM硼酸钠，0.1％TritonX-100，PH 9.0)，使之完全裂解。然后板式离心机内离心3000rpm×5min，小心将上清移入新的孔中(切勿吸到细胞沉淀)，将96孔培养板放入荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。杀伤率％＝(试验组的FI-自发释放的FI)/(完全释放组的FI-自发释放的FI)×100％，特异性杀伤为P815-s的值减去相应的P815的值。

随机区组数据方差分析(F检验)；两样本均数差别比较t检验。

结果显示，汉逊酵母细胞在小鼠体内不但能够促进免疫细胞向脾脏聚集，而且能促进DCs的成熟。而alum不能促进DCs的成熟。表达乙肝表面抗原的全汉逊酵母细胞(Yeast-HBsAg)免疫小鼠能够产生较高水平的IgG，IgG1，IgG2a抗体。Yeast-HBsAg能够提高血清IgG2a/IgG1抗体的比值。HBsAg+alum免疫组虽然能够增强IgG，IgG1，IgG2a抗体的产生，但是不能提高血清IgG2a/IgG1的比值。Yeast-HBsAg能够刺激小鼠脾脏细胞分泌特异性IFN-γ和IL-4，而HBsAg+alum免疫组没有检测到IFN-γ和IL-4的分泌。Yeast-HBsAg能够刺激脾脏CD4⁺T及CD8⁺T细胞分泌IFN-γ，而HBsAg+alum免疫组没有检测到IFN-γ和IL-4的分泌。Yeast-HBsAg能够刺激脾脏细胞增殖，诱导HBsAg特异性的CTL活性。而HBsAg+alum免疫组没有检测到脾脏细胞增殖及特异性的CTL活性。

实验证实，汉逊酵母细胞能够诱导免疫细胞向脾脏聚集，促进DCs成熟。表达乙肝表面抗原的全汉逊酵母细胞不但能够在小鼠体内产生Th1方向的免疫反应，而且能增强Th2方向的免疫反应。Alum只能增强小鼠Th2方向的免疫应答，不能诱生Th1方向的免疫应答。汉逊酵母细胞的佐剂效果优于alum。因此，表达乙肝表面抗原的全汉逊酵母细胞可作为一种新型乙肝疫苗，在控制HBV感染中起着重要的作用。

附图说明

图1所用动物免疫实验方案。

图2Western blot鉴定汉逊酵母细胞中HBsAg的表达，

其中，从左到右依次为样品Yeast vector、Yeast-HBsAg、HBsAg，结果表明，在Yeast-HBsAg中有HBsAg的表达，其中，Yeast-HBsAg样品中含有表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞数为5×10⁷，Yeast vector样品中含有的汉逊酵母细胞数为5×10⁷，rHBsAg样品中含有rHBsAg 1μg。

图3汉逊酵母细胞促进免疫细胞向脾脏聚集，

其中，雌性BALB/c共免疫3次，每4周免疫1次，第3次免疫后1周，处死小鼠，取出脾脏，研磨并裂解红细胞，脾脏细胞计数，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫的小鼠相比，利用Yeast vector及Yeast-HBsAg免疫过的小鼠脾脏细胞数目有明显的增加(^*P＜0.01)。

图4汉逊酵母细胞对小鼠脾脏DCs的影响，

其中A.汉逊酵母细胞促进DCs向脾脏聚集。雌性BALB/c小鼠免疫3次，每4周免疫1次，第3次免疫后1周，处死小鼠，取出脾脏，研磨并裂解红细胞，然后脾脏细胞计数，APC-anti-CD11c小鼠脾脏细胞染色，流式细胞仪检测DCs在脾脏细胞中的比例，结果表明，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫的小鼠相比，利用Yeast vector及Yeast-HBsAg免疫过的小鼠脾脏数目有明显的增加(^*P＜0.01)；

B.汉逊酵母细胞促进DCs的成熟，利用CD11c分别和CD80，CD86，MHC class II共染小鼠脾脏细胞，然后流式检测，CELLQUEST软件分析表达CD80，CD86，MHC class II的DCs比例，此实验重复3次以上，结果相近；

C.汉逊酵母细胞促进成熟DCs向脾脏聚集，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫的小鼠相比，Yeast vector及Yeast-HBsAg免疫的小鼠，其脾脏表达CD80，CD86，MHC classII的DCs绝对数目有明显的增加(^*P＜0.01)。

图5.汉逊酵母细胞促进T细胞向脾脏聚集，

雌性BALB/c小鼠免疫3次，每4周免疫1次，第3次免疫后1周，处死小鼠，取出脾脏，研磨并裂解红细胞，脾脏细胞计数，小鼠脾脏细胞PerCP-anti-CD3染色，流式细胞仪检测T细胞在脾脏细胞中的比例，然后计算脾脏T细胞的数量，结果表明，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫的小鼠相比，Yeast-HBsAg免疫过的小鼠脾脏T细胞数目有明显的增加(^*P＜0.01)。

图6.Yeast-HBsAg在小鼠体内产生的抗体水平，

A.Yeast-HBsAg增强小鼠体内IgG抗体的产生，初次免疫2周后，开始采集小鼠的免疫血清，ELISA检测血清中2-12周的抗体水平，PBS或Yeast vector免疫的小鼠，没有抗体的产生(结果没有显示)；

B.Yeast-HBsA增强小鼠体内IgG1和IgG2a抗体的产生，1∶5×10³稀释初次免疫第8周的小鼠免疫血清，ELISA法检测小鼠免疫血清中IgG1和IgG2a的抗体水平，图中所示为抗体的OD值，与HBsAg，HBsAg+alum组相比，Yeast-HBsAg免疫的小鼠血清中IgG1和IgG2a的抗体水平有明显的升高(^**P＜0.01)；

C.Yeast-HBsAg能够提高血清中IgG2a/IgG1的比值，与HBsAg，HBsAg+alum组相比，Yeast-HBsAg免疫的小鼠血清中IgG2a/IgG1的比值有明显的升高(^*P＜0.05)，

图7.Yeast-HBsAg刺激小鼠脾脏细胞HBsAg特异性细胞因子的分泌，

初次免疫后9周，取小鼠脾脏细胞，HBsAg刺激3天后，收集细胞上清，ELISA检测IFN-γ和IL-4水平；

A.小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ的水平。Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏细胞产生较高水平的IFN-γ；

B.小鼠脾脏细胞分泌IL-4的水平。Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏细胞产生较高水平的IL-4。

图8.Yeast-HBsAg增强小鼠脾脏T细胞产生IFN-γ，

第3次免疫后1周，取小鼠脾脏细胞，HBsAg刺激，anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8脾脏细胞表面染色，anti-IFN-γ细胞内因子染色，通过流式检测CD4⁺T和CD8⁺T细胞产生HBsAg特异性IFN-γ的水平，此试验重复3次以上，所得结果相似。

图9.Yeast-HBsAg刺激脾脏细胞特异性增殖，

其中，第3次免疫后1周，处死小鼠，收集脾脏细胞。HBsAg体外刺激3天后，加入Cell Counting Kit-8溶液，检测小鼠脾脏细胞的增殖。与其他各组相比，Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾脏细胞发生了明显的增殖(^*P＜0.01)。

图10.Yeast-HBsAg在小鼠体内诱导HBsAg特异性CTL活性，

第3次免疫后1周，处死小鼠，取其脾脏细胞，Calcein-AM释放法检测脾脏细胞CTL活性，图中显示为在不同的效应细胞和靶细胞比例的情况下，脾脏细胞杀伤率的平均值。

具体实施方式

实施例1

表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞的诱导表达及检测鉴定：

参照现有技术构建并诱导HBsAg的表达。首先，优化HBsAg密码子，采用汉逊酵母细胞的偏爱密码子。常规PCR方法扩增HBsAg片断，上游引物5’-GATCTTTAAA AACAA AATGGAGAACATCACCTCTG-3，下游引物：5’-CGGAATTCCTATTAGATGTACACCC-3’。用搭桥PCR法合成优化后的基因序列。通过酶切连接，将目的基因亚克隆到多拷贝表达载体pDGXHP2.0中，形成一个4拷贝的重组表达质粒。将上述重组表达质粒及pDGXHP2.0质粒阴性对照以电转化方法转化汉逊酵母细胞ATCC26012(Ura3-)宿主菌，转化细胞涂于MDL平皿上，33℃孵箱培养1周，将长出的转化菌落转接入10ml MDL(0.14％无氨基酵母氮源、0.5％硫酸铵、2％葡萄糖)液体培养基中33℃摇床传代培养。传代过程中运用PCR方法筛选重组菌株。最后将PCR筛选为稳定整合有外源基因的重组菌株接入YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)培养基中33℃摇床培养，加入冻存液制成主代种子批于-70℃保存菌种。选择生长性能较稳定的重组菌株进行MDL培养，33℃摇床培养大约24h，OD值长至15～18，将其离心转接到含有1％甲醇的MM(1％甲醇、0.67％无氨基酵母氮源、0.5％硫酸铵)培养基中经甲醇诱导72h，检测表达产物。同时制备热灭活Yeast-HBsAg，单独的汉逊酵母细胞(Yeast vector)，后者作为实验组Yeast-HBsAg的阴性对照。然后将上述2种细胞利用PBS洗3遍，放在-20℃冰箱中保存。

ELISA检测汉逊酵母细胞内HBsAg的表达

采用HBsAg检测试剂盒测定Yeast-HBsAg内，以及分泌到细胞外的HBsAg水平。取Yeast vector，Yeast-HBsAg液各500μl，反复冻融，玻珠振荡，再超声裂解细胞。将Yeast-HBsAg破碎上清液及Yeast-HBsAg培养上清分别加入HBsAg检测板孔中，每孔加待测样品50μl，并设阳性和阴性对照各2孔，空白对照1孔，Yeast vector组也作为阴性对照2复孔。然后加入酶结合物每孔50μl，空白对照孔不加，充分混匀，封板，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置20s，甩干，反复5次，扣干。每孔加显色剂A，显色剂B各50μl，置37℃暗处10min。每孔加终止液50μl。酶标仪上读取各OD 450值。

Western blot鉴定并定量汉逊酵母细胞表达的HBsAg

将重组HBsAg(rHBsAg)，Yeast-HBsAg，Yeast vector经SDS处理，然后热变性10分钟，冰上冷却5分钟，1500rpm离心1分钟。取经热变性后的rHBsAg，Yeast-HBsAg，Yeastvector样品各12μl上样，其中，Yeast-HBsAg样品中含有表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞数为5×10⁷，Yeast vector样品中含有的汉逊酵母细胞数为5×10⁷。rHBsAg样品中含有rHBsAg 1μg，每种样品3复孔，在恒流下电泳。电泳之后，以160mA的恒定电流转膜2h，将转移后的PVDF膜置封闭液中4℃封闭过夜。加入HBsAg多克隆抗体(1∶2000)作为第一抗体，与PVDF膜37℃结合2h，然后加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶1000)第二抗体，37℃作用1h，加入发光液显色，直至出现清晰条带，去离子水终止。扫描X光片的目的条带，凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

结果显示，Yeast-HBsAg破碎上清样品OD450/阴性对照孔OD450＝18.34＞2.5，说明汉逊酵母细胞内有较多的HBsAg的表达。而Yeast-HBsAg培养上清中OD450/阴性对照孔0D450＝3.34＞2.5，说明有少量的HBsAg分泌到细胞外。Western blot鉴定并定量汉逊酵母细胞HBsAg的表达，结果表明，Yeast-HBsAg样品与阳性对照rHBsAg均在24KD左右出现HBsAg特异性条带。而样品Yeast vector中没有出现HBsAg特异性条带(见图1-1)，进一步确定Yeast-HBsAg中有HBsAg的表达。在Yeast-HBsAg组中，出现了两个HBsAg特异性目的条带，是由HBsAg糖基化修饰不同引起的。Western blot方法检测汉逊酵母细胞中HBsAg的表达水平为每1×10⁸个Yeast-HBsAg中含有0.75-1.25μgHBsAg。

小鼠免疫和免疫指标的检测

免疫动物(见Figure 1-1，Table1-1)：取6周龄BALB/c雌鼠，随机分为5组，每组10只小鼠，分别利用PBS，HBsAg，HBsAg+alum，Yeast vector，Yeast-HBsAg免疫小鼠。先用戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉后，用100u胰岛素注射器(购自BD公司)于双侧胫前肌进针，分别缓慢注入PBS 100μl，每侧50μl；2μg HBsAg溶于100μl PBS，每侧50μl；2μg HBsAg+100μg alum溶于100μl PBS，每侧50μl；2×10⁸Yeast vector溶于100μl PBS，每侧50μl；2×10⁸Yeast-HBsAg溶于100μl PBS，每侧50μl。共免疫3次，每4周免疫1次，每2周采血1次。第3次免疫1周后，收集脾脏细胞，检测脾脏细胞群变化及细胞免疫应答。

眼眶后静脉丛插管采血：常规小鼠静脉丛插管采血结束后，将输液针中的血液推至1.5ml离心管中，室温放置3小时，析出血清，5000g离心20min，吸取血清到0.5ml的离心管内，-20℃保存。每隔2周采血1次，每次采血150μl-200μl。

ELISA方法测定抗-HBs IgG、IgG1和IgG2a：用含有10％小牛血清的0.01M pH 7.2的PBS按一定稀释度稀释免疫血清，加到已包被HBsAg的检测板孔中，100μl/孔。封板，放湿盒于37℃水浴2小时，0.01M pH7.2的PBST洗涤5次。每孔加入100μl用PBS1∶2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP或IgG1-HRP或IgG2a-HRP。封板，放湿盒于37℃水浴孵育1小时。PBST洗板5次。加50μl显色剂A和50μl显色剂B。37℃避光条件下显色15min。加50μl终止液终止显色反应，酶标仪读取OD 450值。为检测抗-HBs IgG滴度，将各组组内同一时点小鼠血清等比例混合，作梯度稀释，用同上ELISA方法检测，结果根据如下标准判断：样品OD450/阴性对照孔OD450＞2.5判断为阳性，以出现阳性的最高血清稀释度为滴度。

制备小鼠脾脏淋巴细胞：第3次免疫后1周，每一免疫组取5只BALB/c鼠，无菌制成脾脏单细胞悬液，计数并调整细胞浓度至4×10⁶/ml。预准备一无菌平皿，加入5mlHank’s液后将一尼龙网浸泡其中。每组取BALB/c鼠5只，无菌取脾脏，置于尼龙网上，将脾细胞悬液用吸管移至10ml离心管内，1500rpm离心5min。弃上清，往细胞沉淀中加1ml ddH₂O，振荡30s，低渗裂解红细胞，立即加入Hank’s液至10ml，恢复溶液渗透压，1500rpm离心5min。弃上清，用5ml Hank’s液洗涤细胞，1500rpm离心5min。弃上清，用5ml无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞沉淀，1500rpm离心5min。弃上清，细胞沉淀用完全RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素，0.5mmol/L二巯基乙醇，10mmol/L的HEPES)悬浮并计数。调整细胞浓度至4×10⁶/ml。

细胞表面分子检测：第3次免疫后1周，收集脾脏细胞，脾脏细胞调整为2×10⁶cells/ml.PBS洗涤2遍，分别用anti-CD11c-FITC，anti-CD80-PE，anti-CD86-PE，anti-MHCII-PE为DCs染色；anti-CD3-PerCP，anti-CD4-FITC，anti-CD8-FITC为脾脏T细胞染色30分钟，然后用PBS洗涤2遍，2％多聚甲醛固定，应用FACS-callibar流式细胞仪(BD公司，美国)测定DCs(CD11c⁺)，以及表达CD80，CD86，MHC II的DCs；T细胞(CD3⁺)，以及CD4⁺T，CD8⁺T。用CELLQUEST软件进行分析。

细胞内细胞因子染色：将制得的4×10⁶/ml脾细胞悬液加至6孔细胞培养板，每孔加1ml。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20μg/ml，每孔加1ml。细胞终浓度为2×10⁶/ml，HBsAg终浓度为10μg/ml。同时以不加HBsAg刺激的细胞作为对照。恒温培养箱中(37℃，5％CO2)培养4小时后，加入Brefeldin A，继续培养24小时。收集细胞，1500rpm离心5分钟，PBS洗涤两遍，CD3，CD4，CD8细胞表面因子染色30分钟，4％对聚甲醛固定20分钟，将细胞悬浮于0.5％的皂角酸钠中破膜30分钟，anti-IFN-γ-APC染色，最后加入4％多聚甲醛固定细胞。应用FACS-cafibar流式细胞仪(BD公司，美国)测定IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的百分比，CELLQUEST软件分析结果。

检测细胞因子分泌：将制得的4×10⁶/ml脾细胞悬液加至96孔细胞培养板，每孔100μl。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20μg/ml，每孔加100μl。细胞终浓度为2×10⁶/ml，HBsAg终浓度为10μg/ml。恒温培养箱中(37℃，5％CO2)培养72小时。收集培养上清，ELISA方法测定上清中的IFN-γ，IL-4的浓度。采用晶美公司试剂盒测定。加入细胞因子标准品(作7个倍比稀释度)或待测样品，100μl每孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。洗板4次。加入100μl辣根过氧化物酶标记抗细胞因子抗体。封板，室温孵育60分钟。洗板4次，扣干。加入酶结合物工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30分钟，洗板4次。加显色液100μl/孔，避光37℃孵育15分钟。加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值。在对数坐标纸上以细胞因子标准品的OD 450值对细胞因子浓度(pg/ml)作图，画出标准曲线，根据待测样品的OD 450值，在标准曲线上查出对应的浓度值。

小鼠脾脏细胞增殖试验：分别取2×10⁵上述各组小鼠脾脏细胞接种于96孔板(100ul/孔)。在其他孔加入细胞标准品(作6个倍比稀释度)，各组内加入10μg/ml的重组HBsAg，每个样本设3复孔，同时设只加培养液的对照孔，ConA设为阳性对照。置37℃5％CO2培养箱中孵育72小时。各孔内加入CCK-8溶液20μl，继续培养4小时，在450nm波长下读取吸光值。在对数坐标纸上以细胞标准品的OD 450值对细胞数作图，画出标准曲线，根据待测样品的OD 450值，在标准曲线上查出对应的细胞数。

Calcein AM的CTL杀伤实验：将制备的4×10⁶/ml小鼠脾细胞加入六孔培养板中2ml/孔。以7000cGy的γ射线灭活对数生长期P815-s细胞，调整浓度为2×10⁵/ml制备成刺激细胞，在上六孔培养板中加入刺激细胞2ml/孔，培养3天后加入IL-225u/ml，37℃5％CO2共培养6天。收集六孔板中经诱导的效应细胞，用Ficoll分离液纯化，以含10％FCS的PF-RPMI1640(无酚红)调整浓度调至2.5×10⁶/ml，制备成效应细胞。获取对数生长期P815-s，P815细胞，调节细胞浓度至1×10⁶/ml，加入calcein AM终浓度为5uM，37℃水浴30mins，用Hank’s液洗二次，以含10％FCS的PF-RPMI1640在荧光显微镜下调节细胞浓度至5×10⁴/ml，制成标记好的靶细胞。在96孔培养板(圆底)中按E/T比例：50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各100μl/孔，每个比例3复孔。自发释放组3复孔由100ul靶细胞加100μl含10％FCS的PF-RPMI1640。完全释放组先加3复孔100ul靶细胞，96孔培养板37℃5％CO2孵育4小时后加入100ul lysis buffer(50mM硼酸钠，0.1％TritonX-100，PH 9.0)，使之完全裂解。然后板式离心机内离心3000rpm×5min，小心将上清移入新的孔中(切勿吸到细胞沉淀)，将96孔培养板放入荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。杀伤率％＝(试验组的FI-自发释放的FI)/(完全释放组的FI-自发释放的FI)×100％，特异性杀伤为P815-s的值减去相应的P815的值。

随机区组数据方差分析(F检验)；两样本均数差别比较t检验。

结果显示，汉逊酵母细胞促进免疫细胞向脾脏聚集：如图1-2所示，Yeast-HBsAg，Yeast vector，HBsAg+alum免疫的小鼠，全脾脏细胞均有明显的增多。Yeast-HBsAg免疫小鼠脾脏细胞数是HBsAg单独免疫组的5.6倍，HBsAg+alum免疫小鼠脾脏细胞数是HBsAg单独免疫组的2.2倍，而HBsAg单独免疫对小鼠全脾脏细胞没有显著的影响。Yeastvector免疫组和Yeast-HBsAg免疫组的小鼠脾脏细胞数没有显著差异，说明脾脏细胞增多是汉逊酵母细胞本身的作用。

汉逊酵母细胞对小鼠脾脏DCs的影响：DCs是最重要的抗原提呈细胞，其在机体免疫应答中起着重要的作用。因此，本试验检测汉逊酵母细胞对脾脏DCs数目的影响。如图1-3A所示，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏DCs数量是HBsAg单独免疫组的13.6倍。而单独HBsAg免疫小鼠不能增加脾脏DCs数量。

成熟DCs在活化T细胞中起着非常重要的作用。因此，本发明进一步检测汉逊酵母细胞对脾脏DCs成熟的影响。CD80，CD86，MHC class II为成熟DCs细胞的表面标志物，而CD11c为DCs的表面标志物。因此，用上述抗体进行脾脏细胞染色，然后流式检测，CELLQUEST软件分析结果。如图1-3B所示，Yeast-HBsAg能够提高小鼠脾脏细胞中表达CD80，CD86，MHC class II的DCs比例，而HBsAg，HBsAg+alum对小鼠脾脏DCs的比例没有显著的影响。进一步研究汉逊酵母细胞对脾脏成熟DCs细胞数量的影响，如图1-3C所示，脾脏成熟DCs的绝对数量有明显的升高。这些结果表明，汉逊酵母细胞能够促进DCs向脾脏聚集及DCs的成熟，而alum作为佐剂则不能促进DCs的成熟。Yeast vector和Yeast-HBsAg对小鼠脾脏DCs的影响没有显著性差异，表明促进DCs向小鼠脾脏聚集及DCs的成熟是汉逊酵母本身的作用。

汉逊酵母对小鼠脾脏T细胞的影响：T细胞在清除病毒感染中起着重要的作用，CD3⁺为T细胞的表面标志，CD4⁺T及CD8⁺T为T细胞的两个亚群。本试验研究Yeast-HBsAg对脾脏T细胞及其亚群的影响。如表1-1所示，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫组相比，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏T细胞在全脾脏中的比例下降。进一步分析T细胞亚群表明，Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾脏CD4⁺T在脾脏T细胞中的比例有显著的升高，而CD8⁺T的比例有明显的下降，CD4⁺/CD8⁺的比值升高。而HBsAg+alum对脾脏T细胞的比例没有显著的影响。进一步研究脾脏中T细胞的绝对数量表明，虽然Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏T细胞的比例下降，但脾脏T细胞的绝对数量有明显的升高。如图1-4所示，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏T细胞是HBsAg单独免疫组的4.4倍，HBsAg+alum组小鼠脾脏T细胞数量也有明显的增加。Yeast vector和Yeast-HBsAg对小鼠脾脏T细胞的影响没有显著性差异，说明汉逊酵母本身能够促进T细胞向脾脏聚集，与汉逊酵母细胞内HBsAg无关。与alum相比，汉逊酵母细胞能诱导更多的T细胞向脾脏聚集。

表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞增加HBsAg特异性抗体的产生：BALB/c鼠于初次免疫(第0周)后第4，8周加强免疫，自0周开始每2周分离血清。ELISA法检测HBsAg特异性的IgG水平及IgG亚类水平。结果如图1-5所示。

就免疫效率来看，与PBS，Yeast vector免疫小鼠未能诱生抗体(结果未显示)相比，HBsAg，HBsAg+alum，yeast-HBsAg均能够有效诱生抗体应答。在第2次免疫后2周，HBsAg，HBsAg+alum，Yeast-HBsAg免疫的小鼠针对HBsAg的抗体水平均有明显的增强：HBsAg免疫组的抗体滴度为1∶15000，HBsAg+alum免疫组的抗体滴度为1∶180000，Yeast-HBsAg组的抗体滴度为1∶750000。初次免疫6周后，Yeast-HBsAg免疫小鼠产生的抗体是HBsAg单独免疫小鼠产生抗体的50倍左右，alum作为佐剂产生的抗体是HBsAg单独免疫组的12倍左右。初次免疫12周后，Yeast-HBsAg免疫组的抗体仍然维持较高的水平。利用alum作为佐剂和Yeast-HBsAg免疫小鼠均能够增强HBsAg的抗体水平，但是Yeast-HBsAg免疫小鼠体内产生的抗体水平明显高于HBsAg+alum免疫组，说明Yeast-HBsAg增强Th2方向免疫应答的能力强于alum佐剂。

就免疫应答类型来看，与单独HBsAg，HBsAg+alum免疫小鼠相比，Yeast-HBsAg既能够增强IgG 2a抗体水平，也能够增强IgG1水平。如图所示，Yeast-HBsAg免疫小鼠产生的IgG 2a抗体水平比alum作为佐剂，单独HBsAg免疫产生的IgG 2a高(OD值分别HBsAg组0.082±0.02，HBsAg+alum组0.173±0.029，Yeast-HBsAg组0.802±0.064)。并且，Yeast-HBsAg免疫小鼠产生的IgG1抗体水平高于alum作为佐剂，HBsAg单独免疫组(OD值分别HBsAg组0.409±0.104，HBsAg+alum组0.918±0.105，Yeast-HBsAg组1.538±0.149)。

与HBsAg，HBsAg+alum免疫小鼠相比，Yeast-HBsAg能够提高IgG2a/IgG1的比值(分别为HBsAg组0.195，alum组0.188，Yeast-HBsAg组0.522)，而alum不能提高IgG2a/IgG1的比值。表明Yeast-HBsAg在一定程度上使T细胞免疫反应偏向于Th1方向。

表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞刺激Th1和Th2类细胞因子的释放：为验证Yeast-HBsAg增强细胞免疫和体液免疫的能力，进一步分析了Yeast-HBsAg刺激抗原特异性的IFN-γ和IL-4释放能力。结果如图1-6所示。

小鼠第3次免疫后1周，ELISA方法检测HBsAg刺激脾脏细胞释放的IFN-γ和IL-4水平。HBsAg、HBsAg+alum、Yeast vector免疫小鼠检测不到IFN-γ或IL-4的释放，而Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾脏能释放较多的HBsAg特异性IFN-γ(575.8pg/ml)和IL-4(72.5pg/ml)。此结果表明，Yeast-HBsAg既能够诱导Th1方向的免疫反应，也能增强Th2方向的免疫反应。

表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞增强小鼠脾脏CD4⁺T和CD8⁺T细胞产生IFN-γ：CD4⁺T和CD8⁺T细胞在控制病毒感染中均起重要的作用，因此，检测CD4⁺T和CD8⁺T产生IFN-γ的水平。如图1-7所示，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏CD4⁺T或CD8⁺T细胞均有IFN-γ的产生，而HBsAg组，HBsAg+alum组，Yeast vector组小鼠的CD4⁺T和CD8⁺T细胞没有产生IFN-γ。这些结果表明，Yeast-HBsAg既能够刺激CD4⁺T也能够刺激CD8⁺T细胞产生HBsAg特异性的IFN-γ。

表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞刺激脾脏细胞增殖：获得性免疫系统的细胞包括T，B细胞两种，与天然免疫系统的细胞不同，其特点是抗原特异性，需经过克隆的选择和增殖过程，有记忆性。本试验研究汉逊酵母细胞能否增强HBsAg特异性免疫细胞的活化。取各组小鼠的脾脏细胞，HBsAg刺激3天后，检测小鼠脾脏细胞的增殖情况。如图1-8所示，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏细胞发生明显的增殖，HBsAg刺激3天后，其脾脏细胞增加了7.5倍左右。而HBsAg，HBsAg+alum，Yeast vector免疫小鼠的脾脏没有发生明显的增殖。结果表明，汉逊酵母细胞能够促进针对HBsAg免疫细胞的活化。

表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞在小鼠体内诱生CTL活性：CTL在清除乙肝病毒中起着重要的作用，它可以通过促进感染细胞凋亡来清除乙肝感染的肝细胞。在本实验中，利用Calcein AM释放法检测小鼠脾脏细胞的CTL活性。结果如图1-9所示，HBsAg，HBsAg+alum免疫小鼠不能诱发明显的HBsAg特异性CTL活性(＜5％lysis)，而Yeast-HBsAg则可诱发较高水平的CTL应答(5.4％-24.3％lysis)。在效靶比(E/T)为50∶1，25∶1，12.5∶1，6.25∶1时，凋亡细胞的比例分别为24.35％，19.30％，7.46％，5.40％，随着效应细胞和靶细胞比例的增加，HBsAg特异性杀伤率也增高。而Yeast vector对照组不能产生CTL反应，说明Yeast-HBsAg引起的CTL为HBsAg特异性。效靶比(E/T)为50/1时，各组的特异性杀伤率为：Yeast-HBsAg组24.35％，HBsAg组，HBsAg+alum组，Yeast vector组均＜5％。此结果说明，表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞能够在小鼠体内诱生HBsAg特异性CTL活性。

表1-1是免疫分组与免疫剂量。

表1-2.是Yeast-HBsAg对T(CD3⁺)细胞及其亚群CD4⁺T及CD8⁺T的影响(％)。

表1-1

Mice were immunized intramuscularly in the left tibialis anterior muscle 3 times with thesame regimen at 4-week intervals.

^*There were 10mice in each group.

^**The dose shown above is used to immunize one mouse at one time.

表1-2

其中，各组小鼠，共免疫3次，每4周免疫1次。第3次免疫后1周，取小鼠脾脏细胞，裂解红细胞，然后分别利用CD3⁺，CD3⁺CD4⁺，CD3⁺CD8⁺为脾脏细胞染色，流式细胞仪检测T细胞在脾脏细胞中的比例，以及CD4⁺T及CD8⁺T在小鼠脾脏T细胞中的比例，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫组相比，Yeast-HBsAg组中T细胞的比例有显著的下降(^*P＜0.01)，CD8⁺T细胞的比例也有显著地下降(^**P＜0.05)，而CD4⁺T细胞的比例有明显的升高(^*P＜0.01)，Yeast vector和Yeast-HBsAg对小鼠脾脏T细胞的影响没有显著性差异。