用于观测流体中的颗粒的微反应器

摘要

用于观测流体中的颗粒的微反应器，特别用于观测流体中的小颗粒、细胞、细菌、病毒或蛋白质分子。微反应器具有形成在两层(102、104)之间的第一通道(106)以容纳流体，第一通道包括入口(112)和出口(114)，这两层隔开第一距离。同样的第二通道(108)邻近第一通道设置，第二通道具有入口(118)和出口(116)。第一通道和第二通道通过间隙连接，在间隙处至少一个层具有窗口(120)，该窗口对于检查方法为可透过的，在窗口处这两层隔开非常小的距离例如1微米或更小。

说明书

技术领域

本发明涉及用于观测流体中的颗粒或其某些部分的微反应器，微反应器的某些部分对于检查方法具有可透过性，微反应器包括形成在两层之间的第一通道以容纳流体，第一通道包括入口和出口，这两层在第一通道处隔开第一距离。

本发明还涉及使用所述微反应器的方法。

背景技术

这种微反应器见于欧洲申请No.EP05787328。

该专利申请公开了用于透射电子显微镜(TEM)的微反应器。该微反应器包括两个所谓的盖层，这两个盖层由间隔件相互隔开小的距离。这两个盖层因此限定通道，该通道设有入口和出口。由此可以在通道中引入流体。每个盖层具有多个凹槽，这些凹槽足够薄以对于TEM中使用的电子来说是可透过的。这些凹槽设置成，使得垂直撞击盖层并穿过一个凹槽的电子束也通过另一个盖层中的相应凹槽。因此，可以通过TEM来观测在两个相应凹槽之间的流体和流体内的任何颗粒和/或细胞。

注意，在本发明中，短语“颗粒”包括：催化剂颗粒；地质颗粒；包含生物细胞、细菌和病毒以及蛋白质分子、DNA等的有机颗粒；以及所述颗粒的某些部分例如细胞器。

已知的微反应器的缺点是电子可透过的所有凹槽的总表面积只是盖层表面积的一部分。因此，通道的主体部分对于TEM来说是不可见的。颗粒或细胞甚至还可以从入口到达出口而不在凹槽之间经过，因此TEM没有机会观测它们。

另一个相关问题是无法定位微反应器内的颗粒或细胞。

这使得操作已知的微反应器变成耗时的工作，不会保证特定的颗粒或细胞被识别或甚至可见。

发明内容

本发明旨在提供一种微反应器，颗粒或样品能够被定位在其中。

为此，根据本发明的微反应器的特征在于，微反应器还包括：

与第一通道邻近的第二通道，第二通道包括出口，这两层在第二通道处隔开第二距离，

连接第一通道和第二通道的间隙，

在间隙处至少一个层具有窗口，该窗口对于检查方法具有可透过性，

在窗口处这两层隔开第三距离，第三距离小于第一距离并且小于第二距离；

这些层中的至少一个在间隙处对观测方法具有可透过性，以及

第三距离等于或小于检查方法的操作范围。

通过使第二通道具有出口并且使间隙连接两个通道，流体中的颗粒和/或细胞能够被定位在间隙中，例如通过在通道之间的受控的压力差。因此，颗粒或细胞能够被定位在间隙中，更具体地定位于窗口(其可以覆盖整个间隙或只是间隙的一部分)以在此被检查。

在间隙处隔开两层的第三距离被限制为检查方法的操作范围。

当使用光学显微镜时，第三距离可以等于或小于聚焦深度。当使用电子显微镜时，第三距离可以等于或小于电子的穿透范围。

注意，窗口材料、流体类型、颗粒和细胞都会影响最大有效第三距离。

也可以想到，用例如中子、可见光带之外的电磁辐射包括例如X射线来进行检查。

在根据本发明的微反应器的一个实施例中，检查方法包括用显微镜检查，并且检查方法的操作范围为显微镜的聚焦深度。

在此，微反应器与光学显微镜结合使用，间隙的高度即第三距离等于或小于显微镜的聚焦深度。因此，间隙中以及显微镜视野中的所有颗粒或细胞都在焦点上。

注意，在本发明中，光学显微镜包括但不限于相衬显微镜(phasecontrast microscopy)、激光共焦显微镜以及荧光显微镜，并且光学显微镜包括用于这些显微镜类型的光学显微镜。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，检查方法包括通过用X射线或粒子束辐照微反应器来检查，并且检查方法的操作范围为辐照微反应器的X射线或粒子的穿透深度。

当用电子显微镜例如透射电子显微镜(TEM)、扫描透射电子显微镜(STEM)或扫描电子显微镜(SEM)来检查时，微反应器被电子所辐照。电子能量可以变化。SEM通常装备成操作具有50KeV之下能量的电子，而STEM和TEM通常装备成操作具有30KeV之上能量的电子，通常高达300或400KeV。注意，也可以使用其它粒子例如高能量光子来辐照微反应器。

辐照微反应器并且穿透入间隙的粒子会引起二次辐射从间隙中存在的流体、颗粒和细胞中发生。该二次辐射包括回射电子、X射线、散射电子和光子(由于例如荧光性)。部分这种二次辐射会离开间隙以被检测器所检测。一些电子也可以通过间隙，或衍射或实际上不受阻碍，以被检测器所检测。

这样，可以获得间隙中的流体、颗粒和细胞的组合信息。

注意，为了发生二次辐射，电子应该至少进入间隙，即：应该至少穿过窗口材料。电子随后进入流体、颗粒和/或细胞，并在此引起二次辐射。该辐射随后应该通过其中一个层离开间隙以被检测。

类似地，当用柔性X射线例如具有600eV之下能量的X射线来辐照微反应器时，这些X射线的穿透被局限于几微米。作为示例，30％的500eV光子被传送通过10微米的水。使用具有能量在284eV的碳K-边缘(carbon K-edge)和543eV的氧K-边缘(oxygen K-edge)之间的这种低能量X射线量子产生的图像具有在富碳结构和水之间的较高的对比度，其例如描述在“Table-top water window transmission x-raymicroscope：review of the key issue，and conceptual design ofan instrument for biology”，J.F.Adam et al.，Review ofScientific Instruments 76，091301(2005)。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，检查方法包括检测来自中子、二次电子、回射电子(back-scattered electrons)和发射电子的粒子；和/或来自红外、可视光、UV或X射线光子的光子。

注意，光子可以是撞击光子(包括荧光)的直接结果，但也可以源于例如撞击电子。使用电子来激励荧光熟知于在生物应用中成像所谓的标识。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，邻接间隙的至少一个层是可透光的。

当至少一个层可透光时，可以用反射光来观测间隙。另一层也可以是透光的，或者可以例如是反光的。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，邻接间隙的至少一个层是可透过电子的。

当至少一个层可透过电子时，可以在间隙外侧检测源于电子撞击流体通过可透过层的回射电子、X射线、发光等。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，微反应器的至少一部分由玻璃形成。

当微反应器与光学显微镜结合使用时，微反应器优选由玻璃制成。玻璃具有良好的光学性质，而其通过例如平版印刷工艺、通过喷砂或蚀刻的可机械加工性是众所周知的。

但是，本发明不限于这种材料的微反应器，也可以使用某些聚合物和例如氮化硅(Si₃N₄)、碳化氮(SiC)等来构造微反应器。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，第三距离小于5微米，更具体来说小于1微米，最具体来说小于300纳米。

5微米的间隙高度(第三距离)通常用于光学显微镜的聚焦深度，而1微米是光和UV荧光光学显微镜的聚焦深度的下限和电子可以穿透的上限。300至500nm的值必须视作TEM和STEM显微镜能够给出高分辨图像的上值。

在根据本发明的微反应器的另一个实施例中，第二通道包括入口。

通过使第二通道具有入口和出口，可以冲洗第二通道。这也提供了这样的机会：第一通道加入或流过第一种化学品或细胞，第二通道加入或流过另一种化学品或细胞，观测间隙中的化学品或细胞之间的反应，间隙现在作为两个通道之间的分界。

在根据本发明的微反应器的又一个实施例中，微反应器被设置成分开，使得其中一个层被从间隙去除。

通过从间隙中去除一个层，其中分散有颗粒和/或细胞的基质(其可以是在那时被冻结的流体)和其中的颗粒和/或细胞可用于其它检查方法(例如标准的SEM检查)，或者可以(机械地或例如用聚焦离子束)切除某些部分并在修薄以后在例如TEM中被检查。

在本发明的一个方面中，操作根据本发明的微反应器的方法的特征在于，对间隙施加梯度，该梯度为静态梯度或动态梯度。

施加梯度例如压力差引起流体运动，用于诱出间隙中的颗粒或细胞。

当施加静态梯度例如静压力差时，可以使通过第一通道的一部分流体流出。另外，当静态差是例如源于某种生物或化学材料的浓度时，可以例如通过向其中一个通道添加所谓的吸引流体(attractor fluid)例如细胞因子(cytokine)或化学因子(chemokine)来引诱细胞进入间隙。

注意，例如由于第一吸引流体，可以引诱一种细胞从第一通道至第二通道，同时另一种细胞从第二通道至第一通道。

在根据本发明的一个实施例中，梯度为化学品浓度梯度、生物材料浓度梯度、压力梯度、温度梯度、电压梯度或磁场梯度。

在根据本发明的另一个实施例中，梯度为压力梯度并且压力梯度通过加热流体产生以形成气泡，或通过移动压电元件来产生。

这种移动流体的方法熟知于例如喷墨打印机。加热可以通过电阻加热引起，但也可以使用激光加热。

在根据本发明的另一个实施例中，梯度为动态梯度，根据性质测量或观测结果梯度被设置为两个预设值之一，梯度的一个预设值使颗粒和/或细胞被带入间隙，梯度的另一个预设值使颗粒和/或细胞不被带入间隙，使得仅具有预定性质的颗粒和/或细胞被带入间隙。

利用在通过间隙之前测量或观测通过例如第一通道的细胞或颗粒的性质并使用观测来选定颗粒和/或细胞，仅选定的细胞可以被带入间隙中作进一步检查。

在根据本发明的又一个实施例中，测量或观测的性质选自几何性质、机械性质、单位体积的浓度、发光、荧光、磷光、放射性或颜色、生物习性或化学习性。

观测的性质可以基于细胞或颗粒的形式，但也可以基于其发光性能(例如作为在第一通道的层上的直流电压差或耦合入流体的RF的结果)，以及提到的任何其它性质。也可以通过对颗粒施加所谓的“激光螯”而使用机械性质例如弹性。

在根据本发明的另一个实施例中，带入间隙中的颗粒或细胞被固定。

通过固定颗粒和/或细胞，可以进一步改善检查。

在根据本发明的另一个实施例中，颗粒或细胞在溶液中并且通过冻结或聚合溶液来固定颗粒或细胞。

冻结是固定细胞或颗粒的熟知方法。顺便提及，当冷却水从0摄氏度非常迅速地变化到-170摄氏度时，形成无结晶冰(非晶体冰)，并因此不会发生例如由刺穿细胞膜所造成的损害。

在根据本发明的一个实施例中，在固定颗粒或细胞之后，微反应器被分开，使得其中一层被从间隙去除，此后检查间隙中的颗粒和/或细胞。

通过去除其中一层，可以接触间隙中的材料以例如用扫描电子显微镜(SEM)、聚焦离子束(FIB)机或其它受阻于层的检查方法进行检查。

注意，阻碍可以是由于例如撞击粒子的阻碍，但也可以是由于响应于辐照从间隙中的材料发出的信息载体的阻碍。

在另一个实施例中，从间隙中切除冻结或聚合流体的一部分，和/或细胞和/或颗粒，以在另一种环境下进行机械加工和/或检查。

在此，切除材料的特定部分例如已经在间隙中被检查的细胞的一部分。在另外的步骤中，它可以例如被修薄以在TEM中使用高分辨率TEM(对其来说具有厚度小于100nm的样品可能是必须的)进行检查。

附图说明

现在参照附图描述本发明，其中相同的标记代表相应的部件。

图1a示意性示出了根据本发明的微反应器的分解图，

图1b示意性示出了图1a的微反应器的横截面，

图2a示意性示出了用于STEM中的微反应器的分解图，

图2b示意性示出了图2a的微反应器的横截面，以及

图3示意性示出了用于TEM中的微反应器的横截面。

具体实施方式

图1a示意性示出了根据本发明的微反应器的分解图。

图1a示出了微反应器100，包括第一层102和第二层104。在第二层中形成第一通道106和第二通道108，这两个通道由壁110隔开。当第一和第二通道结合在一起时，在第一和第二通道之间的壁之上留有开放的小间隙。第一层还具有入口112和出口114，入口和出口由连接于第一通道的通孔形成。类似地，入口116和出口118连接于第二通道。

图1b示出了图1a中沿AA’线的微反应器的横截面。两个层102和104被结合在一起，在第一通道处第一层和第二层隔开第一距离130。类似地，在第二通道处第一层和第二层隔开第二距离132，其优选等于第一距离。在间隙处，第一层和第二层隔开第三距离，第三距离小于第一和第二距离。

从这些图中可以看到，在优选实施例中，可以通过沿相互垂直方向的三维来描述间隙：沿DD’线的第三距离或高度，沿AA’线形成第一和第二通道之间距离的长度以及垂直于DD’和AA’二者的宽度。但是，也可以使用其它形式，包括不规则的间隙。

第一层例如玻璃板具有窗口120，例如光学显微镜可以通过该窗口来观测/检查颗粒和/或细胞。另外，第二区域122可以用于粗略地观测颗粒和/或细胞，或用于另一种观测方法。

待检查的含有颗粒和/或细胞的流体被供给入口112并流出出口114，以使连续的流体流流过第一通道。通过观测装置例如荧光显微镜观测观测区域122，可以确定相关颗粒或细胞是否通过。如果是，并且补偿由于窗口120和观测区域122之间的距离所造成的时间延迟，则可以通过施加轻微过压至第一通道或轻微负压至第二通道或其组合来将颗粒或细胞吸入间隙。可以采取后者来最小化由于压力变化所造成的间隙高度变化。

注意，通过窗口120可以看到间隙的小部分，或者窗口120可以包括整个或几乎整个间隙。

还注意，颗粒和/或细胞的运送可以从第一至第二通道发生，但也可以通过施加带有细胞和/或颗粒的流体至第二通道而沿另一个方向发生。

还要注意，在窗口以及(如果实施)在观测区域处，其中一层例如第一层必须对于观测方法是可透过的，但另一层可以覆盖有反射层。

顺便提及，虽然在该实施例中，作为在观测区域处的观测结果而施加了动态梯度(压力差)，微反应器也可以使用在间隙之上的静态梯度。

还要提及，梯度(gradient)可以是压力梯度，但也可以是加至两种流体之一的化学或生物添加剂、电梯度等。尤其是使用所谓的吸引流体例如细胞因子且更具体地为化学因子，对引诱细胞跨过间隙证明有效。

注意，在该实施例中，将第一和第二层保持在一起的粘结剂层可以具有可以忽视的厚度。可以使用具有不可忽视厚度的粘结剂厚度，并施加至除间隙外的所有地方。尤其当粘结剂包括例如小球形式的间隔件时，这使得制造具有良好受控的间隙高度的微反应器变得很简单。

注意通道106和108可以或者不可以覆盖有粘结剂。间隙113无粘结剂，因此，当第一层和第二层结合在一起时，间隙厚度等于粘结剂层的厚度，其受控于粘结剂中的球体。本领域技术人员可以理解，作为替代方式，粘结剂可以施加于第一层，仍然使间隙无粘结剂并将其结合在一起。

还应当提及，优选使用不具有荧光性的玻璃(所谓的自动荧光玻璃)，因为这会阻碍或限制流体中的标签或材料的荧光性。

操作图1的微反应器的方法是：将流体施加于第一通道并将流体施加于第二通道。第一通道中的流体具有流量并例如在观测区域122进行检查。检查可以包括荧光显微镜、光学显微镜，但也可以例如包括用于例如放射性标识和/或材料的X射线检查或放射检查。在这种检查/观测的基础上可以确定间隙中的颗粒或细胞的检查是否得到保证。当例如细胞或分子(例如蛋白质)被用例如荧光标签进行标识时，这种方法特别有用，这种标签的存在(或颜色)用于作出这种确定。

当流速已知时，也已知被观测和选定的颗粒或细胞何时通过间隙。这时可以在第一和第二通道之间施加动态梯度，例如通过临时降低第二通道中的压力所造成的压力差。因此选定的颗粒或细胞被吸入间隙。在间隙中，可以用光学显微镜、荧光显微镜、共焦显微镜等来观测颗粒和/或细胞。由于间隙的较小高度，可以选择显微镜的聚焦深度来对应间隙的高度，因此所有颗粒/细胞将在焦点上。作为替代方式，由于高度小，将没有颗粒相互层叠，可以确定例如颗粒的轮廓而不会被另外的颗粒所覆盖。

当静态梯度施加于间隙之上时，出现了使用微反应器的另一种方法。梯度例如可以是化学品浓度梯度、生物材料浓度梯度、压力梯度、温度梯度或电压梯度。在这种情况下，不使用观测来选定细胞和/或颗粒。

该方法例如可用于引诱细胞通过间隙。已知当第一流体中的细胞检测到第二通道中的流体中的物质时会发生该过程。

注意，一种类型的细胞可以从第一通道行进至第二通道，同时另一种类型的细胞可以从第二通道行进至第一通道。

还要注意，当流体通过出口进入并通过入口离开时，微反应器自身和这些方法都同样能够良好工作；入口和出口是完全可交换的。

图2a示意性示出了适用于STEM中的微反应器。

图2a中所示的微反应器可以被认为是源自图1a中所示的微反应器。第一层在没有朝向第二层的侧面的窗口位置处具有凹槽200。因此第一层在与窗口对应的位置足够薄，使得STEM中使用的例如电子束能够穿过第一层。撞击在间隙中的任何材料上的电子产生准备在微反应器外侧检测的第二射线例如回射的电子、X射线或者荧光。

注意，由于电子在固体物质中的短的行程距离，第一层的厚度以及尤其当使用液体时间隙的高度必须保持为相当小。作为示例，300KeV电子的典型穿透范围在水中为5微米。

原则上也可以使用SEM，但在这种情况下使用具有例如30KeV能量的电子束的穿透范围通常限制为500nm。

注意，可以使用具有较大的第三距离(较大高度)的间隙，但是从窗口进一步移开的颗粒和结构将是不可见的。

图2b示意性示出了图2a中沿AA’线的微反应器的横截面。可以看到，第一层的厚度局部减小以形成具有最少窗口材料的窗口。

图3示意性地示出了适用于TEM的微反应器的横截面。可以认为，该微反应器源自图2更具体为图2b所示的微反应器。这里第二层也具有与第一凹槽相对的凹槽300，间隙因此夹在这两个凹槽之间。因此现在也可以检测穿过第一凹槽、流体和第二凹槽的电子。这些被传送的电子携带例如散射角和能量损失信息。

注意，在颗粒和/或细胞被带入间隙之前执行的性质测量或观测可以利用一种技术例如使用光学显微镜或辐射，间隙中的检查可以利用另一种技术例如电子显微镜或X射线检查。

在另一种方法中，细胞或颗粒被固定在间隙中，例如通过冻结浸没其的流体。这可以通过例如将微反应器浸没在流体乙烷中或通过在凹槽上喷涂流体乙烷来进行。冻结可以包括间隙的整个容积，或其可以仅包括间隙的入口和/或出口，使细胞和/或颗粒保持在液体中。这对于避免由于液体冻结而造成的损害会非常重要。

在根据本发明的另一个方法中，细胞和/或颗粒被引入间隙中，然后例如通过冻结浸没其的流体而被固定，此后微反应器被分开，使得其中一层被从间隙去除。在第一层限制进一步的检查例如SEM或FIB检查技术中，这释放了颗粒或细胞以用于检查。其还使得细胞和/或颗粒是可接触的以用于切除，从而可以从材料中取出样品，并且例如在TEM或例如气相色谱仪中进行检查。本领域技术人员知道许多这种检查方法。