一种GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片

摘要

本发明公开了一种GSTP1基因突变检测液相芯片，主要包括有：由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物是：针对A313G突变位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、和针对C341T突变位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明所制备的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种GSTM1、GSTT1和GSTP1基因检测液相芯片。

背景技术

谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S transferases，GSTs)是一个多功能的二相代谢酶家族，主要催化GSH(还原型谷胱甘肽)与亲电子化合物间的结合反应，使后者失去结合机体DNA的活性，它是细胞抗损伤，抗癌变的主要解毒系统。另外，GSTs还可以和一些配体如胆红素、甾族化合物等结合，参与人体的生理反应。肿瘤细胞通过表达GSTs来保护自身不受化疗药物的伤害，而基因突变可改变GSTs的活性，从而改变药物的药动力学特征。近年来，GSTs与肿瘤和化疗、GSTs与其他严重疾病之间的关系已引起了研究者的注意。

按照染色体定位和序列同源性，迄今为止，已发现了8种GSTs，研究较多的主要有GSTM，GSTP，GSTT亚家族。其中，谷胱苷肽S转移酶M1(GSTM1)定位于染色体1P13.3，主要对多环芳烃类，乙烯环氧化物，苯乙烯等的中间产物进行代谢，存在GSTM1a、GSTM1b和null三个等位基因，null等位基因即整个基因的缺失，其个体在肝脏中不能表达GSTM。GSTM的null基因型在不同种族人群中的频率范围变动很大，非洲人为23％～48％，亚洲人为33％～63％，欧洲人为39％～62％，美国人群为23％～62％。此外，谷胱苷肽S转移酶T1(GSTT1)基因缺失也是研究的热点。人谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)是细胞内降解生物异源物质的一组超家族同工酶GSTs中的一个重要的亚型，能催化谷胱甘肽与亲电子物质发生反应，在肺脏中的含量尤其丰富，是肺脏中重要的解毒酶，对芳香族化合物具有较高降解性，在预防肿瘤发生的过程中起重要作用，但同时也是肿瘤细胞对化疗药物耐受的原因，研究表明，GSTP1基因的多态性位点A313G和C341T与肿瘤的耐药性相关。

目前对GSTM1、GSTT1和GSTP1多态性的检测产品一般是基于PCR技术的多重PCR、PCR-RFLP、实时荧光定量PCR和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种GSTP1基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测GSTP1基因两种常见基因型A313G和C341T的野生型和突变型。

实现上述目的的技术方案如下：

一种GSTP1突变检测液相芯片，主要包括有：

(A)针对GSTP1基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对A313G突变位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、和针对C341T突变位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)用于扩增出具有A313G和/或C341T的突变位点的GSTP1基因目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28。

进一步地，本发明还提供了一种除GSTP1基因外，还包括GSTM1和/或GSTT1基因突变检测的液相芯片，其具体组成如下：

(A)还包括有针对GSTM1和/或GSTT1基因的缺失区域，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对GSTM1基因缺失区域的SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8、和/或针对GSTT1基因缺失区域的SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10；相应的所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；

(B)还包括有分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)还包括有用于扩增出具有GSTM1和/或GSTT1的突变区域的目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为：针对GSTM1基因突变位点的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、和/或针对GSTT1基因突变位点的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。

优选地，所述间隔臂序列为5-10个T。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的液相芯片，其与测序法得到的检测结果吻合率高达100％。所制备的GSTP1基因突变检测液相芯片，以及GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片都具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。

3.本发明的所述液相芯片的检测方法步骤简单，四种基因多态性(包括两种缺失型和两种单核苷酸突变型)检测可通过一步多重PCR即可完成的目标序列的扩增(如果GSTM1、GSTT1为基因缺失纯合子，则没有扩增条带)，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。

4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

实施例1

GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性检测液相芯片，主要包括有：

一、ASPE引物

针对GSTM1和GSTT1基因缺失型、GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val，rs1695)和C341T突变(Ala114Val，rs1138272)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：

表1ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的6种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

选择的六种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

三、扩增出目标检测序列的引物

针对GSTM1和GSTT1基因缺失型、GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val，rs1695)和C341T突变(Ala114Val，rs1138272)，利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出目标序列，当GSTM1和GSTT1基因为缺失型纯合子，则没有相应扩增条带，当GSTM1和GSTT1为缺失型杂合子或野生型的时候，则有相应的扩增条带。

表3扩增出具有多态性位点的目标序列的引物

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

实施例2运用GSTM1、GSTT1和GSTP1基因检测液相芯片对样本的检测

所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

2×Tm杂交缓冲液

  试剂  来源  终浓度  每250ml的用量  1MTris-HCl，pH8.0  SigmaT3038  0.2M  50ml  5MNaCl  Sigma S5150  0.4M  20ml  Triton X-100  Sigma T8787  0.16％  0.4ml

过滤后贮存于4℃。

ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的DNA提取：

参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

二、待测样品的PCR扩增

利用Primer5.0设计四对引物，多重PCR一步扩增出分别含有GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val，rs1695)和C341T突变(Ala114Val，rs1138272)的目标序列，产物大小分别为315bp和269bp；针对GSTM1和GSTT1基因缺失型，当GSTM1和GSTT1基因为缺失型纯合子，则没有相应扩增条带，当GSTM1和GSTT1为缺失型杂合子或野生型的时候，则有相应的扩增条带，产物大小分别为219bp和511bp，引物序列(SEQ ID NO.21-28)见上述表3所示。

首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.21-28的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

2×缓冲液(含Mg²⁺)                 25ul

dNTP(各2.5mmol/L)                 4ul

Taq酶(5U/ul)                      0.2ul

多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL)   6ul

模板DNA(10ng/ul)                  2ul

ddH₂O                             12.8ul

                                              

共                                50ul

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。

三、PCR产物的酶切处理

1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；

2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。其中，ASPE引物分别为：

ASPE反应的体系如下：

10×缓冲液                2ul

MgCl₂(50mmol/L)           0.5ul

Biotin-dCTP(400umol/L)    0.25ul

dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)    1ul

Tsp酶(5U/ul)                           0.25ul

混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)      1ul

酶切处理的PCR扩增产物                  5ul

ddH₂O                                  10ul

                                                  

共                                     20ul

反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

五、杂交反应

1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×10⁵个/ml)；

2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

3.微球于≥10000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH₂O；

6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50ul；

7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

10.微球于≥3000g离心2-5min

11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

六、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。

针对GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val)和C341T突变(Ala114Val)，对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：

1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；

2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；

3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：

突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)

4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。

针对GSTM1和GSTT1基因缺失型，当NET MFI值小于100，GSTM1和GSTT1基因为缺失型纯合子；当NET MFI值大于100，GSTM1和GSTT1为缺失型杂合子或野生型。

使用本方法检测20份样本的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因的多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。其中，GSTP1阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片能够准确地检测出GSTM1、GSTT1和GSTP1基因类型，且结果稳定可靠。

表4样本检测结果(MFI)

表5样本GSTM1、GSTT1和GSTP1基因

表6样本GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变类型分析结果

实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变的检测

一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)

以GSTP1基因A313G位点突变检测液相芯片为例，分别针对A313G的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.20。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表7液相芯片制备的设计

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：

表8样本检测结果与基因多态性分析

其它针对不同的多态性目标检测位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，而ASPE引物选用实施例2中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳，具体数据省略。

实施例4不同的ASPE引物的液相芯片对GSTM1、GSTT1基因多态性的检测

一、液相芯片制备的设计(GSTM1、GSTT1基因缺失检测特异性引物序列的选择)

以GSTM1和GSTT1基因缺失检测液相芯片为例，ASPE引物5’端的Tag序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；分别针对GSTM1和GSTT1基因缺失区域设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，其中，针对GSTM1基因缺失的特异性引物序列选自SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8，针对GSTT1基因缺失的特异性引物序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10，具体设计如下表(表9)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表9液相芯片制备的设计

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：

表10样本检测结果与基因多态性分析

表11样本检测结果与基因多态性分析

其它针对GSTM1、GSTT1基因缺失的液相芯片，ASPE引物运用不同的特异性引物序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。