hERG突变体及其应用

摘要

本发明提供能够表达人ether-à-go-go相关基因(hERG)突变体的分离的核酸分子，所述突变体增强hERG失活，其中所述突变不位于hERG蛋白离子转导孔腔内的药物结合袋附近。本发明还提供所述分离的核酸分子在筛选结合hERG蛋白的潜在药物的测定法中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及人ether-à-go-go相关基因(hERG)的突变体，及其用于筛选结合hERG蛋白的潜在药物的应用。

背景技术

人ether-à-go-go相关基因(hERG)编码传导心脏中的快速型延迟整流钾电流(I_Kr)的离子通道的成孔亚基。hERG中的功能获得性突变和缺失性突变可分别导致短QT综合征和长QT综合征的临床病症，这表明了hERG在维持心脏电稳定性中的关键作用。先天性LQTS并不常见，并且可能由10个不同基因的突变导致，这些基因大部分编码离子通道或其调节亚基。由药物诱导的hERG阻断而产生的获得性LQTS更为常见，并且是药物退出医药市场的最常见原因。因此，现已要求对药物的hERG亲和力进行早期评估，并且需要详细理解药物如何与hERG结合。

已很好地建立药物结合在hERG孔区的中央腔中，并且在此结合发生之前需要通道开放。在去极化电位下，hERG通道可以以开放或失活的状态存在，然而尚未建立开放状态还是失活状态是优选的药物结合状态。支持状态依赖性药物结合的证据主要来自于显示对消除失活(S620T；G628C+S631C)或减少失活(S631A)的突变通道的亲和力降低的研究。然而，这些突变体的位置接近于选择性过滤器(selectivity filter)和推定的药物结合袋(drug-binding pocket)(参见图1)，并且可由此通过药物结合袋中的局部变化直接或间接地影响药物阻断。为了解决这个问题，本发明人研究了对远离影响失活的中央孔的残基进行突变是否以类似于所报道的S631A和S620T突变体的方式影响药物与hERG的结合。

本发明人现已制备了可用于筛选药物对hERG亲和力的新hERG突变体。

发明内容

第一方面，本发明提供了能够表达人ether-à-go-go相关基因(hERG)突变体的分离的核酸分子，该突变体增强hERG失活，其中所述突变不位于hERG蛋白离子转导孔腔内的药物结合袋附近。

优选所述突变位于S5P连接子的α-螺旋上。更优选所述突变是N588E、H587K、G584S或Q592D。然而，应理解，不位于hERG蛋白的药物结合袋中但仍增强失活的其他突变也适合于本发明。

本发明人已经将位于远离药物结合袋的S5P连接子的α-螺旋上的残基N588、H587、G584和Q592突变为谷氨酸(N588E)、赖氨酸(N587K)、丝氨酸(G584S)或天门冬氨酸(Q592D)。在细胞中表达时，这些突变影响hERG蛋白活性的失活。其他候选区域包括不是药物结合袋一部分的所有区域。这包括外孔螺旋(例如F557A)、电压感受域(例如A527V)、N末端和C-末端的胞质域，以及连接跨膜螺旋片段的细胞内和细胞外连接子。

优选所述分离的核酸分子编码包含基本如图12(SEQ ID NO：1)中所示的一个或多个突变的hERG突变体。

所述核酸分子可包含促进离子通道活化的一个或多个其他突变，例如L524W、L532P、V535A、A536V、K538Q。

第二方面，本发明提供了表达本发明第一方面所述的分离的核酸分子的载体。

优选所述载体包含适合在哺乳动物细胞表达，优选高水平表达的启动子和有助于选择表达hERG通道的细胞的抗生素抗性基因。

第三方面，本发明提供了表达本发明第一方面所述的分离的核酸分子或本发明第二方面所述的载体的稳定细胞系。所述稳定细胞系表达hERG突变蛋白。

优选所述细胞选自，但不限于中国仓鼠卵巢细胞，人胚肾细胞或转化的非洲绿猴肾成纤维细胞。

可使用包括抗生素选择然后进行克隆扩增的本领域已知技术来制备稳定细胞系。

所述细胞系特别适合用于筛选结合hERG蛋白的潜在药物。

第四方面，本发明提供了用于筛选结合hERG蛋白的潜在药物的测定系统(assay)(测定法或测定装置)，其包括：

本发明第三方面所述的稳定细胞系；和

用于测定细胞中hERG蛋白活性的工具(means)。

所述测定系统(assay)(测定法或测定装置)可包括离子流变化或电压变化，使用膜片钳测定法，Rb+外流测定法用于替代K+流，或者使用荧光用于测定所述细胞的电压变化。将药物与细胞一起温育，并监测对离子流或电压的影响。测定条件可包括高Rb+或高K+的存在(以增强进入失活状态)，随后在除去高K+或Rb+后分析离子流或电压。在一些条件下，加入增强hERG通道活化的突变可消除对高Rb+或高K+条件的需要。

第五方面，本发明提供了本发明第一方面所述的分离的核酸分子或本发明第三方面所述的细胞系在用于筛选结合hERG蛋白的潜在药物的测定系统(测定法)中的应用。

本发明人表征了四种高亲和力阻断剂(多非利特、西沙必利、阿司咪唑和特非那定)和四种低亲和力阻断剂(奎尼丁、哌克昔林、红霉素和混旋索他洛尔)的结合。所有四种高亲和力阻断剂均表现出对失活缺陷突变体(N588K和S620T)的亲和力下降，而在低亲和力阻断剂中，只有混旋索他洛尔显示出对N588K的亲和力下降。在失活缺陷突变体影响结合的所有情况下，对S620T的亲和力都显著低于对N588K突变体通道的亲和力。药物结合的动力学模型表明药物与野生型(WT)、N588K和S620T通道结合之间的差异可由药物与开放状态结合的亲和力动力学比与失活状态结合的亲和力动力学低4-70倍(取决于所研究的具体药物)所解释。

这些数据强烈表明状态依赖性结合对于hERG的高亲和力阻断是必须的，但不是足够的。此外，药物对S620T突变体的亲和力代表了其对开放构象的通道的真实亲和力，而对WT通道测量的亲和力是对开放状态和失活状态的亲和力的加权平均值。本发明人发现的推论是不测定失活状态的高通量筛选可能严重低估了对WT-hERG通道的真实亲和力。

除非文章内容另有需要，否则在本说明书全文中术语“包含”、“包括”或“含有”应被理解为包括指定的元素、整体或步骤，或者元素组、整体组或步骤组，但也不排除任何其它元素、整体或步骤，或者元素组、整体组或步骤组。

包含在本说明书中的文献、条例、材料、装置或物品等的任何讨论都仅出于提供本发明内容的目的。不能认为由于以上任一项内容或所有内容在本说明书的各项权利要求的优先权日之前已在澳大利亚存在，就认定这些内容形成部分现有技术的基础或者是本发明相关领域的普遍常识。

为了更清楚地理解本发明，将参考以下附图和实施例对优选实施方案进行阐述。

附图说明

图1：两个hERG亚基的S5、S6、孔螺旋和S5P连接子区域的示意图。药物阻断的最重要分子决定区(determinant)由灰色圈表示。干扰失活的常用突变体由白色星表示。注意，G648可能不暴露于孔腔，并被认为通过决定药物结合袋的构象而影响药物阻断；V659可能通过改变通道的门控特性而影响药物阻断。由于尚不清楚S5P连接子相对于孔的精确位置，S5P连接子被标以虚线。

图2：N588E-hERG(○)、WT-hERG(■)和N588K-hERG(●)的电导电压曲线。数据点为平均值±SEM，与数据拟合的曲线是Boltzmann函数，其中对于N588E-hERG，失活的V_0.5为-114±3mV且斜率为-19mV(n＝13)；对于WT-hERG，V_0.5为-78±2mV且斜率为-26mV(n＝11)；且对于N588K-hERG，V_0.5为45±4mV且斜率为-14mV(n＝6)。

图3：按照图上部显示的药物阻断电压方案记录到的电流曲线的典型实例。在30nM西沙必利存在下，A.WT-hERG，B.N588E-hERG和C.N588K-hERG。在每种情况下，虚线代表零电流。注意每个记录的比例不同；A.和B.是在展示性电压(revelatory voltage)步骤中记录的电流；而C.显示了N588K-hERG中3秒去极化步骤的非整流电流。通过用施用药物后达+20mV的3秒去极化步骤结束时测量的电流(I_药物)除以记录开始时测量的电流(I_对照)来确定每个记录中药物阻断的百分比。如A.和B.中所示，在WT-hERG和N588E-hERG的情况下，通过将展示性电压步骤中减活电流的第一部分拟合为指数曲线，并将此指数曲线外推到去极化步骤结束时来确定该点的电流。

图4：高亲和力hERG阻断剂的希尔图(Hill Plots)。与WT-hERG(■)、N588E-hERG(○)和N588K-hERG(●)的药物结合，其中A.阿司咪唑，B.西沙必利，C.多非利特，D.特非那定。每个数据点代表I_[药物]/I_对照±S.E.M，n＝4-9个细胞。E.显示每种药物的平均IC₅₀±S.E.M的总结数据。WT-hERG和N588K-hERG之间的显著差异由^*标记。所有数值显示在表1中。

图5：在3nM奎尼丁存在或不存在下，由A.WT-hERG、B.N588E-hERG和C.N588K-hERG记录到的电流曲线的典型实例。药物阻断电压方案显示在图上部。在每种情况下，虚线代表零电流。注意，3μM奎尼丁对N588K-hERG的阻断＞50％，这与WT-hERG和N588E-hERG中的阻断百分比类似。为了产生对测量电流充分开放的通道，通过使用-120mV的“展示性”电压步骤使N588E-hERG中的减活速率高于WT-hERG。显示在施用药物的A.和B.中，减活速率降低；这可能是由于此步骤期间的一些药物不阻断，而不是对减活动力学的真实影响。

图6：低亲和力hERG阻断剂的希尔图。WT-hERG(■)、N588E-hERG(○)和N588K-hERG(●)的药物结合，其中A.奎尼丁，B.哌克昔林，C.红霉素，D.混旋索他洛尔。每个数据点代表I_[药物]/I_对照±S.E.M，n＝4-6。E.显示每种药物的平均IC₅₀±S.E.M的总结数据。WT-hERG和N588K-hERG之间的显著差异由^*标记。所有数值显示在表1中。

图7：A.S631A-hERG(△)和S620T-hERG(□)的电导电压曲线。数据点为平均值±SEM，与数据点拟合的曲线是Boltzmann函数。S631A-hERG突变体稳态失活的V_0.5为43±2mV，斜率为-16.5mV(n＝6)。S620T-hERG在所示电压范围内没有失活。点线、平滑线和虚线显示了由图2复制的N588E-hERG、WT-hERG和N588K-hERG的数据。B.多非利特对S631A-hERG(△)和S620T-hERG(□)的亲和力。点线、平滑线和虚线分别显示了由图4C复制的N588E-hERG、WT-hERG和N588K-hERG的数据。注意，药物对N588K和S631A细胞构建体的亲和力类似，多非利特对S620T构建体的明显右移(亲和力下降)。

图8：药物结合hERG的马尔可夫模型(Markov model)。C_x＝关闭状态。O＝开放状态。I＝失活状态。OD＝与药物结合的开放状态。ID＝与药物结合的失活状态。

图9：将对N588K-hERG的数据点的多非利特希尔曲线与模型曲线叠加。细平滑线、点线和虚线分别显示WT-hERG、N588K-hERG和S620T-hERG。模型曲线为深黑色。多非利特阻断N588K的试验IC₅₀值和模型值分别为：377±57.8 vs 302nM。

图10：将对N588K-hERG的数据点的A.阿司咪唑、B.西沙必利、C.特非那定和D.混旋索他洛尔希尔曲线与模型曲线叠加。细平滑线、点线和虚线分别显示WT-hERG、N588K-hERG和S620T-hERG。模型曲线为深黑色。药物阻断N588K的试验IC₅₀值和模型值分别为：阿司咪唑-14.8±1.1 vs 13.6nM；西沙必利-55.9±4.2 vs 77.3nM；特非那定-170±32.3 vs 177nM；混旋索他洛尔1392±266.5 vs 1461μM。S620T的IC₅₀值显示在表2中。

图11：奎尼丁的电流钳测定。奎尼丁电流钳试验的典型模型试验(a.)和原始数据(b.)。在(b.)中，在记录起点施用药物，导致细胞膜去极化。可将电压变化的幅度转化成药物阻断百分比，并绘制成标准希尔曲线(c.)。通过这种方式，可将电流钳测定中的药物阻断IC50与电压钳测定中的药物阻断IC50进行比较。

图12：合成的hERG cDNA(1..3486)。其包含增强失活(G584S、H587K、N588E)和活化(L524W、L532P、V535A、A536V、K538Q)的可能突变体。这些突变标有下划线，且可变碱基由IUPAC密码标明。此外，还有引入限制性位点的多个沉默突变。

总起来说，

L524W(YKN)CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG或TGG(SEQ ID NO.2)

L532P(YYN)CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG、CCT、CCC、CCA或CCG(SEQ ID NO.3)

V535A(GYN)GTT、GTC、GTA、GTG、GCT、GCC、GCA或GCG(SEQ ID NO.4)

A536V(GYN)GTT、GTC、GTA、GTG、GCT、GCC、GCA或GCG(SEQ ID NO.5)

K538Q(MAR)AAA、AAG、CAA或CAG(SEQ ID NO.6)

G584S(DSN)GGT、GGC、GGA、GGG、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC(SEQ ID NO.7)

H588K(MAN)CAT、CAC、AAA或AAG(SEQ ID NO.8)

N588E(RAY)AAT、AAC、GAT或GAC(SEQ ID NO.9)

序列中核苷酸的IUPAC密码为：

A 腺嘌呤

C 胞嘧啶

G 鸟嘌呤

T 胸腺嘧啶

U 尿嘧啶

R 嘌呤(A或G)

Y 嘧啶(C、T或U)

M C或A

K T、U或G

W T、U或A

S C或G

B C、T、U或G(不是A)

D A、T、U或G(不是C)

H A、T、U或C(不是G)

V A、C或G(不是T，不是U)

N 任何碱基(A、C、G、T或U)

图13：图12所示合成构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)与野生型hERG cDNA(SEQ ID NO.10)的比较。

具体实施方式

本文使用在下文以及本说明书全文所述的多个定义来描述本发明。

除非另有说明，本文使用的单数形式包括复数形式。因此，当指“寡核苷酸”时，其包括多个寡核苷酸分子，当指“核酸”时，其是指一个或多个核酸。

本文所用“约”是指±10％。

方法

分子生物学

使用如此前文献(Walker BD et al.，Br J Pharmacol 1999；128(2)：444-450)所述构建的稳定表达hERG K⁺通道的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系进行对野生型(WT)hERG通道的试验。将CHO细胞培养在含10％FBS的D-ME/F12中，并保持在37℃、5％CO₂的条件下。研究铺到显微镜盖玻片至少24小时后的细胞。使用超长引物PCR(Megaprimer PCR)法产生突变hERG构建体。对突变构建体(N588K、N588E、S631A或S620T)进行测序以确认仅产生正确的突变，随后亚克隆至pIRES2-eGFP载体。将空白CHO细胞铺到灭菌的玻璃盖玻片上。在24小时后，按照生产商的说明，使用PolyFect转染试剂(Qiagen)，由突变hERG构建体转染细胞。转染后，将细胞在37℃温育至少1天，然后进行电生理学研究。使用全细胞模式的膜片钳技术研究由表达eGFP而被鉴定为成功转染的细胞。

电生理学

使用立式两段拉制仪(PP-830；Narishige，Japan)制备在充满内液时电阻为1-4MΩ的硼硅酸盐玻璃管膜片钳电极(patch pipette)。所述内液包含(以mM计)：120葡萄糖酸钾、20KCl、1.5MgATP、5EGTA和10HEPES(由KOH调至pH 7.3)。将膜片电位以-15mV进行调整以校正低Cl^-电极溶液和外部槽液(见下文)之间的接界电位(Barry，1994)。在贮存到个人电脑前，将电流扩增(Axopatch 200B amplifier；Molecular Devices，Sunnyvale，Ca)并数字化(DigiData 1200；Molecular Devices)。以电学方式减除瞬时电容电流，并且所有试验的串联电阻补偿为约80％。将电流信号在5kHz数字化，并在2KHz进行低通滤波。一些电流记录被离线漏减。使用pClamp软件进行采集。

溶液和药物

使用Tyrode溶液浇盖细胞，所述Tyrode溶液包含(以mM计)：130 NaCl、5 KCl、1 MgCl、1 CaCl₂、12.5葡萄糖、10 Hepes。在二甲基亚砜(DMSO)中制备西沙必利、阿司咪唑、特非那定、红霉素、多非利特和奎尼丁的储备液，随后根据需要用浇注液稀释(最大终DMSO浓度＝0.1％vv^-1)。在Tyrode溶液制备混旋索他洛尔的储备液，并在甲醇中制备哌克昔林储备液。本发明人此前发现0.1％vv^-1的DMSO对所研究的参数没有影响。

电压方案

稳态失活

经3秒，将膜片电压从-80mV的钳制电位逐步提高至+40mV，以完全活化通道。对于表达WT-hERG和N588E-hERG的细胞，第二脉冲由以10mV递减的从+40mV至-160mV的电压步骤组成。对于表达N588K的细胞，采用+120mV至-20mV的范围。对于至＜-30mV的电压步骤，将减活的第一阶段拟合为指数曲线，并外推到第二脉冲的起点，在所述第二脉冲起点时的幅度表示如果即刻由失活恢复则通道中可通过的电流。绘制通道电导对电压的曲线以获得依赖电压的稳态失活曲线(即，从失活恢复的稳态)，且所述数据与Boltzmann函数拟合：

$\frac{G}{G_{\max }}=\frac{1}{(1+e^{\frac{V_{0.5}-V_t}{k}})}$

V_0.5-半失活电压

k-斜率

药物阻断

因为此为比较研究，所以需要仔细确保WT和突变体通道中药物测试的类似条件。然而，由于N588E-hERG和N588K-hERG的独特门控特征，使用了稍微改变的电压方案和测量方法。按照两步电压方案测量电流：3秒至+20mV以完全活化通道的第一步，和至负膜电位，通常至-110mV的第二步(但参见下文的变式)。在所述第二电压步骤中，hERG通道从失活快速恢复，并开始减活。所述第二步骤被称作“展示性”是因为其允许评估3秒去极化期后活化通道(开放且失活)的总电导。

通常在-110mV记录展示性步骤，但在一些N588E-hERG细胞中采用至-120mV的电压步骤以使其从失活充分恢复，从而进行电流测量。与此相反，对于一些N588K-hERG细胞使用了较低的负电压，这是为了使此非整流构建体中由大活化电流导致的串联电阻误差最小化。药物阻断计算为I_[药物]/I_对照，所有电流均在活化步骤结束时测量。对于N588E-hERG和WT-hERG，将展示性步骤中电流记录的第一部分拟合成单指数曲线，并外推至活化步骤结束时。通过这种方式测量所有细胞在相同时间点的电流。

以0.1Hz重复电压方案。在膜片破裂后3-5分钟，即将电流水平稳定在稳态水平所需的时间后，记录对照电流。施用第一药物，更换溶液所需的时间通常小于10秒。连续记录直到达到新的稳态阻断(通常2-4分钟)。对每个细胞施用2-4剂的药物，大多数试验在20分钟之内完成。

数据分析

使用pClamp 9.0软件的Clampfit模块进行初步数据分析。使用Mathematica 6(Wolfram Technologies)进行后续数据分析和图片数据的制备。所有数据均表示为平均值±SEM(n)，并使用成对t检验测定统计学显著性(P＜0.05)。

载体

将hERG cDNA克隆到哺乳动物表达构建体中，所述哺乳动物表达构建体包含指导表达的CMV病毒启动子和允许选择稳定细胞系的G418抗生素选择盒。按照此前的描述产生稳定细胞系(Walker BD et al.，Br J Pharmacol 1999；128(2)：444-450)。应理解，本领域已知的任何适合载体都是适合的。

宿主细胞

优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞，人胚肾细胞或转化的非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7)。用于获取表达突变蛋白的稳定宿主细胞的技术在本领域是公知的，并可从本领域技术人员使用的生物转染-稳定转染(Biology-Transfection-Stable-Transfection)在线文献的在线操作方案中找到。

筛选测定

可使用常规膜片钳电生理学测定法(Perrin MJ et al，Mol Pharmacol.2008Nov；74(5)：1443-52)、由分子仪器进行的电流钳测定法、Rb+流测定法(Rezazadeh S et al.，J Biomol Screen.2004 Oct；9(7)：588-97)或使用电压敏感染料的电压跟踪测定法(Dorn A et al，J Biomol Screen.2005 Jun；10(4)：339-47)来测定突变hERG构建体和/或稳定细胞系。

结果

CHO细胞表达的WT-hERG、N588E-hERG和N588K hERG的稳态失活V_0.5

为了研究药物结合和状态依赖性之间的关联，我们选择使用位于hERGS5P连接子α-螺旋中的N588残基的突变体(图1)。该残基具有两个重要特征，第一，认为其位置远离药物结合袋；第二，可通过在此残基引入不同的电荷测定通道失活的电压依赖性。

使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞表达系统进行N588突变体通道的研究；但哺乳动物细胞是用于药物结合研究的优选异源表达系统。因此，我们需要首先确认N588突变体通道在哺乳动物和非洲爪蟾卵母细胞中的性质类似。在CHO细胞中表达时，N588E-hERG失活的V_0.5为-114mV±3mV且斜率为-19mV±1mV，(n＝13)；WT-hERG失活的V_0.5为-78mV±2mV且斜率为-27mV±2mV，(n＝11)；N588K-hERG失活的V_0.5为45mV±4mV且斜率为-14mV±1mV，(n＝6)(图2)。所有数值均与有关非洲爪蟾的报道类似。N588K-hERG的反转电位-83.4±2.0mV(n＝5)相对于WT-hERG的反转电位-88.5±2.2mV，n＝10略有移动。然而，与对Na⁺相比，N588K-hERG通道对K⁺仍具有高的选择性。由于其活化电流的幅度小，不能测定N588E-hERG构建体中的反转电位。然而，在电流大得多的卵母细胞中表达时，发现其与WT-hERG类似。这些性质一起使得N588突变构建体是研究失活介导的药物与hERG结合理想的。

高亲和力药物结合受到N588电荷突变体的调控

我们首先研究了此前确认在低纳摩尔范围阻断hERG的四种药物：阿司咪唑、西沙必利、多非利特和特非那定对CHO细胞中表达的N588E-hERG、WT-hERG和N588K-hERG的亲和力。图3显示了在对照条件下，以及使用30nM西沙必利平衡5分钟后，WT-hERG、N588E-hERG和N588K-hERG记录的典型实例。在达+20mV的3秒活化步骤结束时测量所有细胞中的药物阻断百分比。这在N588K(图3c)直接进行，或者通过将N588E-hERG(图3b)和WT-hERG(图3a)在展示性电压步骤中电流记录的第一部分拟合为单一的指数曲线，并将此指数曲线外推到去极化步骤结束。图3中的数据表明30nM西沙必利导致N588K-hERG通道的阻断低于N588E-hERG或WT-hERG。这从图4所示的汇总的希尔曲线更能清楚地看出；西沙必利对WT＝hERG的亲和力20.5±2.2nM(n＝4)与对N588E-hERG的亲和力13.1±4.9nM(n＝4)类似，但对N588K-hERG的亲和力55.9±4.2nM(n＝4)低得多。所有四种高亲和力阻断剂均显示出类似的模式；与WT-hERG和N588E-hERG相比，对N588K-hERG的亲和力下降(参见图4)。所有药物对WT和N588突变构建体的亲和力总结在表1中。

表1：所有药物对WT和N588突变体构建体的亲和力

低亲和力药物与N588电荷突变体的结合

我们随后研究了此前确定在高纳摩尔或微摩尔范围内阻断hERG的四种药物奎尼丁、哌克昔林、红霉素和混旋索他洛尔对CHO细胞中表达的N588E-hERG、WT-hERG和N588K-hERG构建体的亲和力。图5中显示了在3μM奎尼丁存在或不存在下，由WT-hERG、N588K-hERG和N588E-hERG记录的电流曲线的典型实例。3μM奎尼丁导致WT和两种N588电荷突变体发生类似程度的阻断。这也可见于汇总的希尔曲线(图6A)。哌克昔林和红霉素显示了与奎尼丁所观察到的相同的模式，即对所有hERG构建体的亲和力类似(图6A、图6C)。与此相反，混旋索他洛尔显示出对N588E-hERG和WT-hERG的亲和力显著高于对N588K-hERG的亲和力(图6D，表1)。

对N588K-hERG的亲和力下降和状态依赖性结合

图3和4的数据清楚地证明此研究中使用的四种高亲和力药物显示对失活缺陷型N588K-hERG通道的亲和力降低。为了确定对N588K-hERG通道的亲和力降低是否反映了药物结合的状态依赖性，我们研究了一系列失活缺陷型突变体的亲和力是否也存在类似的降低。具体而言，我们研究了多非利特与S631A-hERG和S620T-hERG的结合。相对于WT-hERG(其与N588K所观察到的非常近似)，S631A-hERG的稳态失活V_0.5明显右移(图7A)，而S620T-hERG在可测电压下没有失活。因此，在+20mV下，N588K和S631A中处于开放∶失活状态的通道比例为～95∶5，与此相比，S620T中的比例为100∶0，而WT-hERG中的比例为5∶95(图7A)。

多非利特对S631A-hERG的亲和力与其对N588K-hERG的亲和力并没有统计学差异(分别为404±95nM(n＝4)和377±69nM(n＝4))，但与对WT-hERG相比减小了8倍。这两种对失活具有类似的影响但显然彼此位置并不邻近的突变体对药物结合的影响非常相似，这表明药物结合亲和力下降是由通道失活降低介导的。然而，与对S631A或N588K的亲和力相比，多非利特对S620T的亲和力进一步降低了10倍(3494nM±374nM，n＝4)(图7B)。考虑到S631A和N588K通道在+20mV(我们测定药物结合的电压)时处于开放状态的程度与S620T通道处于开放状态的程度相差不大(即～85％和100％)，药物对S620T-hERG的亲和力明显降低表明了这种突变体对药物结合的直接影响。另一个假设为，尽管S631A和N588K通道在+20mV时处于失活状态的频率相对较低，但是药物结合和解离的动力学是这样的，只要通道进入失活状态，则其与药物结合，药物保持长时间的结合而解离速率非常低。根据这个假设，药物与S620T突变体的结合仅可发生在开放状态，从而反映出对开放状态的亲和力，而药物与WT或N588K通道的结合可反映出对失活和开放状态的亲和力的加权平均值，其依赖于两种状态之间转化的相对速率以及药物结合和解离速率。为了检测这个假设，我们构建了如图8所示的药物与hERG通道结合的计算机模型。

药物与开放和失活状态结合的模型动力学

用于hERG动力学的马尔可夫链模型以Lu et al.(J Physiol.2001 Dec 15；537(Pt 3)：843-51)开发的模型为基础，并添加了其他两种状态：与药物结合的开放状态和与药物结合的失活状态(图8)。数据补充中显示了用于该模型的设定为22℃下的速率常数。为了构建S620T突变体的模型，将向失活状态转化步骤的速率常数设为0。为了构建N588K突变体的模型，调整开放状态和失活状态之间转化的速率常数，从而重现在试验中观察到的这些速率常数和稳态失活的变化。出于简单性考虑，我们假定WT、S620T和N588K通道具有相同的活化动力学。

为了计算开放和失活状态药物阻断的速率常数，我们假定药物对S620T的亲和力代表了对开放状态的亲和力。因此，将开放状态药物阻断的速率常数kf6和kr6限定为拟合药物与S620T通道结合的数据。随后，使kf6和kr6的数值保持恒定，并将药物与失活状态结合的数值kf7和kr7限定为拟合药物阻断WT通道的时程。在多非利特结合的情况下，对开放状态的计算亲和力(kf6/kr6)，即对S620T的数值，为3.5μM，而对失活状态(kf7/kr7)的计算亲和力为47.8nM。多非利特结合WT通道的测量亲和力为50.1nM，与对失活状态计算的亲和力值更为接近，这反映出WT通道处于失活状态下的时间比例更大，并且药物与失活状态解离更慢。如果最初的假设是正确的，即药物对S620T的亲和力是药物对开放状态的真实亲和力，那么用kf6、kr6、kf7和kr7的数值取代我们N588K模型中的数值应当重现在试验中测定的多非利特结合N588K的IC₅₀。由图9中的数据可见，模型预期的数值与试验数据非常接近。对此前评估的每种状态依赖性药物重复相同的过程(图10A-D)，并且获得与该试验数据类似的良好近似值。

将hERG药物结合模型并入膜电位的CHO细胞模型也能够重现药物对hERG转化CHO细胞中膜电位的影响。空白CHO细胞中的静息膜电位是～-30mV，与此相比，稳定转染hERG K+通道的CHO细胞中的静息膜电位是～-60mV。hERG通道的50％阻断导致膜电位提高3.5mV。这与试验数据非常吻合(图11)。此外，模型研究还表明，通过将活化的电压依赖性移动-15mV，将hERG通道活性每降低50％，能够将膜电位变化从3.5mV增强至4.5mV。讨论

药物结合的状态依赖性

阻断hERG的大多数药物需要通道开放。一些证据表明，一旦开放，失活提高了药物对通道的亲和力：首先，失活受损的突变hERG通道S631A、S620T和G628C/S631C降低了多种活性剂对hERG的药物阻断。此外，在牛EAG(bEAG)中引入能够使通道失活的突变同样使多非利特通道阻断具有敏感性。然而，所采用的失活受损突变会通过不依赖门控的方式影响药物阻断。S631和S620的位置接近药物结合空间，并可在已知为药物结合的重要分子决定区的孔螺旋基部产生构象变化。G628C/S631C显著降低了hERG的钾选择性，表明在此突变体中的选择性过滤器附近发生了显著的构象变化。此外，突变体hERG通道G648A和S623A均促进失活，但降低了hERG的甲磺酰胺阻断。设计用于促进在药物结合期间处于失活状态(即大去极化)的电压方案同样减轻了药物阻断，这提高了解释药物结合是否具有状态依赖性的难度。

本申请公开的数据提供了迄今为止证明药物与hERG K+通道的结合可以是状态依赖性的最强证据。首先，我们证明了引入到被认为是远离药物结合袋但仍影响失活的区域的突变(N588K)影响药物结合。在开放和失活状态时hERG的晶体结构不存在下，我们不能确定N588K的位置是否远离药物结合袋，然而结构研究、毒素结合研究和分子动力学模型研究的组合表明位于S5Pα-螺旋亲水面的N588K将朝向细胞外空间，从而远离药物结合袋。其次，我们发现对失活具有非常近似影响的两个不同突变体(N588K和S631A)对药物结合具有相同的影响。对此观察结果的最简单的解释是这些突变体对失活的作用导致药物结合改变。第三，我们构建的药物结合WT、S620T和N588K突变通道的动力学模型显示，这些突变体之间所有的药物结合差异均能够基于处于开放和失活状态的时间差异以及药物结合和解离的动力学差异而得到解释。我们的动力学模型研究的重要结果在于能够使本发明人首次评估了一系列药物对开放和失活状态的亲和力。此外，我们的数据表明如果已知对WT和S620T突变体通道的亲和力，即能够计算任何药物对开放和失活状态的亲和力。

与我们的数据不同，文献中的一个报道提出S620T突变能够对药物结合产生直接影响。该文献表明S620T和S620C尽管对失活门控(消除)的作用相同，但对与多非利特类似的甲磺酰胺E-4031具有不同的亲和力。这被解释为表明在620位的丝氨酸侧链直接影响了药物结合。然而，此数据并不一定与我们的数据不兼容。失活的消除有可能改变S620T和S620C二者的药物亲和力，但S620C中的半胱氨酸侧链能够在开放状态下结合药物，而S620T中的苏氨酸侧链则不能，从而使S620C的亲和力高于对S620T观察到的亲和力。此外，在该研究中，在达+50mV的4秒去极化步骤后评估药物阻断。在此电压下，S631A的O∶I概率应为～1∶1，显著不同于没有失活的S620C。然而，E-4031对S631A-hERG和S620C-hERG的亲和力类似，表明其中的一个或另一个在一定程度上不依赖于门控机制而改变药物阻断。我们有关多非利特阻断S631A和N588K的数据，即S631A通过改变门控影响药物阻断的数据表明S620C产生了对药物结合的直接影响。

结合hERG的药物的高通量筛选的关联

考虑到需要筛选所有药物与hERG的结合，现已在研发用于测定结合hERG的药物的高通量筛选中投入了相当大的精力。此类测定包括基于荧光的电压测定和Rb+外流测定。然而，这些筛选的结果通常是差的，我们认为这是因为这些筛选主要测定了与开放状态的结合，因此不能检测即使不是全部也是很多的高亲和力阻断剂。我们的数据显示开放和失活状态之间的亲和力的差异可以是70倍。因此，重要的是，任何高通量筛选系统都要充分测定与失活状态的结合以取得成功。

我们的模型研究同样表明，导致活化电压依赖性左移的突变将提高药物hERG通道阻断而导致的电压移动，并由此有利于基于测量电压变化的高通量药物筛选测定。

观察结论

我们研究了hERG的失活门控和药物阻断之间的关系，发现失活促进了高亲和力阻断(纳摩尔范围)。N588电荷突变体的应用提供了用于研究开放状态和失活状态之间的通道孔构象变化的方法。此外，我们首次计算了药物与开放状态和失活状态的hERG通道结合的相对亲和力，其中在多非利特的情况下显示对失活状态的亲和力高70倍。这些数据的药学重要性显著地体现于已退市的两种药物阿司咪唑和特非那定以及一种应用严格受限的药物西沙必利显示出明显优先与失活状态结合的观察结果。

本领域技术人员可以理解，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种改变和/或改进，而不偏离广泛阐述的本发明的精神或范围。因此，从各个方面上，本发明所述的具体实施方式都应被认为是说明性而非限制性的。