经细菌来源的完整微细胞在体外和体内将药物靶向递送至哺乳动物细胞的组合物和方法

摘要

包含完整微细胞的组合物可用于靶向药物递送，所述完整微细胞含有药物分子。一种靶向药物递送方法使用双特异性配体以将负载药物的微细胞靶向特异性哺乳动物细胞并引起哺乳动物细胞内吞微细胞，所述双特异性配体包含第一臂和第二臂，第一臂载有对细菌来源的微细胞表面结构的特异性，第二臂载有对哺乳动物细胞表面受体的特异性。另一种药物递送方法利用细胞吞噬性哺乳动物细胞的天然能力来吞入微细胞，而不使用双特异性配体。

说明书

技术领域

本发明涉及实现受控的药物释放和药物靶向特定组织的持续努力，尤其是癌症化疗领域。更具体而言，本发明涉及在体内和体外通过完整的细菌微细胞来靶向药物递送至期望的靶细胞内，其中所述细菌微细胞能细胞内递送药物。包含化学或生化药物的微细胞构成新的递送载体，能靶向特定的细胞。使这些载体靶向的一种方法使用双特异性分子，其能特异性结合微细胞表面结构和靶细胞表面结构，例如受体。该双特异性配体介导微细胞和靶细胞之间的相互作用，使得靶细胞吞入微细胞，而微细胞释放它们的药物载荷进入靶细胞的细胞质。一旦药物在细胞质释放，其将作用于细胞内靶，如细胞内细胞器、细胞核、细胞骨架、酶和辅助因子，从而实现治疗作用。在药物递送的另一种方法中，具有吞噬作用或内吞作用的靶细胞吞入载有药物的微细胞，而不使用双特异性配体。 

背景技术

目前，用于治疗癌症的大多数药物是系统性给药。尽管细胞毒性抗癌药物的系统性递送在癌症治疗中起关键性作用，但是其也产生了严重的问题。例如，正常组织/器官系统性暴露于所施用药物可引起严重毒性(Sarosy and Reed，1993)。这又被以下事实进一步恶化：为了克服药物的生物利用度差和患者内大体积分布，系统性递送的癌症化疗药物经常必须以很高剂量递送。而且，系统性给药可以是侵入性的，其经常需要在大血管中使用保护导管。因为系统性给药通常需要使用外周或中枢静脉，其可引起局部并发症，例如静脉炎。药物的外渗也可导致给药的局部部位的起疱/组织损伤。这种情况在施用长春花属生物碱和蒽环类药物时是常见的。 

因为现有的靶向药物递送系统有严重缺陷，当前癌症药物治疗策略难于解决系统性给药存在的问题。解决这些问题的一种方法涉及简单地修改给药时间表或输注方案，其可以是快速浓注、间断或连续给药。然而，该方法提供了非常有限的益处。 

也存在静脉注射的一些替代方法，每种都旨在提供区域性递送，即选择性递送至肿瘤区域。这些替代方法的实例包括聚合物植入物、腹膜内输注、胸膜内输注、动脉内递送、化学栓塞和气雾剂吸入。特别地，化疗的腹膜内施用已经广泛地研究用于卵巢癌和其它腹部肿瘤(Kirmani et al.，1994；Alberts et al.，1996)。不幸的是，这些递送方法中的每种，包括腹膜内给药，在选择性递送药物至肿瘤部位和降低副作用方面都仅获得及其有限的成功。 

解决系统性递送细胞毒性抗癌药物问题的其它尝试包括，使用替代性药物制剂和递送系统，包括控释生物降解聚合物、聚合物微球载体和脂质体，以及与抗肿瘤药一起施用细胞保护剂。Chonn and Cullis，1995；Kemp et al.，1996；Kumanohoso et al.，1997；Schiller et al.，1996；Sharma et al.，1996；Sipos et al.，1997。 

使用脂质体作为化疗剂的药物载体，原本是建议将其作为控制药物分布以改善抗肿瘤功效和降低毒性的方法(综述见Allen，1997)。通过将药物在高分子载体如脂质体中包囊化，药物的分布体积显著降低，肿瘤中药物浓度增加。这引起非特异性毒性的量和类型的减少、可有效递送至肿瘤的药物量增加(Papahadjopoulos and Gabizon，1995；Gabizon and Martin，1997；Martin，1998)。脂质体保护药物不被代谢和在血浆中灭活。而且，由于跨健康内皮运输大分子或载体的大小限制，药物在健康组织中的累积程度降低(Mayer et al.，1989；Working et al.，1994)。 

为了延长它们的循环时间，用聚乙二醇(PEG)、合成的亲水性聚合物包裹脂质体(Woodle and Lasic，1992)。PEG的头基(headgroup)可用作屏障，空间上抑制在脂质体表面处与多种血液组分和血浆调理素的疏水和静电相互作用，因而阻碍了网状内皮系统识别脂质体。PEG-包被的脂质体被称为“空间稳定化的”(SSL)或STEALTH脂质体(Lasic and Martin，1995)。这一技术产生了聚乙二醇化脂质体阿霉素的商品化药物制剂，在美国称为Doxil，在欧洲称为Caelyx。大量的其它药物也已经被包囊入脂质体用于癌症治疗(Heath et al.，1983；Papahadjopoulos et al.，1991；Allen et al.，1992；Vaage et al.，1993b；Burke and Gao，1994；Sharma et al.，1995；Jones et al.，1997；Working，1998)。 

不幸地是，脂质体药物载体有几个缺点。例如，在体内，药物经常以足以生物 利用的速率渗漏出脂质体外，引起对正常组织的毒性。类似地，脂质体在体内不稳定，它们的破裂释放药物并引起对正常组织的毒性。而且，因为亲水性药物具有非常低的膜渗透性，高亲水性药物的脂质体制剂可以在肿瘤位点具有足以禁止性的低生物利用度。当脂质体载体到达肿瘤，这限制了药物释放。此外，高疏水性药物倾向于主要与脂质体的双层部分结合，由于药物向血浆组分中的快速再分配，引起包埋稳定性较低。另外，一些药物，如1-β-D-阿糖呋喃糖苷胞噻啶(ara-C)和甲氨蝶呤，仅经膜运输载体(transporter)直接进入肿瘤细胞(Plageman et al.，1978；Wiley et al.，1982；Westerhof et al.，1991，1995；Antony，1992)。在这种情况下，脂质体载体将需要在肿瘤部位附近释放足量的药物以获得治疗效果(Heath et al.，1983；Matthay et al.，1989；Allen et al.，1992)。最近，使用常规脂质体制剂增加患者获得机会感染的风险(White，1997)，这是因为药物在网状内皮系统巨噬细胞中的定位和伴随的巨噬细胞毒性(Allen et al.，1984；Daemen et al.，1995，1997)。这一问题在免疫缺陷患者如治疗卡波西肉瘤的AIDS患者中被加剧。 

因为这些问题继续显著地阻碍癌症治疗的成功，迫切需要靶向药物递送策略，其或者选择性递送药物至肿瘤细胞和靶器官，或者保护正常组织免于所施用的抗肿瘤药剂。这样的策略将通过增加抗癌剂的治疗指数来提高药物治疗的功效，同时最小化药物相关毒性的风险。 

国际专利申请PCT/IB02/04632已经描述了包含治疗性核酸分子的重组的、完整微细胞。这样的微细胞是体外和体内向宿主细胞递送寡核苷酸和多核苷酸的有效载体。PCT/IB02/04632中提供的数据证实，例如，载有哺乳动物基因表达质粒的重组微细胞可被递送至吞噬性细胞和非吞噬性细胞。该申请也描述了用附加型复制质粒DNA上携带的异源核酸将产生微细胞的亲代细菌株的遗传转化。亲代细菌和微细胞分离时，某些分离的附加DNA分离进入微细胞。产生的重组微细胞易于被哺乳动物吞噬性细胞吞入，并在细胞内的吞噬小体内被降解。令人惊奇地是，有些重组DNA逃脱吞噬小体膜，并被运送进入哺乳动物细胞核，在此重组基因被表达。因而，该申请表明了微细胞在人类或动物基因治疗中的可用性。 

本发明建立在这些与微细胞相关的最新发现上，其解决了对改善药物递送策略、 尤其是癌症化疗领域内的持续需求。 

发明内容

为了解决这些和其它的需要，在一个方面，本发明提供基本上由包含药物例如癌症化疗药物的完整微细胞组成的组合物。在一个相关的方面，本发明提供包含以下组分的组合物：(i)细菌来源的完整微细胞，和(ii)其药学接受的载体，其中所述微细胞包含药物。 

根据另一方面，本发明提供靶向药物递送的方法，其包括将双特异性配体接触(i)包含期望药物的细菌来源的微细胞和(ii)哺乳动物细胞，优选非吞噬性哺乳动物细胞。该双特异性配体对微细胞表面组分和哺乳动物细胞表面组分都有特异性。因而，所述配体引起微细胞结合哺乳动物细胞，微细胞被哺乳动物细胞吞入，并且药物释放入哺乳动物细胞的细胞质。 

本发明也提供用于将微细胞载体靶向哺乳动物宿主细胞的双特异性配体。所述双特异性配体可以是多肽、碳水化合物或糖肽，并可以包含抗体或抗体片段。在优选的实施方案中，所述双特异性配体具有第一臂和第二臂，第一臂载有对细菌微细胞表面结构的特异性，第二臂载有对哺乳动物细胞表面结构的特异性。用于结合配体的期望的微细胞表面结构为脂多糖的O-多糖组分。用于结合配体的期望的哺乳动物细胞表面结构为受体，优选为那些能活化受体介导内吞作用的受体。 

在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含(i)包含药物分子的细菌来源微细胞和(ii)双特异性配体，其能结合至微细胞的表面组分和哺乳动物细胞的表面组分。 

本发明提供另一种药物递送方法，其致使包含药物的细菌来源微细胞接触哺乳动物靶细胞，所述哺乳动物靶细胞具有吞噬作用或胞吞作用的能力。所述哺乳动物细胞吞入载有药物的微细胞，然后微细胞在细胞内释放它们的药物负载。 

本发明还提供将药物加载微细胞的方法。一种这样的方法涉及在包含微细胞的细胞外介质和微细胞细胞质之间创建浓度梯度。药物可沿该浓度梯度自然移动，进入微细胞的细胞质。 

将药物加载微细胞的另一种方法涉及在一定条件下培养重组的亲代细菌细胞，其中所述亲代细菌细胞转录并翻译编码药物的治疗性核酸，使得药物释放入亲代细菌细胞的细胞质。当亲代细菌细胞分裂并形成子代微细胞时，所述微细胞在它们的细胞质中也包含药物。 

将药物加载微细胞的另一种方法涉及在一定条件下培养包含编码药物的治疗性核酸的重组微细胞，使得治疗性核酸在微细胞内转录和翻译。 

本发明也提供细菌来源的完整微细胞和双特异性配体在制备药物中的用途，所述药物用于通过将药物施予细胞、组织或器官而治疗疾病或改良性状的方法。在所述药物中，微细胞包含药物分子和能结合微细胞和哺乳动物靶细胞的双特异性配体。这样的药物可用于治疗多种病况和疾病，包括获得性疾病如AIDS、肺炎和肺结核，但尤其可用于癌症化疗领域。 

本发明提供相对于常规药物治疗技术的显著改善，其通过如下方式实现：(i)降低药物相关的毒性，因为药物被特异性递送至靶细胞内，(ii)在人或动物的给药部位减缓药物相关的副作用，因为药物被包装在微细胞内而不能在药部位与非靶向细胞和组织相互作用，(iii)消除连续输注药物的需要，因为治疗剂量的靶向和包装药物的微细胞可通过常规注射给药，(iv)减少药物的有效剂量，因为实现了特异性靶向，和(v)有时消除了纯化药物的需要，因为药物可由微细胞药物递送载体或亲代细菌生物合成。使用用于药物生物合成和靶向递送至期望哺乳动物细胞的微细胞构成了特别的优点，因为许多药物通常从稀有植物或海洋来源中提取，或非常难以化学合成。另外，一些化疗药物，包括甲氨蝶呤，经由膜相关的主动运输机制进入哺乳动物细胞。 

附图说明

图1是显示高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS)定量包装在微细胞(微细胞_DOX)中的阿霉素的图。用外部介质中各种浓度的阿霉素包装5x10⁸微细胞(显示于x-轴)。纯化微细胞_DOX，并用新方法提取阿霉素(在实施例3中描述)。使用HPLC(圆圈)和LC-MS(三角形)测定阿霉素的浓度，并绘制在y-轴 上。 

图2是显示经由微细胞_DOX体外递送药物至人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)的图。对用EGFR靶向的微细胞_DOX处理的细胞(^EGFR微细胞_DOX)、非靶向的微细胞 _DOX处理的细胞(^非靶向微细胞_DOX)、游离阿霉素处理的细胞和未处理细胞进行细胞毒性测定。处理后6天内，用游离阿霉素或^EGFR微细胞_DOX处理的细胞表现出仅约30％的活力。未处理的细胞和用^非靶向微细胞_DOX处理的细胞表现出正常细胞活力。 

图3显示EGFR-靶向的、包装阿霉素的微细胞(^EGFR微细胞_Dox)对人乳癌异种移植物的高度显著的治疗作用。肿瘤体积显示在y-轴，建立异种移植后天数显示在x-轴。x-轴下的实心三角形指示施予各种处理的天数。x-轴下的空心三角形指示对照组G5和G6处理的变化，其中施用^EGFR微细胞_DOX而不是^非靶向微细胞_DOX。图例表明施予8组小鼠中每组的各种处理(n＝11/组)。 

图4显示EGFR-靶向的、包装紫杉醇(Paclitaxel)的微细胞(^EGFR微细胞_Pac)对人乳癌异种移植物的高度显著的治疗作用。肿瘤体积显示在y-轴，建立异种移植后天数显示在x-轴。x-轴下的实心三角形指示施予各种处理的天数。图例表明了施予8组小鼠中每组的各种处理(n＝11/组)。 

图5显示HER2/neu-靶向的、包装阿霉素的微细胞(^HER2微细胞_DOX)对人卵巢癌异种移植物的高度显著的治疗作用。所述微细胞来源于鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(S.t.)或大肠杆菌(E.coli)(E.c.)minCDE-亲代菌株。肿瘤体积显示在y-轴，建立异种移植后天数显示在x-轴。x-轴下的实心三角形指示施予各种处理的天数。图例表明了施予7组小鼠中每组的各种处理(n＝11/组)。 

图6显示EGFR-靶向的、包装阿霉素的微细胞(^EGFR微细胞_DOX)对肿瘤稳定/退化的剂量效应作用。在Balb/c nu/nu小鼠中建立MDA-MB-468肿瘤异种移植物，用含两种不同浓度阿霉素的10⁶、10⁷或10^8 EGFR微细胞_DOX静脉注射处理各组(n＝11)。肿瘤体积显示在y-轴，建立异种移植后天数显示在x-轴。x-轴下的实心三角形指示施予各种处理的天数。图例表明了施予7组小鼠中每组的各种处理。 

具体实施方式

本发明人已经确定，细菌来源的完整微细胞是体外和体内包装和递送药物至哺乳动物靶细胞的有效载体。更特别地，本发明人已经发现载有药物负荷的微细胞可被指向靶细胞，靶细胞将微细胞内化并加工，使得药物负荷释放入靶细胞的细胞质。令人惊奇地，该药物在加工后继续存在而没有被降解。 

在这些发现的一个实例中，本发明人观察到包装药物的微细胞可靶向癌症细胞，被癌细胞体外内化，并在次级内体或吞噬小体内被降解，从而释放治疗有效量的生物活性药物进入癌细胞的细胞质。参见如下的实施例。 

在另一个实例中，在裸鼠中用人肿瘤异种移植物的体内研究证实了这些观察结果。静脉内递送包装药物的微细胞证实了在所有小鼠(每组11只小鼠)中高度显著地缩减肿瘤异种移植物。参见如下的实施例。 

因而，本发明人已经发现(i)大量的不同药物可被包装入完整微细胞，(ii)药物从细胞外环境单向移动进入完整微细胞的细胞质中，(iii)治疗显著浓度的药物可被转入完整微细胞的细胞质中，(iv)完整微细胞的细胞膜不能透过药物，使药物不能从微细胞的细胞质中漏出，(v)双特异性配体与包装药物的微细胞的表面结构的连接不能使微细胞不稳定，因而，微细胞可特异性地体外和体内结合哺乳动物靶细胞，(vi)有吞噬或内吞能力的哺乳动物细胞吞入包装药物的微细胞，(vii)非吞噬性的哺乳动物细胞快速吞入结合表面受体的包装药物微细胞，(viii)微细胞在被吞噬入，在液泡内被降解，显著量的生物活性药物从液泡膜脱逸，(viii)释出的药物可作用于哺乳动物细胞内的细胞内靶，(ix)包装化疗药物的微细胞可体内渗透穿过肿瘤实体周围的易漏脉管，(x)使用包装化疗药物的微细胞可获得非常显著的治疗效果，包括肿瘤退化和疾病稳定化，和(xi)包装药物的微细胞显著地降低或消除不期望的毒性。 

由于某些原因，微细胞包装药物的能力是令人惊奇的。令人惊奇地是，所述完整微细胞膜对大量结构不相似的亲水性、疏水性和两性药物是可渗透的。相反，活的细菌细胞对溶质表现出选择性膜渗透性，因而似乎微细胞已经丧失了这种选择性。也令人惊奇地是，微细胞不能从它们的细胞质中排除药物，因为活的细菌能排出进入细菌细胞质的毒性化学物质。即使相对于逆向渗透梯度，其中载有药物的微细胞 悬在不含药物的磷酸盐缓冲液中，微细胞仍保留药物。这一点又是令人惊奇地，因为药物似乎简单地通过完整的微细胞膜扩散进入微细胞，然而没有使药物扩散出微细胞的扩散通道可用。本发明的另一个意想不到的方面是治疗显著的药物浓度可包装在微细胞内，因为细菌细胞质(因而，和微细胞细胞质)包含显著浓度的生物相容性溶质。因此，相信可能没有足够的多余细胞内空间来容纳高浓度的非生物相容性药物溶质，而不丧失微细胞完整性。 

由于一些原因，微细胞递送药物的能力也是令人惊奇的。意想不到的是，例如包装药物的微细胞不将药物漏入细胞外空间。这是用脂质体药物递送载体的长期以来的问题，并且微细胞象脂质体一样不是有生命的载体。然而，尽管完整的微细胞膜对药物渗透缺乏选择性，膜的完整性足够防止细胞内溶质漏出。而且令人惊奇地是，和脂质体药物递送载体不同，配体与包装药物的微细胞表面的结合不引起导致药物漏出的微细胞完整性不稳定或膜扰动。而且，意想不到的是，包装药物的微细胞可被非吞噬性哺乳动物细胞快速内吞，仅仅通过连接二者的双特异性配体。至今为止普遍相信，大颗粒如细菌仅能通过由活病原体分泌侵袭相关蛋白参与的主动过程渗透和侵袭非吞噬性哺乳动物细胞。微细胞是缺少主动侵袭吞噬性哺乳动物细胞能力的无生命小泡。另外，还令人惊奇地是载有双特异性配体的包装药物的微细胞能体内渗出肿瘤新生血管。虽然对肿瘤微环境新血管系统的泄漏程度有很多争论，但是当前的观点是新血管系统中的孔直径为150-400nm(Gabizon et al.，2003)。然而，载有表面配体的微细胞的直径为400nm-600nm，但是仍旧能在体内渗出肿瘤新血管。由于一些原因，包装在微细胞中的药物避免降解的能力也是令人惊奇的。被吞入的微细胞面临溶酶体和次级内体环境，这种环境已知是恶劣的并将破坏微细胞。尽管这些环境很恶劣，本发明人观察到大量药物从微细胞中以生物活性形式释放，并保持明显的不变性。可能更令人惊奇地是发现显著浓度的药物以其活性形式能逃逸进入哺乳动物细胞的细胞质。按照本发明，即，哺乳动物细胞内的药物浓度在体外和在体内试验中都足够产生治疗效果。 

另外还令人惊奇的发现是包装药物的微细胞将不利的副作用降至最小。例如，在裸鼠尾静脉的静脉注射部位，游离药物注射会引起严重的皮肤反应，而包装药物 的微细胞不引起这样的不利副作用。 

根据这些发现，本发明提供基本上由含期望药物的完整微细胞组成的组合物，所述药物如癌症化疗药物。本发明也提供包含(i)细菌来源的完整微细胞和(ii)药学接受载体的组合物，其中微细胞包含药物，例如癌症化疗药物。 

本发明的微细胞为大肠杆菌或其它细菌细胞的无核形式，其由与DNA分离一起的细胞分裂的二分分裂期间的协调紊乱造成。原核染色体复制与正常的二分分裂相联，这涉及细胞中隔的形成。在大肠杆菌中，例如，min基因例如minCD突变可消除在细胞分裂期间细胞极处形成隔膜的抑制，导致生成正常子细胞和无核微细胞。参见de Boer et al.，1992；Raskin & de Boer，1999；Hu & Lutkenhaus，1999；Harry，2001。微细胞与其它的小泡不同，其它小泡在某些情形下被自发地产生和释放，与微细胞相反，不是由于特异性遗传重排或附加体基因表达。对于实施本发明而言，期望微细胞具有完整的细胞壁(”完整微细胞”)。 

除了min操纵子突变外，在影响隔膜形成的很多其它遗传重排或突变后也产生无核微细胞，例如在枯草杆菌的divIVB1中。参见Reeve and Cornet，1975；Levin et al.，1992。在参与细胞分裂/染色体分离的蛋白质的基因表达水平受到干扰后，也可形成微细胞。例如，minE的过表达导致极性分裂(polar division)和微细胞的生成。类似地，较少染色体的微细胞可由染色体分离的缺陷引起，例如枯草杆菌的smc突变(Britton et al.，1998)、枯草杆菌中的spoOJ缺失(Ireton et al.，1994)、大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga et al.，1989)和大肠杆菌中的parC突变(Stewart and D′Ari，1992)。基因产物可以反式(in trans)提供。当从高拷贝数的质粒过表达时，例如，CafA可增强细胞分裂的速率和/或抑制复制后的染色体分隔(Okada et al.，1994)，导致形成链式细胞和无核微细胞(Wachi et al.，1989；Okada et al.，1993)。微细胞可由任何革兰氏阳性或革兰氏阴性起源的细菌细胞制备。 

本发明的微细胞包含一种或多种药物。术语”药物”包含任意生理或药理活性物质，其能在动物尤其是哺乳动物和人中产生局部或系统性作用。药物可以是无机或有机化合物，不受限制地，包括肽、蛋白质、核酸和小分子，其中的任一种可以被表征或未表征。它们可以是各种形式，例如无变化的分子、分子复合物、药理学可 接受的盐例如氢氯化物、氢溴化物、硫酸盐、月桂酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐、硼酸盐、醋酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐等。对于酸性药物而言，可使用金属盐、铵盐或有机阳离子盐，例如季铵盐。也可使用药物的衍生物，例如碱、酯和酰胺。水不溶性药物可使用其水溶性衍生物形式或作为其碱性衍射物使用，其在任意情况下，或通过递送，由酶转化、由身体pH水解或由其它代谢过程转化为其原始的治疗活性形式。 

具有任意生理或药理活性的药物都可用于本发明，但是癌症化疗剂是优选的药物。有用的癌症化疗药物包括氮芥、亚硝基脲(nitrosorueas)、乙烯亚胺、磺酸烷酯、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷类、长春花碱类、拓扑异构酶抑制剂和激素剂。示例性化疗药物为放线菌素D、左旋苯丙氨酸氮芥(Alkeran)、阿糖胞苷(Ara-C)、阿那曲唑、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡鲁胺、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、Carboplatinum、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷(Cytosine arabinoside)、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪、放线菌素D(Dactinomycin)、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、DTIC、表阿霉素(Epirubicin)、乙撑亚胺、依托泊苷、氟尿嘧啶脱氧核苷(Floxuridine)、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、赫赛汀、六甲胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺(Ifosfamide)、依立替康、洛莫司汀、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠(Pamidronate)、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、美罗华(Rituximab)、类固醇、链佐星、STI-571、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、塞替派、雷替曲塞(Tomudex)、托泊替康、苏消安(Treosulphan)、三甲曲沙、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16和希罗达。 

本发明的包含微细胞的组合物优选包含每10⁷微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞，更优选包含每10⁸微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞，甚至更优选包含每10⁹微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞，仍旧更优选包含每10¹⁰微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞和最优选包含每10¹¹微细胞少于约1个污染的亲代细 菌细胞。 

纯化微细胞的方法是本领域已知的，描述于PCT/IB02/04632。一种这样的方法结合错流过滤(进料流与膜表面平行；Forbes，1987)和死端式过滤(进料流与膜表面垂直)。任选地，可以在过滤组合之前以低离心力进行差速离心，来除去某些部分的细菌细胞，从而富集微细胞的上清液。 

另一种纯化方法利用在生物相容性介质中的密度梯度离心。离心后，从梯度中收集微细胞带，和任选地，微细胞再接受多轮密度梯度离心以使纯度达到最大。该方法还可包括对包含微细胞的样品实施差速离心的初始步骤。当在低离心力下实施时，差速离心将除去亲代细菌细胞的一些部分，从而富集微细胞的上清液。 

特别有效的纯化方法利用细菌成丝作用来增加微细胞纯度。因而，微细胞纯化方法可包括步骤：(a)将包含微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞采用丝状体形式的条件，随后(b)过滤样品以得到纯化的微细胞制剂。 

也可以组合已知的微细胞纯化方法。一种高度有效的组合方法如下： 

步骤A：差速离心产生微细胞的细菌细胞培养物。这一步骤可以在2000g进行约20分钟，除去大多数亲代细菌细胞，同时将微细胞留在上清液中。 

步骤B：使用等渗和无毒的密度梯度介质进行密度梯度离心。这一步骤使许多污染物与微细胞分离，伴有最少限度的微细胞损失，所述杂质包括亲代细菌细胞。优选地，在纯化方法内重复该步骤。 

步骤C：通过0.45μm过滤器错流过滤以进一步减少亲代细菌细胞污染。 

步骤D：剩余亲代细菌细胞的胁迫诱导的成丝作用。这可以通过使微细胞悬液经受几种诱导胁迫的环境条件的任一种中来完成。 

步骤E：抗生素处理以杀死亲代细菌细胞。 

步骤F：错流过滤来除去小污染物，例如膜泡(membrane blebs)、膜碎片、细菌碎片、核酸、介质组分等，并且浓缩微细胞。可应用0.2μm过滤器来分离小污染物与微细胞，并可使用0.1μm过滤器来浓缩微细胞。 

步骤G：死端式过滤来消除丝状的死细菌细胞。这一步骤可使用0.45μm过滤器。 

步骤H：从微细胞制剂中除去内毒素。这一步骤可使用包被抗LipidA的磁珠。 

在另一个方面，本发明提供靶向药物递送方法，其包含使双特异性配体接触(i)包含药物分子的细菌来源的微细胞和(ii)哺乳动物细胞。所述双特异性配体对微细胞和哺乳动物细胞组分都具有特异性，引起微细胞结合哺乳动物细胞，使微细胞被哺乳动物细胞吞入，药物释放入哺乳动物细胞的细胞质。 

本发明人发现这一方法广泛适用于大量哺乳动物细胞，包括通常抗拒特异性粘附和内吞微细胞的细胞。例如，双特异性抗体配体有效地使微细胞结合至广泛围的非吞噬性靶细胞上的各自受体上，所述配体在一臂上具有抗-O-多糖的特异性，和在另一臂具有抗-HER2受体、抗-EGF受体或抗-雄激素受体的特异性。这些细胞包括肺、卵巢、脑、乳腺、前列腺和皮肤癌细胞。而且，有效的结合在每个非吞噬性细胞快速内吞微细胞之前。 

本发明的靶向细胞包括待导入药物的任何细胞。当涉及药物时使用“导入”指微细胞内携带的药物被递送至靶细胞，优选靶细胞内。期望靶细胞的特征在于其表达细胞表面受体，当该受体结合配体时，将辅助内吞作用。优选的靶细胞是非吞噬性细胞，意思是指不是专门的吞噬细胞的细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤(NK)细胞。优选的靶细胞也为哺乳动物细胞。 

在本发明的靶向药物递送方法中使用的配体包括结合靶细胞上表面组分和微细上表面组分的任何试剂。优选地，靶细胞上的表面组分为受体，尤其是能介导内吞作用的受体。所述配体可以包括多肽和/或糖组分。抗体是优选的配体。例如，双特异性抗体可有效地用于将微细胞在体外和体内靶向哺乳动物靶细胞，所述双特异性抗体对细菌来源完整微细胞的表面组分和哺乳动物靶细胞的表面组分具有双重特异性。有用的配体也包括受体、酶、结合肽、融合蛋白/嵌合蛋白和小分子。 

特定配体的选择是依照两个主要标准：(i)特异性结合完整微细胞表面上的一个或多个域，和(ii)特异性结合靶细胞表面上的一个或多个域。因而，配体优选具有第一臂和第二臂，第一臂载有对细菌来源完整微细胞的表面结构的特异性，第二臂载有对哺乳动物细胞表面结构的特异性。第一臂和第二臂的每一个可以是多价的。优选地，即使是多价的，每个臂也是单特异性的。 

为了结合细菌来源的微细胞，期望配体的一个臂对亲代细菌细胞上的脂多糖的O-多糖组分具有特异性。其它的可用于配体结合的微细胞表面结构包括暴露于细胞表面的多肽和外膜上的糖，例如菌毛(pilli)、纤毛(fimbrae)和鞭毛细胞表面暴露的肽区段。 

为了结合靶细胞，配体的一个臂对哺乳动物细胞的表面组分具有特异性。这样的组分包括细胞表面蛋白质、肽和糖类，可以是特征性的或非特征性的。细胞表面受体，尤其是能活化受体介导内吞作用的那些是期望的用于靶向的细胞表面组分。这样的受体，如果在靶细胞表面过表达，对靶向待处理的细胞给予另外的选择性，因而减少了递送给非靶向细胞的可能性。 

作为实例，可以通过选择特异性结合期望细胞上细胞表面受体基序的配体，来靶向肿瘤细胞、转移性细胞、脉管系统细胞例如内皮细胞和平滑肌细胞、肺细胞、肾细胞、血液细胞、骨髓细胞、脑细胞、肝细胞等，或任意的选定细胞的前体。细胞表面受体的实例包括癌胚抗原(CEA)，其在大多数结肠、直肠、乳腺、肺、胰腺和胃肠道癌中过表达(Marshall，2003)；heregulin受体(HER-2、neu或c-erbB-2)，其经常在乳腺、卵巢、结肠、肺、前列腺和宫颈癌中过表达(Hung et al.，2000)；表皮生长因子受体(EGFR)，其在多种实体瘤中高度过表达，包括乳腺、头和颈、非小细胞肺和前列腺的实体瘤(Salomon et al.，1995)；唾液酸糖蛋白受体(Stockert，1995)；转铁蛋白受体(Singh，1999)；丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)酶复合物受体，其在肝细胞中过表达(Ziady et al.，1997)；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，其在胰管腺癌细胞中过表达(Kleeff et al.，2002)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)，用于抗血管生成的基因治疗(Becker et al.，2002 and Hoshida et al.，2002)；叶酸受体，其在90％的非粘液性(nonmucinous)卵巢癌中选择性过表达(Gosselin and Lee，2002)；细胞表面糖萼(Batra et al.，1994)；糖受体(Thurnher et al.，1994)；和聚合型免疫球蛋白受体，其用于将基因递送至呼吸道上皮细胞，并对治疗肺疾病例如囊性纤维病有吸引力(Kaetzel et al.，1997)。 

在另一个实例中，抗病毒、抗微生物和抗寄生虫药物可被掺入完整微细胞，并可以实现靶向递送药物至特异性感染细胞，例如HIV感染的辅助性CD4+ T淋巴细 胞。 

优选的配体包括抗体和/或抗体衍生物。如本文使用的，术语“抗体”包含通过体外或体内产生免疫源性应答得到的免疫球蛋白分子。术语“抗体”包括多克隆、单特异性和单克隆抗体，以及抗体衍生物，例如单链抗体片段(scFv)。在本发明中有用的抗体和抗体衍生物也可以通过重组DNA技术得到。 

野生型抗体具有四个多肽链，两个相同的重链和两个相同的轻链。两种类型的多肽链都具有恒定区和可变区，恒定区在同一类型的抗体内不改变或改变极小。可变区对特定抗体是唯一的，其包含识别特异性表位的抗原结合结构域。最直接参与抗体结合的抗原结合结构域的区域为“互补性决定区”(CDRs)。 

术语”抗体”也包括抗体的衍生物，例如保留特异性结合抗原能力的抗体片段。这样的抗体片段包括Fab片段(含有抗原结合结构域的片段，其包含通过二硫键连接的轻链和部分重链)、Fab’(含有单个抗原结合结构域的抗体片段，包含Fab和跨绞链区的重链的另外部分)、F(ab’)2(通过重链绞链区中的链间二硫键连接的两个Fab’分子)、双特异性Fab(具有两个抗原结合结构域的Fab分子，其中的每个可指向不同表位)和scFv(通过氨基酸链连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变的、抗原结合决定性区域)。 

当抗体，包括抗体片段，构成配体的部分或全部时，优选它们为人来源的或经修饰适用于人类。所谓的”人源化抗体”是本领域已知的。参见，例如Osbourn et al.，2003。它们经过遗传操作和/或体外处理被修饰以降低它们在人中的抗原性。人源化抗体的方法描述于例如，美国专利No.6,639,055、No.5,585,089和No.5,530,101。在最简单的情况下，人源化抗体是通过将来自小鼠mAb的抗原结合环移植入人IgG中形成的，所述抗原结合环也称为互补性决定区(CDRs)。参见Jones et al.，1986；Riechmann et al.，1988；and Verhoeyen et al.，1988。然而，高亲和力的人源化抗体的产生通常需要转移一个或多个来自小鼠亲代mAb的所谓框架区(FRs)的另外的残基。也已经开发了人源化技术的某些变化方案。参见Vaughan et al.，1998。 

除了”人源化抗体”，人抗体也可以用于本发明。它们对各自的抗原具有高亲和力，通常从非常大的、单链可变性片段(scFvs)或Fab噬菌体展示文库获得。参见 Griffiths et al.，1994；Vaughan et al.，1996；Sheets et al.，1998；de Haard et al.，1999；and Knappik et al.，2000。 

有用的配体也包括双特异性单链抗体，其典型地为重组多肽，该多肽由可变轻链部分通过连接分子共价结合相应的可变重链部分组成。参见美国专利5,455,030；5,260,203和4,496,778。双特异性抗体也可以由其它方法制备。例如，化学异缀合物(heteroconjugates)可通过化学连接不同特异性的完整抗体或抗体片段制备。参见Karpovsky et al.，1984。然而，这样的异缀合物难于以可重现性方式制备，并且至少是正常单克隆抗体的两倍大。双特异性抗体也可由二硫键交换制备，其涉及酶切和抗体片段的重新组合。参见Glennie et al.，1987。 

因为Fab和scFv片段是单价的，它们通常对靶结构具有低亲和力。因此，由这些组分制备的优选配体被工程化为二聚、三聚或四聚偶联体以增加功能性亲和力。参见Tomlinson and Holliger，2000；Carter，2001；Hudson and Souriau，2001；and Todorovska et al.，2001。这样的偶联体结构可以由化学和/或遗传交联来制备。 

本发明的双特异性配体优选在每个末端为单特异性的，即在一个末端对微细胞上的单一组分有特异性，而在另一末端对靶细胞上的单一组分有特异性。所述配体可以在一个或两个末端是多价的，例如以所谓的双价抗体(diabodies)、三价抗体(triabodies)和四价抗体(tetrabodies)的形式。参见Hudson and Souriau，2003。双价抗体为由两个scFv的非共价结合形成的双价二聚体，其产生了两个Fv结合位点。同样地，三价抗体为由三个scFv的三价三聚体形成而产生的，得到了三个结合位点，四价抗体是由四个scFv的四价四聚体形成产生的，得到了四个结合位点。 

几种对哺乳动物细胞上的受体具有特异性的人源化、人和小鼠的单克隆抗体及其片段已被批准用于人类治疗用途，并且该列表增长迅速。参见Hudson and Souriau，2003。这样的可用于形成双特异性配体一个臂的抗体的实例为对HER2有特异性的：Herceptin^TM；Trastuzumab。 

抗体可变区也可融合至广范围的蛋白质结构域。融合至人免疫球蛋白结构域如IgG1 CH3既增加质量，又促进二聚化。参见Hu et al.，1996。融合至人Ig铰链-Fc区域可增加效应物功能。而且，融合至来自多聚体蛋白质的异种蛋白结构域促进多 聚化。例如短scFv与短双亲性螺旋的融合已用于制备微型抗体。参见Pack and Pluckthun，1992。来自可形成异二聚体的蛋白质的结构域，例如fos/jun，可被用于制备双特异性分子(Kostelny et al.，1992)，作为替代，通过工程策略例如“突起入孔”(knobs into holes)，同二聚化结构域可被改造形成异二聚体(Ridgway et al.，1996)。最后，可选择融合蛋白伴侣来提供多聚化以及另外的功能，例如链亲合素。参见Dubel et al.，1995。 

在另一方面，本发明提供物质的组合物，可用于高效的将药物分子导入哺乳动物靶细胞。所述组合物包含(i)细菌来源的微细胞和(ii)双特异性配体。所述微细胞和配体可以是任意本文描述的任一种。因而，所述微细胞包含药物，双特异性配体优选能结合微细胞的表面组分并能结合哺乳动物靶细胞的表面组分。 

基本上由本发明的微细胞和双特异性配体组成的组合物(即，包括这样的微细胞和配体及其它成分的组合物，所述其它成分不会不利地干扰组合物的药物递送质量)可以使用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂按常规方式配制。 

术语“药学接受的”指载体或赋形剂不消除所施用组合物的生物活性，其为化学惰性的，且对被给药的生物体无毒。制剂可以以单位剂量形式提供，例如装入安瓿中或小瓶中，或装入多剂量容器中，含有或不含有添加的防腐剂。所述制剂可以是在油性或水性载体中的溶液、悬液或乳液，并可以含有制剂助剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。适当的溶液是与接受者的血液等渗的，例如盐水、林格(氏)溶液和葡萄糖溶液。作为替代，组合物可以是冻干粉末形式，用于用适宜的载体重构，所述载体例如无菌、无热原的水或生理盐水。该组合物也可以配制为储库制剂(depot preparation)。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内植入)或通过肌肉注射给药。 

本发明的组合物可经由多种途径施用至哺乳动物体内的多个部位，以得到期望的局部或系统性治疗效果。递送可以通过多种途径完成，例如口服给药、将制剂施用至体腔、通过吸入或吹入(insufflation)、或通过胃肠道外、肌肉内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜内、皮下、瘤内或皮内给药来完成。给药模式和给药部位取决于靶细胞的位置。例如囊性纤维化的细胞可以通过吸入递送靶向重组微细胞来有效 地靶向。类似地，转移肿瘤可以经由静脉内递送靶向重组微细胞来更有效地治疗。原发性卵巢癌可以经由腹膜内递送靶向重组微细胞来治疗。 

本发明还通过使细菌来源的含药微细胞与哺乳动物细胞接触的方式来递送药物，所述哺乳动物细胞具有吞噬或胞吞能力，这样的哺乳动物细胞能以细胞内细菌病原体的方式吞入亲代细菌细胞，也同样能吞入微细胞，微细胞将负载的药物释放入哺乳动物细胞的细胞质。在不使用靶向配体下，这种药物递送方法可以实现。 

多种机制可能参与给定类型的细胞吞入微细胞，在这点上本发明不依赖任何具体的机制。例如，吞噬作用已经研究很多的过程，其中巨噬细胞和其它吞噬细胞，例如嗜中性粒细胞，通过伸展伪足至颗粒表面直到颗粒被完全包裹而摄入颗粒。尽管描述为”非特异性”吞噬作用，但已经证实在该步骤中有特异性受体参与。参见Wright & Jong(1986)；Speert et al.(1988)。 

因而，一种形式的吞噬作用涉及表面配体和位于伪足膜上的配体-受体之间的相互作用(Shaw and Griffin，1981)。这一由特异性受体介导的结合步骤被认为依赖于细菌表面粘附素(adhesin)。至于毒力较弱的细菌，例如不产肠毒的大肠杆菌，在不存在噬菌细胞受体的表面配体的情况下，吞噬作用也可以发生。例如，参见Pikaar et al.(1995)。因而，本发明包括，但不限于，微细胞的用途，其中微细胞具有或缺乏表面粘附素，其保持亲代细菌细胞的性质，并且微细胞可被吞噬细胞(即有”吞噬能力”的宿主细胞)吞入，其中嗜中性粒细胞和巨噬细胞是哺乳动物中主要的吞噬细胞类型。 

另一种吞入方法为内吞作用，通过该作用，细胞内的病原体进入哺乳动物上皮细胞，并在此复制，所述病原体的实例为沙门氏菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、螺杆菌属、假单胞菌属和乳杆菌属的物种。在这一点上两种基本机理为依赖笼形蛋白的受体介导的内吞作用，也称为”被膜小窝的内吞作用”(Riezman，1993)，和不依赖笼形蛋白的内吞作用(Sandvig & Deurs，1994)。根据本发明，当发挥内吞作用的具有吞入能力的细胞(即有“内吞作用能力”的宿主细胞)吞入微细胞时，上述一种或两种都可能参与。代表性的有细胞内吞作用的细胞为乳腺上皮细胞、胃肠道中的肠细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞和泌尿道及膀胱上皮细胞。 

当不使用打靶配体递送药物至有吞入能力的哺乳动物细胞时，本申请所包括的性质将影响微细胞的细菌来源的选择。例如，沙门氏菌属、埃希氏杆菌属和志贺氏菌属携带粘附素，其可被胃肠道中肠细胞上介导内吞作用的受体识别，并可以适于递送对结肠癌细胞有效的药物。类似地，来源于幽门螺旋杆菌的微细胞，携带对胃上皮细胞特异性的粘附素，其可适于递送药物靶向至胃癌细胞。吸入或吹入可适于施用来源于假单胞菌属的完整微细胞，该微细胞载有可被肺上皮细胞受体识别的粘附素。来源于乳杆菌属细菌的微细胞，其载有对泌尿道和膀胱上皮细胞特异性的粘附素，可适于尿道内递送药物至泌尿道或膀胱癌。本发明还提供细菌来源的完整微细胞和双特异性配体在制备用于治疗疾病或改善性状的方法的药物中的用途，所述方法通过施用所述药物至细胞、组织或器官来实现。在该药物中，微细胞包含药物分子，双特异性配体能结合至微细胞和哺乳动物靶细胞。这样的药物可用于治疗多种病症和疾病，包括获得性疾病例如AIDS、肺炎和肺结核，但是特别可用于癌症化疗方面。 

本发明还提供用药物负载微细胞的方法。使用这些方法，可实现对亲水性和疏水性药物的包装。用药物负载微细胞的一种方法包括在包含微细胞的细胞外介质和微细胞的细胞质之间创建药物的浓度梯度。当细胞外介质包含比微细胞细胞质更高的药物浓度时，药物自然地沿该浓度梯度下移，进入微细胞细胞质。然而，当浓度梯度逆转时，药物不能移出微细胞。 

这样，治疗显著量的药物可被包装在无生命的微细胞中而不会因为一些原因渗漏，这是令人惊奇的。已知活的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的外包膜，可对周围介质中的溶质形成有效屏障，然而是水可透过的。这样保护细菌不受有毒分子的有害作用，所述有毒分子例如生物杀灭剂和抗生素。也已知细菌包膜赋予对被动扩散和疏水性化学物的细胞内进入的内在抗性，其不能穿过充满水的亲水性通道，该通道由称为通道蛋白(porins)的膜相关蛋白形成。 

微细胞包含与它们的亲代细菌细胞相同的外包膜。因此，令人惊奇地是，通过在微细胞外和微细胞内的环境之间创建简单的浓度梯度，亲水性药物例如阿霉素和长春碱，和疏水性药物例如紫杉醇，可以容易地转移入微细胞的细胞质。这提示无 生命的细菌及其衍生物的包膜渗透性与活细菌的包膜渗透性非常不同。 

在微细胞内药物移动仅仅在一个方向发生的发现是更令人惊奇的。已经明确活细菌具有主动排出过程，以除去偶尔进入其细胞质的有毒化学实体(综述见Borges-Walmsley and Walmsley，2001)。这些过程由多药运输蛋白(transporter)介导，其是一大类和多样性的蛋白质，通过主动外排出有毒化合物而能保护细胞免于广泛的环境毒素。基于序列相似性，存在至少五种已知的多药运输蛋白家族。它们包括(i)主要辅助蛋白(major facilitator)(MFS)，(ii)抗性成节细胞分裂(resistance-nodulation-cell division)(RND)，(iii)小的多药抗性，(iv)多药和毒性化合物排出，和(v)ATP结合盒家族。这些多药运输蛋白为细菌膜结合的蛋白质，广泛分布于细菌物种中。 

多药运输蛋白应当保存在微细胞膜中，然而它们令人惊奇地似乎是无功能的，可能因为微细胞是无生命的，并且缺少驱动多药运输蛋白必需的ATP。 

对于用通常非水溶性药物负载微细胞而言，可将药物首先溶于适宜的溶剂中。例如紫杉醇可溶于1∶1的乙醇和cremophore EL(聚氧乙烯蓖麻油)的混合物中，然后用PBS稀释得到紫杉醇溶液，其部分稀释于水介质中，并含有最小量的有机溶剂以保证药物保留在溶液中。微细胞可以培养在用于负载药物的这种最终介质中。因此，本发明人发现即使疏水性药物也可扩散入微细胞的细胞质中，从而获得较高的和治疗显著量的细胞质药物负载。这是意想不到的，因为微细胞膜由疏水性磷脂双层组成，预期该双层能防止疏水性分子扩散进入细胞质。 

用药物负载微细胞的另一种方法包括在一定条件下培养重组的亲代细菌细胞，其中亲代细菌细胞转录并翻译编码药物的治疗性核酸，从而药物释放进入亲代细菌细胞的细胞质。例如可以克隆编码用于期望药物的细胞生物合成途径的基因簇并转移到亲代菌株中，该菌株能产生微细胞。基因簇的遗传转录和翻译导致药物在亲代细菌细胞的细胞质内生物合成，从而细菌的细胞质中充满药物。当亲代细菌细胞分裂并形成子代微细胞时，微细胞在它们的细胞质中也包含药物。预包装的微细胞可以通过本领域已知的以及上述的任意微细胞纯化技术纯化。 

类似地，用药物负载微细胞的另一种方法包括在一定条件下培养重组微细胞， 该微细胞包含编码药物的表达质粒，使得编码药物的基因在微细胞内转录和翻译。 

对于在亲代细菌细胞或微细胞内直接生成药物而言，亲代细菌细胞或微细胞包含核酸分子，经过转录和/或翻译，在细胞、组织或器官中起改善或治疗疾病或改善性状的作用。为了此处描述的目的，这样的核酸分子归类为”治疗性核酸分子”。通常，治疗性核酸发现于亲代细菌或微细胞内的质粒上。 

所述治疗性核酸分子编码药物产品，例如功能性RNA(例如反义RNA或siRNA)或肽、多肽或蛋白质，所述药物产品的生成是期望的。例如感兴趣的遗传物质可编码有治疗价值的激素、受体、酶或(多)肽。治疗性核酸分子可以是这些基因的正常对应物，所述基因表达功能异常的蛋白质或在疾病状态中以异常水平存在的蛋白质，作为实例，例如囊性纤维症中的囊性纤维病跨膜传导调节因子(conductance regulator)(Kerem et al.，1989；Riordan et al.，1989；Rommens et al.，1989)、镰刀型细胞贫血症中的β-珠蛋白、和地中海贫血症中的α-珠蛋白、β-珠蛋白和γ-珠蛋白的任一种。如上所述，治疗性核酸分子可具有反义RNA转录本或小干扰RNA。 

在癌症的治疗中，根据本发明适用的治疗性核酸分子可以具有对应或来源于与肿瘤抑制相关的基因的序列，所述基因例如p53基因，视网膜母细胞瘤基因和编码肿瘤坏死因子的基因。大量实体瘤—癌症、乳头状瘤和疣—将可以用根据本发明的这种方法治疗。在这一点上，代表性癌症包括结肠癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、胰癌、脑癌、头颈癌和淋巴瘤。示例性乳头状瘤为鳞状细胞乳头状瘤、脉络丛乳头状瘤和喉乳头状瘤。疣病症的实例为生殖器疣、脚底疣、疣状表皮发育不良和恶性疣。 

本发明的治疗性核酸分子也可包含编码酶的DNA片段，所述酶可将无活性前药转化成一种或多种细胞毒性代谢物，使得当体内引入前药时，效应靶细胞以及可能与相邻细胞一起被迫自杀。可以是非人来源的或人来源的这些“自杀基因”的临床前和临床应用可参见综述：Spencer(2000)、Shangara et al.(2000)和Yazawa et al.(2002)。非人来源的自杀基因的实例是分别编码以下产物的基因：HSV-胸苷激酶(tk)、胞嘧啶脱氨酶(CDA)+尿嘧啶磷酸核糖基转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)、硝基还原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(phophrylase)(PNP， DeoD)、细胞色素P450(CYP4B1)、羧肽酶G2(CPG2)和D-氨基酸氧化酶(DAAO)。人来源的自杀基因的实例分别是编码以下产物的基因：羧肽酶Al(CPA)、脱氧胞苷激酶(dCK)、细胞色素P450(CYP2B1，6)、LNGFR/FKBP/Fas、FKBP/Caspases和ER/p53。 

根据本发明，治疗性核酸典型地包含在亲代细菌细胞或微细胞内的质粒上。所述质粒也可包含另外的作为调节元件起作用的核酸区段，例如启动子、终止子、增强子或信号序列，并且其可操作地连接至治疗性核酸区段。 

本发明的亲代细菌细胞或微细胞内的质粒也可包含报告基因元件。报告基因元件赋予其重组宿主易于检测的表型或特征，典型地由编码多肽产生而不是由宿主产生，当表达时，其可通过组织学或原位分析例如体内成像技术来检测。例如，根据本发明，由完整微细胞递送的报告基因元件可编码一种蛋白质，所述蛋白质在吞入宿主细胞中产生颜色或荧光变化，这些变化可通过原位分析检测，并且是转录活化的定量或半定量函数。这些蛋白质的实例为酯酶、磷酸酶、蛋白酶和其它酶类，其活性产生可检测的发色团或荧光团。 

优选的实例为大肠杆菌β-半乳糖苷酶和荧光素酶，β-半乳糖苷酶经由切割显蓝色底物、吲哚基-β-D-半乳糖苷来引起颜色改变，荧光素酶氧化长链醛(细菌荧光素酶)或杂环羧酸(荧光素)，并伴随发光。在本文中也可使用的为编码水母类生物Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因元件，见Prasher et al.(1995)。GFP-相关技术领域可通过两个公开的PCT申请来举例说明，WO 095/21191(公开了编码238个氨基酸的GFP脱辅基蛋白的多核苷酸序列，包含由氨基酸65-67形成的生色团)和WO 095/21191(公开了对A.victoria GFP的cDNA的修饰，提供了具有改变的荧光特性的肽)，还可参见Heim et al.(1994)的GFP突变体的报道，特征在于在激发强度上有4-6倍的提高。 

提供下述的实施例说明是为了更充分地理解本发明，仅仅作为举例说明。 

实施例1.亲水性癌症化疗药物阿霉素和长春碱在细菌来源的完整微细胞中的有效包装 

该实施例证明亲水性药物可被包装在细菌来源的完整微细胞的细胞质中。 

阿霉素为从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)中分离的强效抗有丝分裂的蒽环类抗生素，通常用于治疗乳癌(Henderson et al.，1989；Cowan et al.，1991；Chan et al.，1999；Paridaens et al.，2000；Norris et al.，2000)。即使已经有了紫杉烷类和其它新的药剂可以使用，阿霉素保持对肿瘤转移性疾病患者治疗的主要用药。 

在癌症化疗中，长春花碱类组成了癌症化疗中受主要关注的化学种类。先导化合物，长春碱和长春新碱已经用于临床实践超过三十年，至今仍广泛应用。长春碱通过在微管末端加帽而抑制细胞增殖，从而抑制有丝分裂的纺锤体微管运动。 

微细胞得自以前生成的鼠伤寒沙门氏菌minCDE-突变株，如在国际申请No.PCT/IB02/04632中所述，经上述梯度离心/成丝/过滤/去除内毒素过程纯化。 

通过在细胞外和细胞内区隔之间创建药物的浓度梯度来将药物包装入微细胞。药物沿该浓度梯度下移，穿过完整微细胞膜，进入微细胞的细胞质。 

用化疗药物阿霉素(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO，USA)如下包装纯化的微细胞。离心7x10⁹微细胞的BSG溶液，弃去上清液，将微细胞重新悬浮在940μl BSG和60μl的阿霉素溶液(1mg/ml，溶于无菌蒸馏水中)中。在37℃过夜旋转培养悬浮液，以允许阿霉素扩散进入微细胞的细胞质。然后通过如下的搅拌细胞超滤，洗除非特异性粘附到微细胞外表面的过量阿霉素。根据制造商的说明使用超滤膜盘片(聚醚砜；截留分子量为300kDa；Millipore)来组装Amicon搅拌式超滤器8010型(Millipore，Billerica，MA，USA)。用无菌蒸馏水洗涤细胞三次，接着再用BSG洗涤三次。然后用9ml新鲜BSG充满细胞，加入1ml已包装阿霉素的微细胞的溶液。保持细胞在10psi压力下，搅拌直到体积减少至5ml，补充(topped-off)5ml BSG。继续超滤直到体积再次减少至5ml。该补充(topping-off)/超滤操作进行6次，以彻底洗涤包装阿霉素的微细胞的外表面。在最后一次超滤期间，体积减少至1ml，将样品转移至无菌Eppendorf离心管中，然后在13,200rpm离心10分钟，沉淀包装阿霉素的微细胞。 

将包装阿霉素的微细胞放置在载玻片上，因为阿霉素固有荧光性，使用荧光显微镜观察(Leica model DM LB光学显微镜、100x放大率；Leica Microsystems，Germany)。使用Leica DC相机和Leica IM图像管理软件来捕获结果。使用适宜的 滤光片以允许观察阿霉素的自发荧光(激发波长488nm，发射波长550nm；红色荧光)。 

结果显示出所有微细胞发射亮红色荧光，表明阿霉素已经转移至微细胞的细胞质，尽管使用搅拌式细胞超滤系统进行了大量洗涤，阿霉素仍不能扩散出微细胞的细胞质。这是令人惊奇的，因为在洗涤步骤中，阿霉素的浓度梯度已经逆转，即微细胞的细胞质中的阿霉素浓度高于细胞外环境(BSG溶液)中的浓度。不用药物培养的对照微细胞不能显示出任何背景自发荧光。 

为了证实在微细胞中包装的药物不限于阿霉素，使用另一种癌症化疗药物长春碱进行类似的实验，长春碱在水中具有低溶解度。该药物不能自发荧光；因此用偶联BODIPY-FL的长春碱(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)，长春碱的荧光类似物(激发波长505nm，发射波长513nm；红色荧光)。用偶联BODIPY-FL的长春碱如下包装纯化的微细胞：首先将药物溶于甲醇中(10mg/ml的母液)，按1∶10稀释于无菌PBS中，得到1mg/ml的母液。离心7x10⁹微细胞的BSG溶液，弃去上清液，将微细胞重新悬浮在940μl BSG和60μl偶联BODIPY-FL的长春碱溶液(1mg/ml母液)。得到最终浓度为60μg药物每1ml微细胞悬液。在37℃过夜旋转培养悬液，以允许药物扩散进入微细胞的细胞质。随后经超滤洗除过量药物的步骤直至最终在BSG中重悬包装药物的微细胞的阶段，然后用荧光显微镜观察，这些与以上对阿霉素的描述相同。 

将包装药物的微细胞置于载玻片上，如上使用荧光显微镜观察，使用Leica DC相机和Leica IM图像管理软件来捕获结果。使用适当的滤光片以允许观察偶联BODIPY-FL的长春碱的红色荧光。 

结果显示所有微细胞发射亮红色荧光，表明药物已经转移至微细胞细胞质，与对阿霉素的观察相似，使用搅拌式细胞超滤系统的大量洗涤步骤没有导致药物从微细胞中流出至细胞外液。这也是令人惊奇的，因为一般观念认为仅有高亲水性溶质可经由扩散进入细菌细胞，可能是通过细菌膜的孔蛋白通道。然而，此处的结果显示出即使不是高亲水性药物也能扩散穿过无生命的细菌细胞衍生物例如微细胞的膜。没有用药物培养的对照微细胞没有显示出任何背景自发荧光。 

实施例2.疏水性癌症化疗药物紫杉醇在细菌来源的完整微细胞中的有效包装 

该实施例阐述疏水性药物可包装入细菌来源的完整微细胞的细胞质。因为微细胞表面膜由磷脂双层组成，不预期高疏水性药物将扩散穿过这一屏障。 

Taxol(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Company的注册商标)为最初从太平洋沿岸紫杉树的树皮中分离的三环双萜，最近从西方紫杉树Taxus brevifolia的针叶中也分离出紫杉醇。紫杉醇为最重要的化疗剂之一，具有有前景的抗肿瘤活性，尤其能抗卵巢癌、乳癌和肺癌(Mekhail and Markman，2002)。紫杉醇为一种抗有丝分裂剂，其以与微管蛋白异二聚体1∶1的化学计量与微管蛋白结合，稳定微管，并促进高百分比的细胞停止在G₂/M期，在细胞周期中缓慢进行而无胞质分裂，形成多核多倍体细胞，并导致细胞凋亡。紫杉醇具有0.00025mg/ml的极低的水溶性，必须溶于某些共溶剂中，例如50％Cremophore EL和50％乙醇。 

为了证实疏水性药物如紫杉醇可转移进入微细胞的细胞质，使用紫杉醇的荧光衍生物，偶联Oregon Green 488的紫杉醇(Molecular Probes，Eugene，OR，USA；吸收波长496nm，发射波长524nm)。采用两种不同的方法溶解药物：(i)溶于乙醇中(得到7.58mM母液)，和(ii)溶于乙醇：cremophore EL(1∶1 体积/体积；3.79mM母液)。将每种母液1∶10(体积/体积)稀释于PBS中，分别得到758μM和379μM的母液。将后一种母液按1∶20稀释加入微细胞悬液(10⁹微细胞)，得到偶联Oregon Green 488的紫杉醇在微细胞细胞外环境中的溶液，最终浓度分别为40μM和20μM。在37℃用药物过夜旋转培养微细胞，然后如用于阿霉素和长春碱的实施例1中的描述使用超滤法来洗涤。也如实施例1中的描述，重悬微细胞并用荧光显微法观察。 

结果显示所有微细胞发射亮绿色荧光，表明两种方法都能实现紫杉醇经由微细胞膜从细胞外环境中转移并进入微细胞的细胞质。这是令人惊奇的，因为没有预期高疏水性药物能经由微细胞的磷脂双层(疏水的)膜扩散进入微细胞的细胞溶质。另外，与在实施例1的实验中观察到的类似，在大量洗涤步骤期间渗透压梯度的逆转没有导致药物流出微细胞的细胞质。 

实施例1和2中的结果证实，上述的简单技术可用于方便地包装亲水性和疏水 性药物进入药物递送载体。 

实施例3.确定细菌来源的完整微细胞中药物浓度的方法 

该实施例证明了确定细菌来源的完整微细胞中药物浓度的方法。更具体而言，该实施例描述了确定存在于微细胞_DOX中的阿霉素浓度的方法，并证明了阿霉素浓度对加载溶液的影响。将包装药物的微细胞施用于治疗目的需要有表征包装药物实体的能力，包括确定包装药物的量。然而，以前不存在有效地破坏细菌来源的完整微细胞或细菌细胞并提取包装的药物分子的方法。 

下面使用的缩略语包括：(i)HCl；盐酸(BDH AR MERCK，Australia)，(ii) MeCN；乙腈，杀虫剂残留级(Burdick & Jackson，MI，USA)，(iii)IPA；异丙醇或2-丙醇，杀虫剂残留级(Burdick & Jackson)，MQ；MilliQ纯化的RO水(R≥10¹⁸Ω)，C18&RP18；指在色谱柱中存在的固定相填料化学性质(在这种情况下，其为键合到5微米(μm)直径硅胶颗粒的硅醇端基上的18个碳长的烃链)，(iv)HPLC & LC；高效液相色谱，(v)MS；质谱，(vi)MS/MS；碰撞诱导选定母离子片段化以产生确定的子离子(可用于消除基质效应和增加信/噪比)，(vii)ESI；电喷雾源离子化(在MS入口头部的热气流喷雾中产生离子流)。 

在终浓度为5、10、20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200和250μg/mL的阿霉素溶液中分别培养10⁹完整微细胞。在37℃过夜旋转培养混合物。在13,200rpm/5分钟离心收集微细胞，重悬在无菌BSG中。将微细胞悬液置于Amicon过滤室中(0.2μm孔大小)，共洗涤10次，每次洗涤用10ml BSG。收集微细胞，分成5x10⁸微细胞的双份，用于提取阿霉素。 

在13,200rpm离心微细胞，弃去上清液。向每个沉淀中加入500μL的97mM HCl-IPA，然后进行5轮循环的漩涡振荡1分钟并超声处理1分钟。加入MQ(500μL)，重复进行涡旋1分钟和超声处理1分钟的5次循环。在13,200rpm离心提取物5分钟以沉淀碎片，将上清液转移到HPLC 150μL玻璃插入物和小管中。因为阿霉素自发荧光，如下开发并实施对提取药物的基于HPLC荧光的分析。所述HPLC方法特征包括(i)流动相：100mM甲酸铵+0.05％三乙胺(pH＝3.5)∶MQ∶MeCN为28∶42∶30@1mL/min，(ii)固定相：Merck Lichrosphere RP18，5μm，4.0mmx250mm，(iii) 柱温：40℃，(iv)注射体积：15μL，(iv)检测：荧光激发波长480nm，发射波长550nm，(v)HPLC系统：使用Shimadzu 10AVP系统，其包含自动进样器、溶剂脱气装置、四元泵、柱加热器(40℃)和荧光检测器，运行版本7.2 SPI rev B软件。Shimadzu Corporation(Kyoto Japan)。 

同时使用HPLC和LC-MS进行阿霉素的测量以证实数据的可靠性。LC-MS操作和关键特征包括：(i)流动相：5mM甲酸铵(pH＝3.5)∶MeCN＝76∶24@0.2mL/min，(ii)固定相：Phenomenex Luna C18(2)，5μm，2.0mmx150mm，(iii)柱温：30℃，(iv)注射体积：2μL，(v)LC和MS系统：LC和MS系统都来自Thermo-Finnigan(Boston，MA，USA)。所述LC系统包含有集成了柱加热器和泵的自动进样器。柱洗脱液直接转移至Thermo-Finnigan LCQ-Deca离子阱质谱仪电喷雾离子化源，(vi) 检测：MS检测器以阳离子模式和MS/MS扫描方式工作。母离子设置在m/z＝543.9，在m/z＝396.8产生子离子。追踪子离子以用于定量目的。 

将三次荧光测定和MS结果标绘在一起(图1)，以指示它们的等价的[DOX]测定(在测量的误差棒内)。结果表明从微细胞_DOX提取的阿霉素浓度和阿霉素的外部加载浓度之间的明确的相关性。重复这些试验3次，得到类似的结果。另外，修改该技术用于测定其它包装入完整微细胞的化疗药物例如紫杉醇、依立替康、5-氟尿嘧啶和顺铂的浓度。 

实施例4.药物以及表面配体结合不引起微细胞不稳定或失去包埋的膜结构 

该实施例证明了药物在微细胞中包装和配体结合至包装药物的微细胞的表面不会引起微细胞不稳定、药物渗漏或丧失微细胞膜包埋的结构。结果是令人惊奇的，因为预期细胞质中的药物、尤其是高毒性的化疗药物将使微细胞双层膜不稳定。 

设计研究用于确定是否药物包装在微细胞中和/或双特异性配体结合至表面结构(例如LPS的O-抗原组分)将引起药物漏出和/或丧失具有双特异性配体的微细胞双层包埋的结构(例如，LPS脱落)。如上所述用阿霉素(DOX)或偶联Oregon Green488的紫杉醇(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)包装微细胞(5x10⁸)。如在实施例3中的描述，确定微细胞_DOX和微细胞_Pac中的药物浓度，结果表明，分别为425ng DOX和245ng紫杉醇。 

如PCT/US2004/041010所述构建具有抗-鼠伤寒沙门氏菌O-抗原和抗-EGFR特异性的BsAb。简而言之，通过将抗-鼠伤害沙门氏菌O-抗原的单克隆抗体(MAb)(IgG1；Biodesign)和抗靶细胞表面受体的MAb连接来构建双特异性抗体(BsAb)，所述MAb是小鼠抗人EGFR(IgG2a；Oncogene)或小鼠抗人HER2/neu受体(IgG1；Serotec)。两种抗体经由它们的Fc区域用纯化的重组蛋白A/G(Pierce Biotechnology)来交联。简而言之，将蛋白A/G(100μg/ml终浓度)加入到0.5ml的包含各自20μg/ml抗-鼠伤寒沙门氏菌O-抗原和抗人EGFR MAbs的预混溶液中，在4℃培养过夜。通过与偶联蛋白G的磁珠一起孵育并在室温下轻轻混合40分钟来除去过量抗体。在磁性分离磁珠后，在室温下，将蛋白A/G-BsAb复合物与5x10⁸包装药物的微细胞一起培养1小时，通过使O-抗原特异性Fab臂结合至表面LPS上来用抗体包被它们。使用Alexa-Flour 488 (分子探针；绿色荧光)或Alexa Fluor  594(分子探针；红色荧光)来偶联BsAb。将微细胞_DOX与偶联Alexa-Flour 488 的BsAb混合，将微细胞_Pac与偶联Alexa Fluor 594的BsAb混合。使用Leica荧光显微镜，使用100x物镜和适用于红色和绿色荧光的滤光片，观察各种微细胞制备物。 

结果表明BsAb与微细胞_DOX和微细胞_Pac表面结合很强，似乎形成环绕微细胞细胞质的完整环。在微细胞细胞质内也观察到各自的药物阿霉素和紫杉醇。如上所述从微细胞中提取药物，并确定药物浓度。与^EGFR微细胞_DOX和^EGFR微细胞_Pac相比，微细胞_DOX和微细胞_Pac中的药物浓度相同(即分别为425ng阿霉素和245ng紫杉醇)。 

使用其它的BsAbs，例如抗-O-抗原/抗HER2/neu得到类似的结果。这表明该方法与开发安全的药物递送载体相容，因为药物包装和BsAb结合没有导致载体不稳定或药物从完整微细胞漏出。 

实施例5.经过配体靶向和包装阿霉素的微细胞将阿霉素体外靶向递送至非吞噬性人脑癌细胞

该实施例证明包装在载有结合细胞表面的双特异性配体的完整微细胞中的化疗药物阿霉素，可(a)特异性结合至非吞噬性哺乳动物靶细胞表面，人脑癌细胞的EGF受体，和(b)在内吞并破坏包装阿霉素的微细胞之后，细胞内递送药物至哺乳动物 细胞内。 

如实施例1中的描述，纯化鼠伤寒沙门氏菌minCDE-来源的微细胞，并用阿霉素包装。 

如上述和美国专利申请No.10/602,021中所述以及在实施例4中简要描述，构建双特异性抗体。 

选择抗-EGFR单克隆抗体，因为待测试的靶细胞是人脑癌细胞U87-MG(ATCC，Rockville，MD，USA；人恶性星形细胞瘤上皮细胞系)，已知其在细胞表面过表达EGF受体。 

用荧光染料标记双特异性抗体，以通过荧光共聚焦显微镜能观察和跟踪靶向的微细胞。操作如下。使用Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)来标记双特异性抗体。根据生产商的说明，经过双特异性抗体的游离氨基来偶联Alexa Fluor 488染料(吸收波长494nm，发射波长519nm；绿色荧光)。 

U87-MG星形细胞瘤细胞生长于12孔组织培养板(Cellstar；Greiner Bio-One GmbH，Frickenhausen，Germany)中的15mm盖玻片上。细胞生长于含5％cosmic牛血清(Hyclone，Logan，UT，USA)和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO₂下培养。细胞生长至40％汇合，如下处理四组孔：(a)未处理的细胞作为阴性对照，(b)10⁸非靶向的空微细胞，(c)10⁸靶向的空微细胞，(d)10⁸非靶向包装阿霉素的微细胞，和(e)10⁸靶向的包装阿霉素的微细胞。8小时后终止每个样品2孔中的培养反应，24小时后终止剩余的两个样品。培养后，用PBS洗涤细胞4次，用4％甲醛固定10分钟。用PBS洗涤固定剂三次，将盖玻片翻转在含甘油的玻璃载玻片上。用1％琼脂糖密封盖玻片。 

用荧光共聚焦显微镜(Fluoview，Olympus America，Melville，NY，USA)观察载玻片。收集荧光和微分相差(differential image contrast)(DIC)图像，结果表明在8小时的培养内，靶向(载有偶联Alexa Fluor 488的双特异性抗体；绿色荧光)包装阿霉素的微细胞显示大多数细胞被几个绿色荧光点覆盖，而非靶向(缺少荧光标记的双特异性抗体)微细胞仅在非常少的细胞上显示有一些绿色荧光点。这表明双特异性抗体能特异性地使包装阿霉素的微细胞强烈粘附至星形细胞瘤细胞的表面， 这可能是经由EGF受体。共培养星形细胞瘤细胞和包装阿霉素的微细胞(靶向和非靶向)24小时后，当用红色荧光(阿霉素自发荧光是红色)观察时，结果显示出大多数星形细胞瘤细胞在细胞表面上带有强红色荧光点，并且许多细胞显示在细胞质内有扩散的红色荧光，这通过用荧光共聚焦显微镜观察跨细胞切片来确定。这一结果与未靶向的包装阿霉素的微细胞和星形细胞瘤细胞共培养24小时的结果形成对照，其中仅在少数细胞上观察到少量红色荧光点(非特异性粘附微细胞)。这表明许多包装阿霉素的微细胞已经被内化，最可能是经由EGF受体介导的内吞作用，并且表明某些微细胞已经破裂并释放阿霉素进入星形细胞瘤细胞的细胞质。该结果还进一步被确认，当绿色荧光和红色荧光图像重叠时，显示出大多数的绿色点与红色点共定位，而产生了黄色点。在星形细胞瘤细胞的细胞质内早期观察到的扩散红色荧光仍然保持红色，表明阿霉素(红色自发荧光)不再包装在微细胞(微细胞表面定位的双特异性抗体显示绿色)内，进一步提示一些已经被内吞的微细胞破裂，并释放阿霉素进入星形细胞瘤的细胞质中。 

实施例6.微细胞介导的药物递送至非吞噬性哺乳动物细胞的效率 

该实验证明微细胞介导的药物递送至非吞噬性哺乳动物细胞的效率。使用比色法细胞毒性测试(Promega；CellTiter 96 Aqueous One^TM)。用^EGFR微细胞_DOX或包含游离阿霉素和^非靶向微细胞_DOX的对照处理MDA-MB-468人乳腺癌细胞。将MDA-MB 468细胞种在5X10⁶细胞的T75烧瓶中，培养48小时，得到～1X10⁷细胞/瓶。改变培养基，用10^9 非靶向微细胞_DOx或^EGFR微细胞_DOX处理细胞。也包括游离的阿霉素(50ng/ml)作为阳性对照。细胞培养24小时，用更换PBS共3次来洗涤，用胰蛋白酶消化。在血细胞计数器中使用台盼蓝拒染法计数活细胞。将每孔1X10⁴细胞/ml等分至24-孔板中(每种处理6孔)，培养3、4、5和6天，每天改换培养基。根据制造厂家的使用说明，在每个时间点进行MTS测定。简而言之，将100μL的MTS试剂加入到每孔中，在2.5小时至4小时监测颜色变化。从每孔中取出100μL转移到96孔板中，在490nm读取吸光度。 

结果显示(图2)^EGFR微细胞_DOX的细胞毒性类似于游离阿霉素的毒性，这提示 ^EGFR微细胞_DOX递送活性形式的阿霉素至MDA细胞，药物递送的效率超过95％。 ^非靶向微细胞_DOX对癌细胞没有显示出任何毒性，表明靶向机理对于基于微细胞的药物治疗的安全性是重要的，因为非吞噬性哺乳动物细胞没有表现出非特异性内吞微细胞。 

实施例7.经由靶向和包装药物的微细胞将化疗药物阿霉素高效递送给裸鼠中人乳腺癌异种移植物 

该实施例证实了双特异性配体靶向的和包装阿霉素的完整微细胞可使人乳腺癌细胞肿瘤异种移植物退化，所述肿瘤异种移植物建立于6周龄雌性无胸腺裸鼠中。 

如上所述，从鼠伤寒沙门氏菌minCDE-突变株得到微细胞，并使用梯度离心/成丝作用/过滤/去除内毒素方法纯化。如实施例1的描述，纯化的微细胞用化疗药物阿霉素包装。 

如实施例3描述构建双特异性抗体。选择抗-EGFR单克隆抗体，因为异种移植物细胞为人乳腺癌细胞MDA-MB-468，已知其在细胞表面过表达EGF受体。 

室温下，用蛋白A/G-双特异性抗体与重组的微细胞(10¹⁰)共同培养1小时，经由抗-LPS Fab区用抗体包被微细胞。 

在该实施例中使用的小鼠购自Animal Resources Centre，Perth，WA，Australia，所有的动物试验都在符合试验动物保护和使用指南规定并经过动物伦理委员会批准进行。这些试验都在EnGeneIC Pty Ltd(Sydney，NSW，Australia)的NSW Agriculture认证的小动物设施中进行。于37℃下，在95％空气和5％CO₂的湿空气中，在T-75培养瓶中，使组织培养中的人乳腺癌细胞(MDA-MB-468，ATCC；人乳房上皮细胞；非吞噬细胞)生长至完全汇合，其中培养瓶中含有添加5％小牛血清(GIBCO-BRL Life Technologies，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)和谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI 1640培养基。使用23号针将1x10⁶细胞的50uL无血清培养基和50uL生长因子减少的matrigel(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)皮下注射入每个小鼠的肩胛骨之间。使用电子数字测径器(Mitutoyo，Japan，精确至0.001)每周测量肿瘤两次，使用公式，长(mm)x宽²(mm)X0.5＝体积(mm³)，计算平均肿瘤体积。植入后16天，肿瘤达到体积50mm³至80mm³，将小鼠随机分在7个不同的组中，每组11只。 

如下设计该试验。组1(对照)不接受处理。组2(对照)接受瘤内给予游离的阿霉素(5μg/g小鼠体重)。包含该对照组来确定游离阿霉素对肿瘤细胞的作用，并评价毒性副作用。组3(对照)与组2相同，不同在于静脉内给予阿霉素。组4(对照)接受静脉给予抗-O抗原/抗-EGFR BsAb和游离阿霉素，来显示在缺少微细胞下BsAb的影响。组5和组6分别接受静脉和瘤内给予^非靶向微细胞_DOX，以确定包装药物但非靶向的微细胞是否能使肿瘤稳定。组7和组8分别接受静脉和瘤内给予EGFR-靶向的^EGFR微细胞_DOX，以确定受体靶向的、包装药物的微细胞是否能使肿瘤稳定。包含组8来确定尾静脉给予靶向的、包装阿霉素的微细胞(该微细胞符合需要的序列事件)能否遵从实现肿瘤稳定和/或退化需要的一系列事件：即，在肿瘤部位渗透渗漏的脉管系统(肩胛骨区域)，扩散穿过肿瘤微环境，特异性结合人乳癌细胞，被细胞内吞，细胞内破坏，和将生物活性形式的负载药物释放入癌细胞的细胞质，导致细胞死亡，从而使肿瘤稳定化和/或退化。以10⁸的剂量给予微细胞，所有治疗都在异种移植物建立后17、24、27和56天给予。由对给药处理不知情的调查者进行所有测量。通过变异分析进行统计分析(ANOVA)，P＜0.05认为是统计学显著的。 

结果显示(图3)仅有用^EGFR微细胞_DOX处理中观察到高度显著的(p＝0.0004)肿瘤稳定/退化，无论静脉内给药还是瘤内给药都是如此。用^非靶向微细胞_DOX没有观察到肿瘤退化，提示BsAb-介导的靶向作用是很重要的。在第63天，用微细胞_DOX处理的组改换用^EGFR微细胞_DOX处理，以确定经由靶向治疗是否大的肿瘤体积(800mm³至1,200mm³)可退化。结果为剧烈地肿瘤退化；第79天，仅仅两种^EGFR微细胞_DOX处理，肿瘤体积退化为100mm³至150mm³。全部试验进行3次，每次都得到类似的结果。这表明BsAb-靶向微细胞能特异性递送化疗药物至体内人肿瘤异种移植物。 

结果第一次证实，通过细菌来源的完整的包装药物的微细胞，体内靶向药物递送至非吞噬性哺乳动物细胞。 

有趣的是，小鼠尾静脉给予游离的阿霉素(组3和组4)在注射部位出现严重反应，这是游离阿霉素静脉注射给人时众所周知的副作用。该反应，称为Phlebitis，被认为是药物在注射部位外渗引起的，伴有杀死局部区域的正常细胞。相反，给予靶 向或非靶向的包装阿霉素的微细胞的小鼠在注射部位没有显示出任何副反应，提示微细胞包装的阿霉素防止了游离阿霉素与注射部位的皮肤组织的反应。另外，与脂质体递送载体例如DOXIL(脂质体阿霉素)不同，药物不能从微细胞漏出。 

这些结果提示以下内容：(a)微细胞能将潜在高毒性药物如阿霉素包装在微细胞细胞质内，药物不会出现从微细胞膜漏出。因此，缺少对尾静脉注射部位的皮肤反应性(组5和7)，而使用游离阿霉素(组3和组4)可见到该反应性，(b)当将微细胞静脉或瘤内注射时，包装阿霉素的微细胞至少对裸鼠是安全的，提示本发明人以前发明(美国专利申请号PCT/IB02/04632)并在此采用的去除内毒素(脂多糖)方法足以提供基本无内毒素的微细胞剂量，这对静脉内或肿瘤内皮下给药是安全的，(c)靶向微细胞似乎足够小，可以渗透过渗漏的肿瘤新血管系统，致使包装阿霉素的微细胞进入肿瘤微环境，(d)靶向的包装阿霉素的微细胞似乎特异性结合EGF受体，已知该受体在MDA-MB-468细胞的表面过表达；在被内吞后，微细胞破坏并释放阿霉素，导致肿瘤细胞死亡并观察到肿瘤退化(组7；图3)，(e)静脉注射以后，靶向的和包装阿霉素的微细胞以实现肿瘤退化的显著浓度达到肿瘤微环境。相应地，微细胞似乎不会被循环的专门吞噬性细胞以显著量消除，从而消除观察到的治疗效果。 

实施例8.疏水性化疗药物紫杉醇经由靶向和包装药物的微细胞向裸鼠中人乳腺癌异种移植物的高效递送 

该实施例证实了疏水性化疗药物紫杉醇经由靶向和包装药物的微细胞向裸鼠中人乳腺癌异种移植物的高效递送。使用^EGFR微细胞_紫杉醇作为试验处理重复实施例7中的试验。处理包括(i)G1-仅仅肿瘤，(ii)G2-瘤内给予游离紫杉醇(400μg)，(iii)G3-静脉给予游离紫杉醇(400μg)，(iv)G4-静脉给予抗-O抗原/抗-EGFR BsAb和游离紫杉醇(400ug)，(v)G5-静脉给予^非靶向微细胞_Pac，(vi)G6-瘤内给予^非靶向微细胞_Pac，(vii)G7-静脉内给予^EGFR微细胞_Pac，(viii)G8-瘤内给予^EGFR微细胞_Pac。在第15、21、26、29和33天给予多种处理。在每次微细胞处理中使用1x10⁸微细胞。 

结果显示(图4)用^EGFR微细胞_Pac处理的小鼠中高度显著性(p＝0.0004)肿瘤稳定/退化，并且再一次证实与静脉内给予或瘤内给予无关。包括^非靶向微细胞_Pac、BsAb 和游离紫杉醇的对照处理对肿瘤生长具有可以忽略的作用。整个试验中，小鼠没有显示出任何明显的中毒征兆，如发热、昏睡、食欲降低或死亡。重复3次该试验，得到类似的结果。 

这一结果特别显著，因为其它的药物递送载体例如脂质体、纳米颗粒等不能成功地包装治疗有效量的高疏水性药物例如紫杉醇。在大多数情况下，进行尝试来改变载体或药物的化学结构以使能够包装药物，经常导致丧失生物活性。我们的结果是首次显示出不仅这样的药物易于包装在完整微细胞中，而且它们能安全地特异性递送至体内的疾病靶细胞来实现治疗作用。 

实施例9.证明基于靶向微细胞的药物递送至哺乳动物细胞的多样性 

该实施例证明：(i)靶向的包装药物的微细胞载体具有足够多样性，可以在广泛的不同的非吞噬细胞中实现治疗作用，(ii)靶向机制具有足够多样，足以能使用疾病细胞上的不同细胞表面受体靶，而不限于EGF受体，和(iii)微细胞载体自身是多样的，足以能使用来源于不同细菌属的微细胞。 

在单个裸鼠异种移植物试验中，(i)使用人卵巢癌细胞(SKOV3；ATCC.USA)建立肿瘤异种移植物，(ii)使用抗-O-抗原MAb和抗HER2/neu MAb(已知后一种受体在SKOV3细胞表面过表达)构建打靶BsAb，和(iii)用于治疗的微细胞来源于鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌minCDE-株。微细胞用阿霉素包装。^非靶向微细胞_DOX、BsAb(抗-HER2/抗-O抗原)和游离阿霉素包括在内，作为对照。 

结果显示(图5)在用鼠伤寒沙门氏菌minCDE-或大肠杆菌minCDE-来源的^HER2微细胞_DOX处理的小鼠中显著的肿瘤稳定化(p＝0.004)。SKOV3异种移植物比MDA-MB-468异种移植物生长快得多，该试验仅能在建立异种移植物后持续31天，因为对照动物已经达到死亡点或处以安乐死。 

这些结果证实(i)完整微细胞可用于体内递送药物至广泛的不同的非吞噬性哺乳动物细胞，(ii)完整微细胞载体可靶向至在疾病细胞上发现的多样范围的细胞表面受体，和(iii)微细胞可来源于不同的细菌属或种，然而以相似方式起作用，特别是对于药物递送至体内靶向细胞来说。 

实施例10.靶向、包装药物的微细胞剂量和对裸鼠中人肿瘤异种移植物治疗作 用之间的相互关系 

该实施例证实包装药物的微细胞的剂量-效应关系。更具体而言，该实施例显示，为实现对裸鼠中人肿瘤异种移植物的最大治疗作用所需要的、靶向的、包装药物的微细胞的剂量。 

在Balb/c nu/nu小鼠肩胛骨之间建立MDA-MB-468(人乳腺癌)细胞作为异种移植物。如实施例3所述，使用两种不同的外部阿霉素浓度60μg/ml和200μg/ml，用阿霉素包装鼠伤寒沙门氏菌minCDE-来源的微细胞。纯化微细胞_DOX(实施例1)，并通过HPLC分析试样，来确定包装入10⁸微细胞的阿霉素浓度。结果显示外部阿霉素浓度为60μg/ml和200μg/ml情况下，10⁸微细胞分别包装85ng和660ng阿霉素。 

然后将微细胞_DOX靶向至EGFR，其中EGFR在MDA-MB-468细胞上过表达，制备六种不同的小鼠静脉注射剂量，(i)G1-10^8 EGFR微细胞_DOX，载有总量660ng的阿霉素，(ii)G2-10^8 EGFR微细胞_DOX，载有总量85ng的阿霉素，(iii)G3-10^7 EGFR微细胞_DOX，载有总量66ng的阿霉素，(iv)G4-10^7 EGFR微细胞_DOX，载有总量8.5ng的阿霉素，(v)G5-10^6 EGFR微细胞_DOX，载有总量6.6ng的阿霉素，和(vi)G6-10^6 EGFR微细胞_DOX，载有总量0.85ng的阿霉素。建立肿瘤体积为50mm³至80mm³的异种移植物后，静脉给予小鼠不同剂量。如前所述测量肿瘤体积。 

结果显示(图6)微细胞剂量和治疗效果之间的明确关系。就肿瘤稳定/退化来说，10^8 EGFR微细胞_DOX比10^7 EGFR微细胞_DOX更加有效，依次又比10^6 EGFR微细胞 _DOX更加有效。有趣的是，在向组3和组4(分别为6.6ng和8.5ng)与组5和组6(66ng和85ng)给予的微细胞之间阿霉素浓度没有较大差异。然而，G4中的处理比G3中的处理更有效，类似地，G6中的处理比G5中的处理更有效。这提示在该试验中分析的微细胞和药物浓度的范围内，相对于微细胞内载有的药物浓度，治疗效果与微细胞的数量更相关。 

特别地，本发明涉及以下技术方案。 

1.组合物，其包含(i)含有药物分子的完整微细胞和(ii)其药学上可接受的载体。 

2.1的组合物，其中所述组合物含有每10⁷微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞。 

3.1的组合物，其中所述组合物含有每10⁸微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞。 

4.1的组合物，其中所述组合物含有每10⁹微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞。 

5.1的组合物，其中所述组合物含有每10¹⁰微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞。 

6.1的组合物，其中所述组合物含有每10¹¹微细胞少于约1个污染的亲代细菌细胞。 

7.组合物，其基本上由含药物分子的完整微细胞组成。 

8.靶向药物递送方法，其包括使双特异性配体接触(a)含药物分子的细菌来源的微细胞和(b)哺乳动物靶细胞，使得(i)所述双特异性配体引起所述微细胞结合至所述哺乳动物细胞，(ii)所述微细胞被所述哺乳动物细胞吞入，和(iii)所述药物被释放入所述哺乳动物细胞的细胞质。 

9.8的方法，其中所述哺乳动物靶细胞为非吞噬性细胞。 

10.8的方法，其中所述双特异性配体包含多肽或糖或糖肽。 

11.8的方法，其中所述双特异性配体包含第一臂和第二臂，第一臂载有对细菌来源的微细胞表面结构的特异性，第二臂载有对非吞噬性哺乳动物细胞表面受体的特异性。 

12.11的方法，其中所述第一臂和所述第二臂是单一特异性的。 

13.11的方法，其中所述第一臂和所述第二臂是多价的。 

14.11的方法，其中所述微细胞表面结构是所述微细胞表面上的脂多糖中的O-多糖组分。 

15.11的方法，其中所述微细胞表面结构选自外膜蛋白、菌毛、纤毛、鞭毛和细胞表面暴露的糖。 

16.11的方法，其中所述哺乳动物细胞表面受体能活化所述微细胞的受体介导的内吞作用。 

17.8的方法，其中所述双特异性配体包含抗体或抗体片段。 

18.8的方法，其中所述双特异性配体包含人源化抗体。 

19.8的方法，其中所述微细胞包含完整的细胞壁。 

20.8的方法，其中所述药物为化疗剂。 

21.8的方法，其中所述哺乳动物细胞在体外。 

22.8的方法，其中所述哺乳动物细胞在体内。 

23.8的方法，其中所述药物编码在所述微细胞内含有的质粒上。 

24.23的方法，其中所述质粒包含调节元件。 

25.23的方法，其中所述质粒包含报告元件。 

26.药物递送方法，其包括使包含药物的细菌来源的微细胞与哺乳动物细胞接触，所述哺乳动物细胞有吞噬作用或有胞吞作用的能力，使得所述微细胞被所述哺乳动物细胞吞入，且所述药物释放入所述哺乳动物细胞的细胞质。 

27.26的方法，其中所述微细胞包含完整的细胞壁。 

28.26的方法，其中所述药物是化疗剂。 

29.26的方法，其中所述微细胞在体外。 

30.26的方法，其中所述微细胞在体内。 

31.26的方法，其中所述药物编码在所述微细胞内含有的质粒上。 

32.31的方法，其中所述质粒包含调节元件。 

33.31的方法，其中所述质粒包含报告元件。 

34.用药物负载微细胞的方法，其包括在含所述微细胞的细胞外介质和微细胞细胞质之间创建浓度梯度的步骤，使得所述药物沿所述浓度梯度下移，进入微细胞的细胞质。 

35.用药物负载微细胞的方法，包括步骤： 

a)在一定条件下培养能产生微细胞的重组亲代细菌细胞，使得所述亲代细菌细胞转录并翻译编码所述药物的治疗性核酸，使得所述药物释放入所述亲代细菌细胞的细胞质，然后 

b)允许所述亲代细菌细胞形成一个或多个微细胞，其中所述微细胞在其细胞质中含所述药物。 

36.用药物负载微细胞的方法，包括在一定条件下培养含有编码所述药物的治疗性核酸的重组微细胞的步骤，使得所述的编码所述药物的治疗性核酸在所述微细胞内转录并翻译。 

37.组合物，包含(i)含药物分子的细菌来源的微细胞和(ii)双特异性配体，其能与所述微细胞的表面组分和非吞噬性哺乳动物细胞的表面组分结合。 

38.细菌来源的完整微细胞和双特异性配体在制备药物中的用途，所述微细胞含药物分子且所述双特异性配体能结合至所述微细胞和非吞噬性哺乳动物靶细胞，通过将所述药物施用于细胞、组织或器官，所述药物用于治疗疾病或改善性状的方法。 

                            引用的出版物 

本申请经引用并入以下出版物的每一种： 

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