一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用

摘要

本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用。表面展示型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。制备方法：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F1/R1进行PCR；PCR产物与质粒pBT3连接，连接液转化大肠杆菌，即为即得表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株。所述序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。本发明所得疫苗的制备非常简单，无需任何提取、纯化、灭活过程，并且在使用中无需任何佐剂。

说明书

技术领域

本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用。

背景技术

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)为革兰氏阴性菌，属于爱德华氏菌属。该菌是一种条件性人/鱼共患病原菌，能够感染人类和多种鱼类，后者包括牙鲆、大菱鲆、真鲷、罗非鱼等。迟缓爱德华氏菌是世界性鱼类重要病原，每年给水产养殖业造成极大的经济损失。在我国以及许多其它国家，迟缓爱德华氏菌病防治主要依赖抗生素类药物的使用。然而，抗生素类药物的大量应用已导致多种不良后果，包括环境污染和耐药菌株的产生等。由于疫苗具有安全、环境友好等特点，因此已成为公认的病害防控主要方法。目前，由于各种原因，迟缓爱德华氏菌疫苗大多处于实验室研究阶段，实际应用于产业的疫苗极少。因而，高效、适于产业化的迟缓爱德华氏菌疫苗亟待开发。

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗：表面展示型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的制备方法：菌株DH5α/pSA1的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1和R1为引物进行PCR扩增，PCR产物用NdeI/XhoI双酶切回收2.3kb，待用；而后将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.5kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α得菌株DH5α/pSA1，即得表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株；

所述引物为F1：5’-GATCATATGGCAGATGGTTTCGTAGTGA-3’和R1：5’-AGTACTCTCGAGCCAGGTTTTACCGATATTA-3’。

迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的应用：所述序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。

将所述序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株经LB培养基培养至OD₆₀₀为0.8-1后悬浮于PBS缓冲液中至终浓度为1x10⁸cfu/ml，所得的疫苗制备液具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。

本发明具有如下优点：

1.制备简单。本发明的疫苗抗原只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。

2.高保护效应。本发明所得疫苗保护效应可达80％以上。

附图说明

图1为本发明实施例提供的疫苗蛋白于细菌外膜的表面展示图。(其中，Western Blot分析DH5α/pSA1的外膜蛋白。泳道1，分子量marker；泳道2，DH5α/pSA1；泳道3，阴性对照(DH5α/pBT 3)。箭头所指为疫苗蛋白。)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

迟缓爱德华氏菌疫苗，由序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示(参见序列表1)。

序列表1

ATGGCGATGAAAAAGTTGCTCTTAGCGTCGCTGCTGTTTGGCAGCGCAACCGTATACGGTGCAGATGGTTTCGTAGTGAA

AAATATTCATTTCGAAGGACTGCAGCGGGTCGCCGTCGGTGCGGCGTTACTTAACATGCCGGTACGCGTAGGCGATACCG

TCTCTGATGAGGATCTGAGTAATACCATCCGCGCGCTGTACGCCACCGGTAACTTTGAGGATGTGCGGGTACTGCGTGAT

GGTAACAATCTGATTGTGCAGGTTAAGGAACGCCCGACGATCGCCAGCATTACCTTCTCTGGCAACAAGTCAGTGAAGGA

CGAGATGCTAAAGCAGAACCTGGAGGCCTCCGGGGTTCGCGTCGGCGAGGCGCTCGATCGCACCACGTTATCCAGCATTG

AAAAAGGGCTGGAGGATTTCTACTACAGCGTCGGTAAATACAACGCCACCGTGAAGGCCGTTGTTACACCGCTGCCGCGC

AATCGCGTCGATCTGAAGCTGGTGTTTACCGAGGGTAAATCGGCGCAGATCCAGCAGATTAATATCGTCGGCAACCATGC

GTTCAGCAGCGCCGAGCTGCTGGGGCACTTCCAGCTGCGCGACGATGTACCGTGGTGGAACCTGATGGCCGATCGCAAAT

ACCAGAAGCAGAAGCTGGCCGGCGACCTTGAGGCGCTGCGCAGCTACTATCTGGATCGCGGCTACGCGCGTTTCGCCATT

AATTCGACGCAGGTGAGCCTGACGCCGGATAAGAAAGGGATCTACATCACCATCAACATCACCGAAAGCGAGCAGTATAA

GCTGGAGGGGGTGGACGTCACCGGCAATATGGCCGGCTACAGCGCCGAGATCACCCGCTTGACCAAGGTAGAGCCGGGTG

AGCTGTATAACGGCGCCAAGGTCACCAAGATGGAAGATGAGATCAAGCAGCTGCTGGGGCGCTATGGCTATGCCTACCCG

TGCGTACAGACGCAGCCGGAGATCAATGACAAGGACAAGACCGTTGTCCTGCACATGAATATCGATGCCGGTAACCGCTA

CTATGTGCGTCAGATCCGCTTTGTCGGCAACGACACCAGCAAAGACGCCGTACTGCGCCGTGAGATGCGCCAGATGGAAG

GCTCTTGGCTGGGCAGCGACCAGGTCGAGCAGGGGAAAGAGCGTCTGAACCGTACCGGTTACTTTGAGAACGTCGACGTG

GAGACCCAGCGCGTACCCGGTACGCCGGATCAGGTTGATGTTATCTATAAGGTGAAAGAGCGTAATACCGGCAGCTTTAA

CTTCGGTATCGGCTACGGCACCGAAAGCGGCGTCAGCTTCCAGGTCGGGGTGCAGCAGGATAACTGGCTGGGCACCGGCA

ACGTGGTGGCGATCAACGGCACCAAGAACGACTACCAGACCTACGCCGAGCTGTCGCTGACCGATCCGTACTTTACGGTG

AACGGCGTCAGCCTGGGCGGCCGACTGTTCTATAACGACTTTAAGGCCAACGACGCCGATCTGTCTGACTATACCAACAG

CAGCTATGGCTTTGACGGCACCCTGGGCTTCCCGATCAACGAGAACAACTCGCTGCGCACCGGCCTGGGCTATGTACACA

ACGACCTGTCCGACATGCAGCCGCAGGTGGCGATGTGGCGCTATCTGCGCTCCGTGGGTCAGAATCCGAGCGATAGCCAG

CGCGCCAGCTACAAGGCCGATGACTATACCTGGACCGCCGGCTGGGCCTACAACAACCTGGACCGCGGCTTCTTCCCGAC

GGCCGGTAGCAAGGCCTCGCTGAACGGTAAGATCACGCTGCCGGGCTCCGACAACGAATACTACAAGCTGACTTTCGACA

GCCAGAGCTATTTCCCGATCAACCAGGATCGTACCTGGGTGGTGCTGGGACGTACCCGCCTGGGCTACGGTAACGGCTTC

GGCGGCAAAGAGATGCCGTTCTATGAGAACTTCTACGCCGGTGGCTCTGGTACCGTACGCGGCTTCCAGTCCAATAACAT

CGGTCCGAAGGCGGTGTACCTGAACGGCGATGGCAGCGTGGATCAGAGCAAGACCGGCGACAACGACGCGGTGGGCGGTA

ACGCCATGGCGGTCGCCAGCCTGGAGCTGATCACCCCGACGCCGTTCGTCAGCGAGCAGTATGCCAACTCTCTGCGCACC

TCCGTCTTTATGGATGCCGGTACCGTATGGGATACCAACTGGGATCAGGCCGCCTACCCGACGCTGCCGGACTACAGCAA

GGCGACCAACGTGCGTCTGTCGGCCGGTATCGCGCTGCAGTGGATGTCGCCGCTGGGGCCGCTGGTGTTCTCCTATGCCC

AGCCGGTCAAGAAGTATGAGGGCGATAAGGCGGAGCAGTTCCAGTTTAATATCGGTAAAACCTGGTAA

(a)序列特征：

●长度：2388bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：迟缓爱德华氏菌TX1

(f)特异性名称：SA1

空间结构分析表明SA1是外膜蛋白，其碱基1-23构成一个信号肽，碱基24-421构成5个重复性抗原N端可变区(Surf_Ag_VNR)，碱基448-795构成一个细菌表面抗原功能域(Bac_Surf_Ag)。

实施例2

表面展示型迟缓爱德华氏菌疫苗的构建方法：

菌株DH5α/pSA1的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，50℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，60℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后用NdeI/XhoI双酶切回收2.3kb，待用；而后将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.5kb片段，所述质粒pBT3构建过程参见Zhang W，Sun K，Cheng S，Sun L.Characterization of DegQ_Vh，a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008；74：6254 62.；将上述回收两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml Ap的LB固体培养基上培养24小时，挑取1个转化子，命名为DH5α/pSA1。将DH5α/pSA1在含有100ug/ml Ap的LB培养基中过夜培养，提取质粒，用引物F2(5’-ACGGTGCAGATGGTTTCGTAG-3’)测序，结果表明DH5α/pSA1含有序列表SEQ ID No.1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列。Western Blot分析(具体方法参见Zhang W，Sun K，Cheng S，Sun L.Characterization ofDegQ_Vh，a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008；74：6254 62.)表明，DH5α/pSA1中具序列表SEQ ID No.1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列的疫苗蛋白展示在细胞表面(图1)。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。

所述引物为F1：5’-GATCATATGGCAGATGGTTTCGTAGTGA-3’和R1：5’-AGTACTCTCGAGCCAGGTTTTACCGATATTA-3’。

实施例3

迟缓爱德华氏菌疫苗的应用

步骤1)疫苗制备液以及疫苗对照液的制备。将上述所得疫苗表达菌株DH5α/pSA1在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0.1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速180rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.8-1，而后将培养液离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁸cfu/ml，即为疫苗制备液。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％ NaCl，0.02％ KCl，0.358％Na₂HPO₄.12H₂O，0.024％ NaH₂PO₄。

步骤2)疫苗的免疫注射。将50条牙鲆(每条重约9.1g)随机分为2组，每组25条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)疫苗制备液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ulPBS。

步骤3)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD₆₀₀为0.7，然后离心(5000g，4℃，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁷cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。

步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第60天，用上述步骤3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，4条；B组，24条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：

RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)

由此得出DH5α/pSA1中具序列表SEQ ID No.1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列的疫苗蛋白针对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率为83.3％。

因此，DH5α/pSA1中具序列表SEQ ID No.1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列的疫苗蛋白能够高效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。