用于生物材料控速冷冻的方法和系统

摘要

本发明提供了一种控制速率冷冻生物材料的方法和系统。本发明的系统和方法通过在冷却单元内设置的多个小瓶附近，采用致冷剂均匀层流的强力对流冷却，而具有快速冷却单元内的小瓶或其他容器内生物材料的能力。根据作用时间，通过精确控制和调节引入系统的致冷剂温度，实现快速冷却生物材料。

说明书

技术领域

本发明大体上涉及一种低温储藏过程，更特别地，涉及一种用于提供生物材料控速冷冻的方法和系统，其将低温储藏过程中由于细胞间冰形成和溶质作用所造成的细胞损伤最小化。

背景技术

低温储藏是一种用于在非常低的温度下稳定生物材料的过程。以前尝试冷冻生物材料，例如活细胞，通常导致细胞生存能力的显著丧失，并且在一些情况下，多达80％甚至更多的丧失细胞活性和生存能力(viability)。

在一些情况下，低温储藏期间的细胞损失通常作为冷冻步骤或再结晶期间活细胞内细胞间冰形成的结果而出现。快速冷却通常导致更多的细胞间冰形成，这是因为在同快速降温速率相关的短时间范围期间，水分子通常没有充分地移出细胞而导致。细胞间冰形成也可在重结晶期间出现，重结晶出现在升温或融化循环期间。如果太多的水留在活细胞内，在快速冷却阶段最初冰晶的形成和随后在升温期间的再结晶会导致损伤出现，并且这种损伤通常是致命的。

另一方面，在低温储藏过程中缓慢冷却特征(profile)通常导致溶质作用的增加，其中过多的水移出细胞。由于渗透压不平衡的加剧，过多的水移出细胞会对细胞产生不良影响。因此，由于渗透压平衡导致的细胞损伤，对细胞生存是有害的，并且最终导致细胞损伤和影响细胞生存能力。

现在的低温冷藏技术包括使用基于传导的低温冷却设备，例如冷架子(cold shelf)、或冷冻干燥机型冷冻器单元(freezer unit)、或者基于对流的低温冷却设备例如控速冷冻器和冰冻冷却器单元。但是，这样的设备只适合于相对小的容量，不适用于生物材料，例如治疗细胞系的工业规模的生产和保存。例如，最大的商业上可获得的适于生物材料使用的控率冷冻器只能容纳大约8000个紧密填塞(packed)的小瓶。这样现有的控速冷冻器也有冷却小瓶与小瓶之间不均匀性的问题，部分是由于冷冻剂在冷冻器内的不均匀流动，并且需要冷冻器内的小瓶紧密填塞造成的。

很多传统的冷冻系统采用内部鼓风机(fans)向单元周围分配致冷剂，并且通过对流递送制冷效果到小瓶。这些基于对流的冷却或冷冻系统不能达到温度均匀，由于小瓶通常位于离内部鼓风机不同距离的地方，或者填塞在其他小瓶或托架的阴影处。暴露于致冷剂的高速紊流的生物材料小瓶通常以不同速率冷却且通常比处在距离鼓风机更远位置小瓶的冷却速率要快得多。

还有一些现有的冷冻干燥机类型的控速冷冻器，可处理大容量的小瓶，但通常依赖冷冻干燥机单元内冷架子与小瓶之间的热传导。但是，由于多数玻璃小瓶底部是凹面的，玻璃小瓶的底部不可能具有均匀的传导表面区域。因此，对于这类设备来说，冷冻过程中小瓶之间的温度变化是最大的缺点。此外，由于小瓶只有非常小的导体表面与冷架子接触，冷却速率可能非常慢。

以前减轻细胞活力和生存能力损失的尝试包括使用防冻添加剂，例如DSMO和甘油。已经证实在低温储藏过程中使用这样的防冻剂具有减少在冷冻和随后的融化循环过程中细胞损失的作用。但是，很多低温防护剂，例如DSMO对人类细胞有毒性，或者不适合用于全细胞治疗。不利的是，低温防护剂也一定程度上增加了细胞产品和储藏过程的复杂性程度和相关成本。同时，仅仅低温防护剂，不能根除细胞活性和生存能力损失的问题。

需要提供一种方法和系统，进一步地将在采用或不使用防冻剂的低温储藏过程中由于冰形成或者溶质作用造成的细胞损伤进行降低或者将最小化。此外，所述系统和方法应当是有效且容易调节(readilyscaleable)以处理工业规模生产和保存生物材料，且为这些生物材料提供快速、均匀的冷却。

发明内容

本发明的特征在于一种用于生物材料的低温冷藏器或者冷冻系统，包括致冷剂源、入口环路(intake circuit)、排出环路(exhaust circuit)和控制系统，其中所述入口环路与致冷剂源连接并适用于提供致冷剂冷气体的均匀流动到冷却室。冷却室包括入口压力通风(intake plenum)，排出歧管(exhaust manifold)，和两个或更多平行的多孔表面，其限定了在相邻平行表面之间的冷却区域，其中平行多孔表面的一个设置于临近入口压力通风且与入口压力通风形成流体交流，和另一平行多孔表面设置于临近排出歧管处，平行多孔表面和冷却区域适用于保持复数个生物材料容器。冷冻或冷藏系统的排出环路适用于去除来自冷却室排出歧管的制冷剂气体，而控制系统适用于调节入口环路内致冷剂源和排出环路中任何致冷剂气体的流动速率，以根据生物材料所需的冷却速率和冷却室内的测量温度，调节递送到冷却室的致冷剂冷气体的温度。采用这种方法，温度调节后的低温冷气体的均匀单向层流被递送到平行多孔表面和复数个容器中的每个之间的冷却区域，以均匀地冷却生物材料。

本发明的特征可以在于一种控速冷冻或冷藏生物材料的方法，包括如下步骤：(i)在由冷却室内的平行多孔表面之间的区域所限定的冷却区域内设置复数个生物材料容器；(ii)将液态致冷剂与较暖气体(warmer gas)混合，以产生选定温度特征的低温冷气体，所述温度特征与期望的容器内生物材料的冷却速率相对应；(iii)递送温度调节的低温冷气体的单向层流，通过多孔表面的一个至平行多孔表面和复数个容器的每个之间的冷却区域，以均匀地冷却生物材料；并且(iv)迅速地通过另一平行多孔表面从冷却室排出气体，以防止冷却区域内气体的再循环。

附图说明

本发明上述的和其他的方面、特征和优点将会通过以下更详细的、结合以下附图的描述而更加清楚，其中：

图1为一个实施方式的示意图，其适用于本系统和方法的均匀流动低温冷藏单元；

图2为图1所示均匀流动低温冷藏单元的剖面部分细节图，描述生物材料小瓶临近的致冷剂气体的均匀流动特征；

图3为单批均匀流动低温冷藏器单元的实施方式的图片，具有本发明系统和方法的特征和优点；

图4为多批或商业商业规模均匀流动冷却室的实施方式的示意图，具有本发明系统和方法的特征和优点；

图5为另一实施方式的连续型均匀流动冷却单元的示意图，具有本发明系统和方法的特征和优点；

图6到图8描述在本系统和方法的最初实验过程中观察到的，致冷剂气体的选定温度特征和与生物材料冷却速率的对应关系；

图9为多批或商业规模均匀流动冷却系统，更详细地描述了本过程和气体入口、排出和再循环环路方面更详细的图像。

具体实施方式

生物材料低温储藏通常包括生物样品从40℃或者更高快速冷却到大约-100℃或者更低的水平。所限定的温度、冷却速率、和材料温度作为时间函数表达的冷却特征(cooling profile)，高度取决于要冷冻的具体生物材料。大多数生物材料的低温储藏，冷冻过程必须精确控制。和小瓶之间及批次之间，温度、冷却速率以及冷却特征的一致性在生产过程中是非常重要的。

本发明公开的方法和系统代表了目前生物材料低温储藏过程的进步。本发明所公开的系统和方法具有快速冷却冷却单元内小瓶或其他容器内所包含生物材料的能力，主要通过采用在冷却单元内、邻近复数个小瓶的每个的、层状均匀流动的致冷剂强对流冷却。此外，本系统和方法可以提供生物材料的快速冷却，覆盖宽范围的冷却速率，并且也可将生物材料的温度保持在任何指定的温度。

更特别地，作为时间的函数，通过精确控制和调节被引入系统的致冷剂温度来达到生物材料的快速冷却。在一个方式中，公开的系统的实施方式适于提供致冷剂温度102的逐步或者快速下降(见图6)以产生更高程度的样品材料100内的低温冷却，由此使得小瓶内相变(例如水到冰的转化)的放热热效应最小化。在另一方式中，公开的本发明实施方式中，控速冷冻或者低温冷却系统和方法，适用于提供致冷剂冷气体温度以每分钟大约-4.5℃112(见图7)和每分钟大约-5.0℃(见图8)的方式斜降(ramp down)，以为样品生物材料提供快速冷却110，120，但使得任何小瓶间的温度变化最小化。

引入冷却室或者单元中致冷剂冷气体的温度，通过在即将把致冷剂冷气体引入到冷却单元之前，用较暖的氮气混合液态氮源来调节或控制。混合流动继而通过恰当的、如此处所述的致冷剂入口环路，被引入并散布到冷却单元各处。较暖的氮气优选来自供应源(supply source)的室温氮气或者从冷却单元排出并再循环到致冷剂入口环路中去的氮气。同冷氮液体或者气体混合的较暖的氮气，也作为一种动力气体，并且更优选地其体积流速数倍于液体或者冷氮气。通过将较冷的氮气流动适当地与较暖的氮气混合，本系统创造了致冷剂冷气体靶定的、跨越整个冷却区域的致冷剂层状和均匀的流动。通过对离开冷却单元的氮气的再循环，本发明公开的系统和方法还提供了比离开控速冷冻箱高的致冷剂(例如氮气)利用效率。

假设冷制冷剂气体的均匀流动跨越所有生物材料样品或者小瓶，已经发现精确控制致冷剂冷气体温度和致冷剂温度梯度，对于给定生物材料来说，与观测到的冷却单元内生物材料的冷却速率之间存在直接关联。例如，当提供到本发明的冷却单元的致冷剂冷气体温度变化，或者按照大约-4.5℃/min到大约-5.0℃/min改变或斜降，通过最小化小瓶与小瓶间的温度变化而达到生物材料的平均冷却速率大约为-2.5℃/min。(见图7和8)

现在转到图1和2，为冷却单元描述性的、选定的图像，称为均匀流动低温冷藏器10。如此处所见，均匀流动低温冷藏器10包括致冷剂入口环路12或者连结致冷剂源的导管(未示出)。均匀流动低温冷藏器10进一步包括基底气体注入盒14，布置或安装于气体注入盒14的顶面17内或附近的多孔金属板16，以及设置于基底气体注入盒14及其上多孔金属板19正上方的相应的气体排除盒18。做为选择地，能够耐受低温温度的支持高分子膜或者具有机械刻点或者化学腐蚀洞的其他多孔板的各种设置，均可用于代替所述多孔金属板。

连结气体注入盒14的多孔金属板16适合接收和保存复数个含有生物材料的小瓶20。同时设置于小瓶20内或附近的是复数个温度传感器25，用于向系统控制器(未示出)输入。致冷剂入口环路12或者导管进一步同气体注入盒14相连结，适用于接受致冷剂入口流动和跨越多孔金属板16均匀地分配致冷剂。致冷剂冷气体以一种均匀的方式流入气体注入盒14内的入口压力通风32，通过较低的保存有小瓶20的多孔金属板16，进入到冷却空间30，并且之后到也包括较高的多孔金属板19和排出歧管34的气体排除盒18。用过的氮气体通过排气环路28或者导管从排出歧管34中排出。

如上所述，小瓶20的冷却通过小瓶20和流动通过冷却空间30的低温冷气体27之间的热交换实现。低温冷气体27产生于致冷剂入口环路12中，通过利用适当的混合设备或阀36，将较暖的氮气混合于液态氮或者再循环来自气体排出环路28的用过的氮气来形成。小瓶20通常以比低温冷气体略慢的速率被冷却。小瓶20和低温冷气体27的温度差异为使得小瓶20温度下降的热驱动力。因此，通过按照特殊的温度特征精确控制低温冷气体27的温度，可能以任何温度特征来冷冻小瓶20。

优选地，低温冷气体的温度，更特别地，响应于设置在小瓶20上或附近的温度或热传感器25所显示平均温度主动地控制温度特征。在本发明的实施方式中，复数个小瓶20的平均温度被用作系统主动控制的输入。优选基于串联的控制方法学，其中包括小瓶温度在内的系统温度被监控并且被初级系统控制器所控制，初级系统控制器传送设置点信号和其他命令到负责调节入口环路内的低温冷气体温度的从属控制器。如以下详述的，低温冷气体温度特征是通过混合阀的有效(operative)控制实现的，混合阀用特定体积的较暖的氮气掺和特定体积的冷液态氮。掺和或混合优选是连续的操作，其作为时间的函数而变化，产生具有预先设定的温度特征温度的低温冷气体(也就是说，温度作为时间的函数而变化)。简言之，均匀流动低温冷藏器的有效温度控制通过控制入口环路内致冷剂冷气体的温度特征来实现。如上面讨论的，发现低温冷气体温度和温度梯度的精确控制与观察到的特定生物材料的冷却速率具有直接关联。

当低温冷气体进入到较低的气体注入盒14，低温冷气体27通过气体注入盒(未示出)内一系列向下的定向喷雾器管或者通道散布进入入口压力通风32。这种在入口压力通风32内的散布促使低温冷气体27跨越整个多孔金属板16均匀分布。低温冷气体27在入口压力通风32内向下的定向分布避免了低温冷气体27在多孔金属板16上的导致冷运动和不均匀冷却的直接冲击。气体注入盒14内的多孔金属板16推动低温冷气体27跨越整个均匀流动低温冷却器10的冷却区域30均匀地分布，那里存放有生物材料的小瓶或者其他容器。用过的氮被收集到位于气体排除盒18内的多孔板19上方的排出歧管34内。如图所示，冷的低温气体27只有短的路径从入口压力通风32穿过多孔板16向上进入到冷却区域30，通过高处的多孔板19进入到排出歧管34。低温冷气体流动单一方向和短距离导致低温冷却器10内小瓶20冷却的高水平一致性。多孔金属板16，19的孔径优选直径类似大约2到50微米，因为小孔加强了分布并导致冷却的均匀性。通过生物材料按照最优化的速率冷却或冷冻，细胞存活率增加了，产生潜在的更高的药效。

在溶液的冷冻点，结晶热使得溶液温度维持不下降，有时小瓶内的温度也会升高。采用一个或更多的设在选择控制的小瓶内或附近的热或温度传感器25，低温冷气体的温度可被调节，以根据需要将最优化冷却速率的温度偏差最小化。换言之，系统控制既可以预先编程也可以基于实时反馈操作。

包含在小瓶或容器内用于低温储藏的制药的、生物制药的或生物的溶液将会受益于本系统和方法。这样的生物或生物制药材料可包括微生物、组织、器官、干细胞、原代细胞、建立的细胞系、多细胞小机体、复杂细胞结构例如胚胎，或者溶液或混合物，包括活的或减毒病毒；核酸；单克隆抗体；多克隆抗体；生物分子；非肽类相似物；肽类，蛋白质，包括融合蛋白和修饰蛋白；RNA，DNA及其子类；寡核苷酸；病毒颗粒；及其类似材料或组分。用于存放生物材料的容器也可以包括小瓶、吸管(straw)、高分子袋、或者其他适当的容器形式。

图3，4和5描述了采用均匀流动方法或概念的本发明的控速冷冻器或低温冷却器的各种实施方式。更特别地，图3为具有控速冷冻器的单一组件单元40的图片，其适用于存放一个均匀流动低温冷却器。图3中绘出的单元40的外部支架(housing)为坚固的不锈钢支架，有具有配有入口管道42的气体注入盒44，压力通风系统，以及多孔板46和具有多孔板的气体排除盒48，排出歧管，以及排出环路。图中的单元尺寸大小为存放参照上述图1和2所述的单个片状均匀流动低温冷却器。

图4描述了多批或商业规模单元50，包括冷却室52，冷却室包括复数个架子或横杆54，用于存放多个均匀流动低温冷藏器集合。这样多批或商业规模单元50优选能够在每轮生产中低温储藏50,000或更多的小瓶或其他这样的容器。如图4所示，致冷剂入口环路56和用过气体排出环路58的设计和尺寸应使足够的致冷剂循环到多个单独的低温冷藏器60。控制系统70根据置于系统内部的温度传感器的输入，用于有效地控制供应至每个架子54或者每个低温冷藏器集合60的致冷剂冷气体的温度特征。

图5描述了另一种可能的商业规模实施方式，所述控速冷冻器或冷藏系统80以一种连续或装设有转运机(conveyorized)的方式进行操作。同样地，单元80和低温冷气体入口环路90和排气环路92的设计和尺寸，足以使足够的低温冷气体循环到具有入口和出口装置84的通道样冷却室82内、沿着传送机86设置的每一个容器或托盘集合88。在这种连续操作中，不同容器、小瓶或者托盘的冷却特征可以是如上关于批系统所述的以时间为基础的，也可以是以空间为基础的(例如室内的空间位置)。

精确控制生物材料冷却速率具有多种益处。例如，在水溶液中冷冻的生物材料，可能在冷冻和随后的融化过程中经历各种压力，这可能损害材料的功能或活性。冰形成可能使材料发生物理破坏或者在材料所具有的界面结合、渗透力、溶质浓度等方面产生剧烈变化。适当设计的冷冻过程可减轻这样的压力，并且本发明的系统和方法可精确控制冷冻过程以使所有小瓶内的冷冻材料按照设计的冷冻特征达到均匀性。

转到图9，显示低温冷却系统210，包括用于从致冷剂冷气体环路262接收低温冷气体260的冷却室220，液态氮源230，包括分相器234的液态供应环路232，气态氮供给240，气体供应环路242，再循环低温气250和气体再循环环路252。低温冷却系统210进一步包括基于可编程序逻辑控制器(PLC)的控制系统270，用于响应测量的温度和压力以及特定用户定义的包括所需冷却特征的参数，有效地控制液体环路。

所示冷却室220具有多个冷却架222，用于冷却大量的包括药物活性成分或活性生物分子的小瓶。低温冷气体260被从静止管路内(in-line)混合器263供应至冷却室220，静止管路内混合器263将精确计量供应的来自气态供应环路242的气态氮气流和来自气体再循环环路252的再循环低温气250，混入来自液态氮源230、通过液态供应环路232而来的液态氮。

低温冷气体260的温度优选采用设置于静止管路内混合器263下游的温度传感器264测量。通过精确调节来自具有从气体供应环路242而来氮气体的液态供应环路232和气体再循环环路252的氮流动，可快速转变低温冷气体260的温度，使得冷却室220内小瓶的冷却具有一宽范围的冷却特征，以最优化运行条件和最大化细胞生存力、药物均匀性，以及药效。

一旦低温冷气体260通过混合氮气体与液态氮而形成，它被分到单个冷却室220内的多个水平的冷却架222上。为了让低温冷气体260准确分到多个冷却架222，采用多个临界流动孔265将低温冷气体260分为多个气流。在临界阻遏流动条件下，流至冷却架222的低温冷却气流动不依赖于下游压力而得到保持。使用大的低温冷气体歧管266去消除或最小化临界流动孔265上游的压力差，而下流气体流动阻力对通过临界流动孔265的气体流动没有影响。按照这种方法，到冷却室220中每一个冷却架222的低温冷却气流几乎是一致的。

低温冷却器系统210为直接接触的冷却系统，具有按照每一个小瓶的相同方向，优选地沿着小瓶的纵向方向，流动的低温冷气体260，由此建立所有小瓶的非常均匀的冷却特征。多孔金属膜(见图1和图2)跨越所有冷却表面提供均匀阻力，由此使得每个小瓶收到相同或均匀量的制冷效果。

氮气体供应240优选从大存储罐(bulk storage tank)接收，且通过过滤器244导向去除颗粒材料。然后氮气体供应240通过排出压力调节器245控制下降到所需压力。压力调节器245之前和之后的管线压力(Line pressures)优选采用一个或更多个压力指示器246监控。

质量流量控制器247(mass flow controller)，包括具有电-气动控制阀249的质量流量传感器248，优选地用于控制和保持通过气体供应环路242到静止管路内混合器263的精确供给的氮气体流动速率。电磁阀243(electrical solenoid valve)，也包括在气体供应环路242之中，当低温冷却系统210不工作的时候，用于提供主动切断能力(positiveshut off capability)。在控制系统270内可以安装警告器，如果需要紧急关闭低温冷却系统210时，可以让电磁阀243失效。

示例性系统包括气体即空气的附加源，用于操作各种控制阀。所示空气供应环路215包括过滤器216，用于去除线路内任何颗粒；压力调节器218，为了实现安全操作用于减少气体压力到25磅/平方英寸(psig)；以及一个或更多个压力指示器219，用于监控气体供应环路215的压力。

液体氮供应环路232包括液态氮源230，分相器234，一个或更多个温度和压力传感器233，液体氮歧管235，一个或更多个安全/减压阀236，滤网237，以及初级低温流动控制阀238。所有液态氮管道优选隔热的，以将液态氮到氮气的任何相变化最小化和在液态氮供应环路232内的任何管道内均形成双相流动。

液态氮分相器234设计为去除在液态氮供应环路232中，由于热渗透或管线压力变化而形成的任何氮气。示例性的分相器234为两侧直立的、垂直安装的、圆柱状的罐。内部的液态导管具有最大允许工作压力(maximum allowable working pressure，MAWP)额定值250psig，外部导管具有真空绝热性。气相排气阀239有效地控制分相器234被来自液态氮源230的液态氮的填充。在低液态水平下，气相排气阀239打开以释放280来自分相器234的蒸汽压使得来自液态氮源230的液态氮发生转化。由于分相器234内的液态氮水平增加，气相排气阀239开始关闭并且填充率下降，直到阀239完全关闭，液态氮停止填充分相器234。

过滤器237连结于排放安全阀(blow-down relief valve)236A，根据需要清洁过滤器237或者净化任何从液态氮供应环路232蒸发的氮气。过滤器237也用于过滤掉任何液态氮中的微粒，以避免不良性能或对初级低温控制阀或安全阀的损害。

安全阀的例子之一是低温电学电磁阀(cryogenic electrical solenoidvalve)236B，用于提供液态氮供应的主动切断。使电学电磁阀236B失效会切断通过液态氮供应环路并到静止管路内混合器263的所有液态氮流动。这种电学电磁阀236B被设置为切断电源，立即停止液态氮通过液态氮供应环路232的环路和出口280任何从环路捕获到液态氮的流动。此外，其他控制系统270内部的切断操作和紧急关闭过程产生到达一个或更多个安全阀236的命令信号。例如，当低温冷藏系统210已经在冷冻循环的末端停止工作，或者由于其他原因，包括预设警告情况，导致操作停止。控制系统270通过切断一个或更多个安全阀236而停止在液态氮供应环路232的液态氮流动。

初级低温流动控制阀238接受来自控制系统270的信号，响应在低温冷冻系统210内测量的温度和压力，以及特定用户设定的包括期望冷却特征在内的参数，来控制液态氮供应到低温冷气体循环262的量。

来自液态氮供应环路232的液态氮被引导到静止管路内混合器263。液态氮通过与引自气体供应环路242和气体再循环环路252的氮气体混合而蒸发，成为低温冷气体260。静止管路内混合器263用于保证没有小块的未蒸发液态氮进入到冷却室220。低温冷气环路262的温度采用置于静止管路内混合器263出口上或附近的温度传感器264来监控。控制系统270接收这种测试温度，调节向静止管路内混合器263的、响应其相应的基于规划的温度特征和预设参数的液态氮流入率和气体流动速率。

静止管路内混合器263的下游，低温冷气体260引导到大的低温冷气歧管266，然后通过多个临界流动孔265到冷却室220内的若干冷却架222。大的低温冷气体歧管266用于保证所有的气体分布点实现同样的或类似的压力。传递到冷却室220中每个冷却架222上真正的低温冷气体流动速率取决于每一个冷却架222相关的临界流动孔265的尺寸。

在每个水平的冷却室220内，有一系列具有向下的喷嘴的气体分布管。冷却室内附加的气体分布管的目的是避免或最小化速率产生的局部压力梯度，这可能影响跨越任何大多孔金属膜的低温冷气体分布。具有临界流动孔265和气体分布网络，大的冷却室可用于存放数千具有高度冷却均匀性的小瓶或包裹。

在若干水平的冷却室220内的冷却表面采用多孔金属膜227制成，适用于产生均匀的跨越多个小瓶的气体流动。由于金属膜227的小孔大小和高通量，产生于整个冷却表面的层流形成了。来自冷却表面的层流是优选的，而湍流气体流也可以，只要流动与小瓶保持平行并且气体宏观再循环(macro recirculation)不在冷却室220内部出现。

在冷却室220内每一水平的多孔金属膜上为排出歧管225，具有设置为平行方向、具有多孔金属膜227的多孔板，以保持小瓶冷却过程中低温冷气体260的均匀流动。在放气歧管225中接收的气体被立即从冷却室220中移除，以避免或者最小化任何内部用过的氮气的再循环流动。避免氮气的内部再循环是非常重要的，由于这样的再循环气体通常比供应到冷却室220的低温冷气体260温度高。这样的内部再循环流动是现有技术或传统层流冷却装置中具有边缘效应的温度不均匀性的主因。

从冷却室220中移除的排出气体优选地转移到气体再循环环路252中。示出的气体再循环环路252包括设置于冷却室220内的排出歧管225和再循环鼓风机254之间的再循环气体歧管253，再循环鼓风机254在冷冻循环的较后部分期间会自动开启。气体再循环环路252也包括与控制系统270连接的质量流量计(mass flow meter)255，用于测量穿过气体再循环环路252的流动，以调节来自气体补充环路242的补充气体流动速率，保持在低温冷气体环路262中低温冷却气260流动的期望水平。当再循环鼓风机254不工作的时候，止回阀(check valve)258使得来自气体供应环路242的补充氮气体不进入气体再循环环路252时，背压调节器256保持来自再循环鼓风机254的压力。安全减压阀259用于在气体再循环环路252中存在堵塞的情况下，为冷却室220提供超压保护。

冷却室220内部的压力和温度用压力计228和设置于冷却室220内接近一些小瓶的温度传感器229或者热电偶来监控。压力计228，温度传感器229的传感器以及热电偶与控制系统270连接并为控制系统270提供输入。

由于该过程是采用相同的设备且过程参数易于按比例放大(scale)或适于制造宽范围的生物制品，因此本发明的系统和方法特别适用于商用类型或商业规模生物产品操作。本发明所公开的方法提供了生物材料控制速率的冷冻，采用此方法可达到生物材料样品与样品、小瓶与小瓶、容器与容器、批与批之间冷却或冷冻的高度均匀性。

此外，经过仔细检查，图5-8示出本发明的冷冻或冷藏方法可作为一种开始和控制生物材料冷冻晶核形成的手段。如图5～8所示，所有小瓶中监控到的生物材料冷冻晶核形成出现在大约相同的时间和相同的温度。作为样品中相变出现过程中发生的放热过程的结果，冷冻晶核形成是在样品温度的短暂峰值的同时出现的(见100，110，120)。因此，采用上述控制冷冻系统和方法，控制晶核形成是可能通过精确控制剧烈的或快速的温度淬灭的时机和幅度来实现的。当比较来自使用传统的控速冷冻器的冷冻晶核形成的时机和温度的较宽谱的结论时，本系统和方法提供了一种更高度控制，这可能影响保存生物材料的其他性能方面和特征。由于预期的晶核形成开始和控制是受温度推动的，因此本发明在开放或封闭的容器或小瓶中也可以起到同样好的作用。

优选地，图3，4，5和9中单元支架是压力等级支架，以便本发明控速冷冻方法可与控制晶核形成系统和方法组合或者合并控制晶核形成系统和方法的一些方面，例如在美国专利11/702,472所整体描述的。

根据之前所述，可以理解本发明提供了一种生物材料控速冷冻系统和方法。本发明方法的各种修饰、变化和改变，对本领域技术人员来说是明显的，可以理解这样的修饰、变化和改变包括在本申请的范围内和权利要求的精神和范围内。