土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法

摘要

本发明主要涉及微生物的菌剂制备方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌三菌组合的液体菌剂的制备方法。一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂，其主要特点在于由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3770；所述的胶冻样芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3769；所述的圆褐固氮菌的保藏号为CGMCC No.3768。本发明的优点是用食品行业产生的废液为原料，生产过程无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源，其液体菌剂，既可用于有机废水净化剂，又可作为微生物肥料和微生物饲料。

说明书

技术领域：

本发明主要涉及微生物的菌剂制备方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌三菌组合的液体菌剂的制备方法。 

背景技术：

传统的微生物液体菌剂的制备方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、维生素，无机盐和水配制成液体培养基，从试管斜面菌种上刮取菌苔接种在液体培养基中，经好氧或厌氧培养制备成液体菌剂，其缺点是：所用原料成本高，生产工艺复杂，不能节约能源。 

混合菌剂传统做法，是将各种不同的菌种(好氧和厌氧)在各自不同的生长环境中培养菌种，然后从每个菌种的培养物中刮取菌苔制取每个菌的液体菌悬液，再转种于各自的液体培养液经通气或厌氧发酵培养后离心制取活性细胞菌，将沉淀物喷雾干燥制成粉剂，制成多菌的混合。其缺点是：制备工艺复杂，发酵周期长，成本高，应用受到限制。 

发明内容：

本发明的目的在于避免现有微生物液体菌剂生产技术不足之处而提供一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法。使用巨大芽孢杆菌与胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌科学配伍，以新鲜豆腐或粉丝或玉米或洋芋淀粉产生的废水为原料，添加少量无机盐制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂。 

本发明的目的可以通过采用以下技术方案实现：一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂，其主要特点在于由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、圆褐固氮菌(Azotobacter  chroococcum)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3770；所述的胶冻样芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3769；所述的圆褐固氮菌的保藏号为CGMCC No.3768。 

所述的土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂，所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 7.2-7.5。 

一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法，其主要特点在于有如下步骤： 

A.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： 

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至7.0-7.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； 

b.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌菌种的培养：分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌一级菌种； 

B.所述土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： 

a.琼脂斜面培养基的制备：磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，氯化纳0.01-0.03％，碳酸钙0.4-0.6％，甘露醇0.8-1.2％，硫酸钙0.08-0.12％，琼脂1.8-2.2％，水80-120毫升，加热溶解用1％的氢氧化纳调pH值6.8-7.0，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下，分装于15×1.5cm干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； 

b.土著益生圆褐固氮菌菌种的培养：取土著益生圆褐固氮菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃，48-32h，即得琼脂斜面菌种，为圆褐固氮菌一级菌种； 

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养： 

a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 7.0-7.5，分装于 500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用； 

b.分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种； 

c.分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种； 

d.分别将重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌为5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合菌剂，即为四级菌种，然后继续逐级扩大培养。 

一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂在农作物和植物生长剂的应用。 

利用巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，配伍圆褐固氮菌三菌组合制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌菌剂，三菌的科学配比和独特的发酵工艺，使其在生长过程中产生的有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基料和原料，通过三菌相互间的这种共生增殖关系，形成了一个复杂而稳定的微生态系统，发挥了多功能的优势。 

巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌三菌在新鲜的豆腐、粉丝、玉米、洋芋淀粉产生的废水中，添加少量的无机盐，直接发酵制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌菌剂，既节省了培养基的原料，减少原料配制和高压灭菌的工序，节省了能源，也解决了这些行业治污的难题，是一项变废为宝，一举多得的生物技术。 

土著益生巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌是在暗灰钙土、淡灰钙土、红粘土和盐碱土四种不同土壤类型多种植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm深层土壤中的266个样品分离培养所得的3868株，经筛选优育后，经紫外线和亚硝基胍(NTG)诱变和反复驯化培养又经生物化学、形态学鉴定获得优良菌株。2010年04月26日，在中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(LJP-106)菌种保藏号为CGMCC No.3770，胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)(LJK-35)菌种保藏号为CGMCC No.3769，圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)(LGN-09)菌种保藏号为CGMCC No.3768，三种菌能在同一条件下，同一发酵时间，完成各自的生长功能，起到菌种间的互补作用。圆褐固氮菌可利用空气中的 氮转化成微生物生长所用的氮素，巨大芽孢杆菌和胶冻样芽胞杆菌能将有机物中生物难以利用的磷元素、钾元素转化成易吸收的营养元素、由于多菌的协同作用，明显提高了对有机废水的利用率和菌细胞数量的增加，从而产生大量的被植物和动物吸收利用的生物活性酶，生物激素和有益的生长因子。这一生物代谢过程即降解了废水中的有机物又以废水为液体培养基制备了巨大芽胞杆菌、胶冻样芽胞杆菌和圆褐固氮菌组合的微生物菌剂。 

本发明的有益效果：本发明利用食品行业产生的废液为原料，生产过程无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源，其液体菌剂，即可用于有机废水净化剂，又可作为微生物肥料和微生物饲料。 

附图说明：

图1为本发明的制备工艺流程示意图； 

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明： 

实施例1：一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂，由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3770；所述的胶冻样芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.3769；所述的圆褐固氮菌的保藏号为CGMCC No.3768。 

所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 7.2-7.5。 

实施例2：见图1，一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法，其有如下步骤： 

A.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： 

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至7.0-7.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； 

b.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌菌种的培养：分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为巨大芽孢杆菌、胶 冻样芽孢杆菌一级菌种； 

B.所述土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： 

a.琼脂斜面培养基的制备：磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，氯化纳0.01-0.03％，碳酸钙0.4-0.6％，甘露醇0.8-1.2％，硫酸钙0.08-0.12％，琼脂1.8-2.2％，水80-120毫升，加热溶解用1％的氢氧化纳调pH值6.8-7.0，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下，分装于15×1.5cm干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； 

b.土著益生圆褐固氮菌菌种的培养：取土著益生圆褐固氮菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃，48-32h，即得琼脂斜面菌种，为圆褐固氮菌一级菌种； 

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养： 

(1)试管液体菌种的培养，取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH₄)₂SO₄ 0.1g，H₃PO₄ 0.05ml，充分溶解后调节PH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌一级菌种于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(二级菌种)。 

(2)三角烧瓶液体菌种的培养： 

取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH₄)₂SO₄ 1g，H₃PO₄0.5ml，充分溶解后调节PH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(三级菌种) 

(3)液体扩大培养生产菌种 

取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH₄)₂SO₄ 10g，H₃PO₄ 5ml，充分溶解后调节PH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将三级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为四级菌种。 

(4)取四级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜豆腐废水不灭菌，将重量百分比为55％的巨大芽孢杆菌、35％的胶冻样芽孢杆菌和10％的圆褐固氮菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其发酵液即为巨大芽孢杆菌、 胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液，活细胞数为1.0～2.0×10¹⁰个/ml； 

(5)根据需要可逐级扩大产量。 

实施例3：见图1，一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法，其有如下步骤：步骤A-B与实施例2相同， 

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养： 

(1)试管液体菌种的培养，取新鲜粉丝废水100ml，加入(NH₄)₂SO₄ 0.1g，H₃PO₄ 0.05ml，充分溶解后调节PH至7.0～7.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌一级菌种于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(二级菌种)。 

(2)三角烧瓶液体菌种的培养： 

取新鲜粉丝废水1000ml，加入(NH₄)₂SO₄ 1g，H₃PO₄ 0.5ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(三级菌种)。 

(3)液体扩大培养生产菌种： 

取新鲜粉丝废水10000ml，加入(NH₄)₂SO₄ 10g，H₃PO₄ 5ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将三级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为四级菌种。 

(4)取四级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为65％的巨大芽孢杆菌、30％的胶冻样芽孢杆菌和5％的圆褐固氮菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液，活细胞数为0.8～1.8×10¹⁰个/ml； 

(5)根据需要可逐级扩大产量。 

实施例4：一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法，其有如下步骤：步骤A-B与实施例2相同， 

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养： 

(1)试管液体菌种的培养，取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清 液100ml，加入(NH₄)₂SO₄ 0.1g，H₃PO₄ 0.05ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌一级菌种于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(二级菌种)。 

(2)三角烧瓶液体菌种的培养： 

取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH₄)₂SO₄ 1g，H₃PO₄ 0.5ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(三级菌种)。 

(3)液体扩大培养生产菌种： 

取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH₄)₂SO₄10g，H₃PO₄ 5ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将三级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为四级菌种。 

(4)取四级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为60％的巨大芽孢杆菌、32％的胶冻样芽孢杆菌和8％的圆褐固氮菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液，活细胞数为1.2～2.2×10¹⁰个/ml； 

(5)根据需要可逐级扩大产量。 

实施例5：见图1，一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法，其有如下步骤：步骤A-B与实施例2相同， 

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养： 

(1)试管液体菌种的培养，取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH₄)₂SO₄ 0.1g，H₃PO₄ 0.05ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌一级菌种于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(二级菌种)。 

(2)三角烧瓶液体菌种的培养： 

取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH₄)₂SO₄ 1g，H₃PO₄ 0.5ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(三级菌种) 

(3)液体扩大培养生产菌种： 

取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH₄)₂SO₄10g，H₃PO₄ 5ml，充分溶解后调节pH至7.0～7.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将三级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为四级菌种。 

(4)取四级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为60％的巨大芽孢杆菌、35％的胶冻样芽孢杆菌和5％的圆褐固氮菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液，活细胞数为1.2～2.2×10¹⁰个/ml； 

(5)根据需要可逐级扩大产量。 

实施例6：一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂在农作物和植物生长剂的应用。 

本发明液体菌剂在以灰钙土和盐碱土为试验土壤的试验效果： 

用苜蓿种籽做盆栽试验，经三次重复其结果见表1、表2、表3、表4和表5： 

表1 

  项目   试验处理   试验组   生长期间施用本发明菌剂   对照组   生长期间不施用菌剂 

表2灰钙土盆栽生长期观察 

试验组与对照组不论出苗时间、出苗率、三叶期、苗高均有显著提高。 

表3盐碱土盆栽生长期观察 

试验组与对照组不论出苗时间、出苗率、三叶期、苗高均有显著提高。 

表4灰钙土盆栽苜蓿根系观察 

试验组与对照组不论根系长度、根系数、体积、鲜重均有显著差异。 

表5盐碱土盆栽苜蓿根系观察 

试验组与对照组不论根系长度、根系数、体积、鲜重均有显著差异。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。