应用膜技术从丹参提取液中分离纯化有效成分的方法

摘要

本发明是一种应用膜技术从丹参提取液中分离纯化有效成分的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)丹参提取液的制备；(2)固液分离；(3)微滤除沉；(4)超滤分离；(5)纳滤浓缩；(6)真空干燥；本方法以具有选择透过性的膜为分离介质，提取液中的有效成分依据滤膜孔径的大小或通过或被截留，从而达到分离、浓缩的目的；本方法能较好的实现了中药有效部位的分离，充分保留了中药的药效，同时还能显著缩短生产周期，降低生产成本及能耗，确保提取分离物用于制备中药制剂及药酒时产品质量的稳定。

说明书

(一)技术领域：本发明涉及一种从丹参药材中提取有效成分的方法，特别是应用膜技术从丹参提取液中分离纯化有效成分的方法。

(二)现有技术：丹参为双子叶植物唇形科Labiatae丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用的一种中药。丹参作为治疗心血管方面的药物，具有显著的药理作用。丹参有效成分可以加强心肌收缩力、改善心脏功能，不增加心肌耗氧量；对血管方面，可以扩张冠脉，增加心肌血流量；扩张外周血管，血流增加，脑血流量下降，故常用于配制复方中药制剂或药酒。

最近几年，随着现代医学技术的发展，结合化学、分子生物学和细胞生物学等多种学科技术，对丹参进行了系统的研究。丹参的水溶性成分主要有丹酚酸A、B、C、D、E，丹参素等，其中丹酚酸类活性最强。经药理实验证实，丹酚酸B具有抗脂质过氧化，消除自由基和抗血栓作用。因此丹参广泛应用于生物制药和保健食品方面，具有广阔的运用前景。

目前丹参提取液的分离多以成分间的极性差异为基本原理而分离杂质(有机溶剂沉淀、萃取等)，而浓缩也基本以单效、双效浓缩为主，这些传统工艺在实际生产中不同程度的存在着较多不足。首先是有效成分损失严重，中药中的部分有效成分本来含量就很低，再经溶剂沉淀、萃取或硅藻土过滤等除杂工艺，这些成分可能全部被除去，并且由于杂质沉淀时的吸附和包埋等因素，也造成了其它有效成分较大的损失；另外是污染环境，如硅藻土过滤过程中，产生大量的废弃硅藻土，给环境造成了较大污染，并且容易引入一些新的杂质(硅酸盐等)，给产品稳定性造成较大影响。其次除杂效果不理想，丹参提取液中的鞣质、淀粉、树脂和蛋白等物质，用传统方法很难除尽，因而固体收率很高，当丹参提取物与其他中药半成品或基酒调配时亦会对产品的稳定性产生较大影响。再就是某些传统分离方法(大孔树脂吸附分离等)过分强调单个组分，使中药失去了原有的复方特色，影响药效，并且在食品行业中应用安全性较差。而在浓缩过程中主要存在着浓缩温度高，浓缩时间长，有效成分损失严重，一步浓缩难以实现高相对密度的质量要求，设备易结垢等问题。

(三)发明内容：本发明的目的就是提供应用膜技术从丹参提取

液中分离纯化有效成分的方法；该方法以具有选择透过性的膜为分离介质，依据滤膜孔径的大小或通过或被截留，达到分离、浓缩的目的，实现了中药有效部位的分离，充分保留了中药的药效。同时根据丹参提取液的理化性质，以相应的考察指标，对膜的材质、膜管型号及操作条件进行了优化，实现了膜设备与丹参药材的匹配性，提高了膜设备抗污染的能力，使膜设备的分离效率得到进一步的提高；同时还能显著缩短生产周期，降低生产成本及能耗，确保制备中药制剂及药酒时产品质量的稳定。

本发明方法包括下述步骤：

(1)丹参提取液的制备

将丹参药材以三罐逆流方法进行提取，得提取液；

(2)固液分离

将丹参提取液进行离心分离，时间为20-30min，转速为6000r/min以上，得离心液；

(3)微滤除沉

将上述离心液采用膜孔径为0.05～0.2um、膜材质为AL2O3的陶瓷膜机组进行微滤分离处理；操作温度30℃～60℃，操作压力0.2Mpa～0.5Mpa；微滤分离结束后，以截留液3倍量的纯净水对截留液顶洗三次，顶洗温度：30～60℃、顶洗压力：0.2Mpa～0.5Mpa，得微滤液；要求微滤液澄清透明，浊度≤3.00NTU，有效成分丹酚酸B透过率≥95％；

(4)超滤分离

将上述微滤液以1000～10000分子量的聚偏氟乙烯超滤膜管进行超滤，操作压力：0.8～1.0Mpa；操作温度：40～45℃，超滤膜分离结束后，用截留液2倍量的纯净水对截留液顶洗三次，顶洗温度：40～45℃，顶洗压力：0.8～1.0Mpa，得超滤液；

要求超滤液澄清透明，丹酚酸B透过率≥95％，浊度≤1.50，固形物中丹酚酸B成分含量≥60％；

(5)纳滤浓缩

将上述超滤液采用膜型号为200分子量，膜材质为聚酰胺的纳滤膜机组进行浓缩处理，浓缩温度40～45℃，操作压力：0.15～0.18Mpa，浓缩倍数：10～15倍，得截留液；丹参纳滤截留液质量要求：丹酚酸B截留率≥95％，固形物中丹酚酸B成分含量≥80％；

(6)真空干燥

对丹参纳滤截留液于50～80℃下进行真空干燥，即得。

所述丹参药材的提取方法是先将丹参药材平均加至A、B、C三罐中进行逆流提取，提取温度：60～70℃，提取溶剂为药材重量8～12倍量的30％的乙醇，在梯度形成阶段，A罐提取时间分别为5min、15min，B罐提取时间为10min；在提取阶段，各罐提取时间为2h；在提取结束阶段，提取时间为2h；结束后将各罐提取液合并即得丹参提取液。

上述膜的材质及型号选择是膜分离纯化丹参有效成分的关键因素。选用合适的膜能起到很好的分离纯化作用，同时减少膜污染。

微滤除沉单元我们选用0.05～0.2um孔径的陶瓷膜管除沉，可以除去大部分的颗粒杂质成分，减少后步超滤膜污染，保护超滤膜芯。同时陶瓷膜具有耐酸碱、耐高温的特点，膜通量大，清洗方便。

目前常用有机膜材料有醋酸纤维素、聚丙烯腈、聚醚酮、聚砜、聚酰胺等，按其对水的亲和力分类，大致可分为两类：疏水性膜材料和亲水性膜材料。醋酸纤维素、聚丙烯腈等亲水性膜材料对溶质吸附少，截留分子量较小，但热稳定性差，机械强度、抗化学药品性、抗菌侵蚀能力通常不高；聚砜、聚偏氟乙烯等疏水性膜材料机械强度高，耐高温、耐溶剂、耐生物降解，但膜透水速度低，抗污染能力较低。不同材质的有机膜其耐pH范围也大致不同，一般来讲PAN、PS、PVDF为pH2～13，CA为pH 5～6。丹参提取液是用30％乙醇提取而得，其有效成分的相对分子量一般在500～2000之间，pH值4～8，根据以上理化性质，因此选用材质为聚偏氟乙烯的超滤膜和聚酰胺的纳滤膜。

本发明所得干燥物技术指标：

产品纯度：丹参有效成分转移率≥85％，有效成分含量≥90％。

产品色泽：无杂质色泽。

产品香气：具有本品特有的气味，无明显的异味。

产品形状：疏松粉末状

产品水分：≤5.0％按照GB/T 14769执行。

产品灰分：≤5.0％按照GB/T 14770执行。

粗细度(80目通过率)：≥95％

丹参指标成分检测方法：

依据2005年版《中国药典》中丹参药材指标成分检测方法，经过验证，此方法稳定性、重现性较好。具体方法如下：

丹酚酸B含量测定方法：

1、采用高效液相色谱法测定(参照中国药典2005版)

2、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)为流动相；检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。

3、对照品溶液的制备   精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得。

4、供试品溶液的制备   取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5、测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

丹参提取液中化学成分十分复杂，除含有蒽醌类、黄酮类、糖类、氨基酸、挥发性成分(主要为有机酸及其酯)、甾体、环烯醚萜及其苷类化合物外，还含有大量的蛋白质、胶体、鞣质、淀粉、纤维素、无机盐等物质以及许多微粒、絮状物。化学成分相对分子质量分布较宽，为几十至几百万道尔顿，其中高相对分子质量的物质主要是胶体和纤维素等非药用性成分或药用性较差的成分，而有效成分如蒽醌类、糖类、甾体、环烯醚萜、苷类等的相对分子质量较小，一般都在50000以下。如丹参中的主要有效成分丹酚酸B(C36H30O16)，其分子量只有718.61。由此可见，丹参提取液中有效成分和非药用成分的相对分子质量差别很大，故选用适宜分子量截留值的超滤膜对提取液进行分离，可很好的实现去除杂质及浓缩的目的，以便于与其他中药半成品或基酒定量调配，确保产品的稳定性。

本工艺与传统工艺有着本质的区别，传统分离纯化工艺主要是利用不同组分在不同溶剂中溶解度的不同而实现分离；浓缩则是利用溶质和溶剂之间挥发度的差异，用加入热能的方法使溶剂汽化，而溶质则为非挥发性的，从而获得一个有利的气液平衡条件，达到浓缩的目的。

而本工艺是以具有选择透过性的膜为分离介质，在某种驱动力(压力差)的作用下，物料中不同分子量的成分依据滤膜孔径的大小或通过或被截留，达到分离、浓缩的目的，它实现了中药有效部位的分离，充分保留了中药的药效。同时在本工艺中，我们根据丹参提取液的理化性质，以透过液的浊度、膜通量变化趋势及指标成分(以丹酚酸B为丹参指标成分)的透过率为考察指标，对膜的材质、膜管型号及操作条件进行了优化，实现了膜设备与丹参药材的匹配性，提高了膜设备抗污染的能力，使膜设备的分离效率得到进一步的提高。应用本工艺所得各丹酚酸产品经检测表明：丹参素、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B的最高收率分别为85.55％、86.65％、99.27％、92.78％和99.34％，远高于传统工艺。提取物中有效成分的含量高达90％以上。

在丹参提取液分离浓缩过程中，与传统的提取分离浓缩工艺相比，现有工艺的主要优点有：

1、本发明采用多罐逆流提取代替传统的浸渍和热回流，有效地缩短了提取时间，减少了溶剂用量，提高了提取效率和有效成分转移率。

2、膜分离浓缩过程中无相变，有利于保存丹参有效成分的理化特性，且超滤、纳滤技术的应用会尽量多地保留丹参药材的多种有效成分，特别是可以保留丹参提取液中的一些微量成分。

3、提高了复方制剂或药酒的质量，较高相对分子质量非药效成分或低药效成分的存在，使中药有效部位的浓度降低，药效减弱，同时参与制备中药复方制剂或药酒时带来较大困难。而膜分离浓缩技术能最大限度地除去相对分子质量非药效成分或低药效成分，因而此技术能使产品质量得到较大提高。

4、由于不耗用有机溶剂，并且分离浓缩过程中不添加其它任何物质，因此与传统方法相比，膜分离浓缩技术可减少工序，缩短生产周期、降低生产成本，降低环境污染，且整个工艺可连续进行，利于大规模生产。

5、本发明对分离目标成分具有较高的选择性，可根据市场对产品的要求，改变微滤膜的规格和操作条件，从而很方便地控制所得产品的目标物质组成。

(四)具体实施方式：

实施例1

1、丹参提取液的制备

将经整理干净后的丹参药材平均加至A、B、C三罐中进行逆流提取，提取温度：60℃，提取溶剂为药材重量8倍量的30％的乙醇，在梯度形成阶段，A罐提取时间分别为5min、15min，B罐提取时间为10min；在提取阶段，各罐提取时间为2h；在提取结束阶段，提取时间为2h；结束后将各罐提取液合并即得丹参提取液；

2、固液分离

由于丹参提取液中含有较多的固体颗粒杂质，直接用陶瓷膜除沉会造成膜的严重污染，降低膜的使用寿命，因而药液的预处理是保证膜使用性能的关键，并能延长膜的使用寿命。

将丹参提取液采用阿法拉伐碟片式离心机进行高速离心，时间为20-30min，转速为6000r/min以上，得离心液；离心后的沉淀直接排掉，要求离心液澄清透明；

3、微滤除沉

微滤分离处理主要去除丹参提取液中的一些细菌、悬浮颗粒和胶体类物质；将上述离心液采用膜孔径为0.05um、膜材质为AL2O3的陶瓷膜机组进行微滤分离处理；操作温度30℃，操作压力0.2Mpa；微滤分离结束后，以截留液3倍量的纯净水对截留液顶洗三次，顶洗温度：30℃，顶洗压力：0.2Mpa，得微滤液；要求微滤液澄清透明，浊度≤3.00NTU，有效成分丹酚酸B透过率≥95％；

4、超滤分离

将上述微滤液以1000分子量的聚偏氟乙烯超滤膜管进行超滤，操作压力：0.8Mpa，操作温度：40℃，超滤膜分离结束后，用截留液2倍量的纯净水对截留液顶洗三次，顶洗温度：40℃，顶洗压力：0.8Mpa，得超滤液；

要求超滤液澄清透明，丹酚酸B透过率≥95％，浊度≤1.50，固形物中丹酚酸B成分含量≥60％；

5、纳滤浓缩

将上述超滤液采用膜型号为200分子量，膜材质为聚酰胺的纳滤膜机组进行浓缩处理，浓缩温度40℃，操作压力：0.15Mpa，浓缩倍数：10倍，得截留液；丹参纳滤截留液质量要求：丹酚酸B截留率≥95％，固形物中丹酚酸B成分含量≥80％；

6、真空干燥

对丹参纳滤截留液于50℃下进行真空干燥，即得。

实施例2

1、丹参提取液的制备中的提取温度为70℃，提取溶剂为药材重量12倍量的30％的乙醇；余同实施例1

2、固液分离

同实施例1

3、微滤除沉

将上述离心液采用膜孔径为0.2um、膜材质为AL2O3的陶瓷膜机组进行微滤分离处理；操作温度60℃，操作压力0.5Mpa；微滤分离结束后，以截留液3倍量的纯净水对截留液顶洗三次，顶洗温度：60℃、顶洗压力：0.5Mpa，得微滤液，余同实施例1；

4、超滤分离

将上述微滤液以10000分子量的聚偏氟乙烯超滤膜管进行超滤，操作压力：1.0Mpa，操作温度：45℃，顶洗温度：45℃，顶洗压力：1.0Mpa，得超滤液；余同实施例1；

5、纳滤浓缩

浓缩温度45℃，操作压力：0.18Mpa，浓缩倍数：15倍，得截留液；余同实施例1；

6、真空干燥

对丹参纳滤截留液于80℃下进行真空干燥，即得。

实施例3

1、丹参提取液的制备中的提取温度为65℃，提取溶剂为药材重量10倍量的30％的乙醇；余同实施例1

2、固液分离

同实施例1

3、微滤除沉

将上述离心液采用膜孔径为0.09um、膜材质为AL2O3的陶瓷膜机组进行微滤分离处理；操作温度60℃，操作压力0.5Mpa；微滤分离结束后，以截留液3倍量的纯净水对截留液顶洗三次，顶洗温度：45℃、顶洗压力：0.3Mpa，得微滤液，余同实施例1；

4、超滤分离

将上述微滤液以5000分子量的聚偏氟乙烯超滤膜管进行超滤，操作压力：0.9Mpa，操作温度：42℃，顶洗温度：42℃，顶洗压力：0.9Mpa，得超滤液；余同实施例1；

5、纳滤浓缩

浓缩温度43℃，操作压力：0.17Mpa，浓缩倍数：13倍，得截留液；余同实施例1；

6、真空干燥

对丹参纳滤截留液于70℃下进行真空干燥，即得。

本发明中所使用的30％乙醇(v/v)为食用级。