一种提升2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法

摘要

本发明公开了一种提升2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)生产强度的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明通过添加对普通生酮古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)混菌发酵生产2-KLG有显著促进作用的关键氨基酸—L-甘氨酸和L-脯氨酸的方法，达到提升2-KLG生产强度的目的。当用L-甘氨酸和L-脯氨酸强化玉米浆关键氨基酸成分时，发酵周期缩短至40h(缩短21.6%)，2-KLG浓度可达80.29g·L

说明书

技术领域

本发明涉及一种提升2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，尤其是一种通过添加外源关键氨基酸以提高生产强度的方法，属于微生物发酵工程领域。 

背景技术

维生素C，又称L-抗坏血酸 (L-ascorbic acid)，作为人体必需的一种水溶性维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，其工业化生产普遍采用“二步发酵”工艺，即第一步反应与“莱氏法”相同，由D-葡萄糖加氢生成的D-山梨醇先经细菌，如生黑葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter melanogenus)、弱氧化醋酸杆菌 (Acetobacter suboxydans)或生黑醋酸杆菌 (Acetobacter melanogenum) 发酵转化为L-山梨糖；第二步为“二步发酵法”最主要的特点：由普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare，原来鉴定为Gluconobacter oxydans) 和巨大芽胞杆菌 (Bacillusmegaterium) 组成的混合菌系催化L-山梨糖到维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 的反应。 

前期研究结果认为，普通生酮古龙酸菌具有转化L-山梨糖生产2-KLG的细胞酶活力，2-KLG的生成是普通生酮古龙酸菌生长代谢的结果，而巨大芽孢杆菌没有产2-KLG的生物酶活力，不能利用L-山梨糖，只起伴生作用促进普通生酮古龙酸菌生长、产酸。关于两菌生理关系的理解，目前的研究认为：巨大芽胞杆菌胞外液中具有促进生长作用的组分分子量在100 KDa以上；具有促进产酸作用的组分分子量为30~50 KDa和大于100 KDa两个部分，其中30~50 KDa范围的伴生菌胞外液活性组分为蛋白质，这些活性物质的释放过程与芽孢的裂解过程紧密相关。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提升2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 生产强度的方法。 

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为： 

以普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)组成的混合菌系生产2-酮基-L-古龙酸过程中添加外源L-甘氨酸和/或L-脯氨酸，从而提升2-KLG生产强度。本发明所用菌株普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare) 和巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)混合菌系为江苏江山制药提供的菌株（一种2-酮基-L-古龙酸高浓度发酵生产工艺，申请号：200810180630.6）。

所述普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌组成的混合菌可大量积累2-KLG。 

所述L-甘氨酸浓度为0.1~ 1.0 g·L^-1，优选为0.21 g·L^-1。 

所述L-脯氨酸浓度为0.1~ 1.0 g·L^-1，优选为0.24 g·L^-1。 

具体步骤为： 

 (1)“一步发酵”培养

取新鲜黑醋酸杆菌斜面，接种于“一步发酵”种子培养基 (75 mL/750 mL锥形瓶)，33??C，200 rpm振荡培养16 h。将培养液按10%接种量转接种子罐 (65 L/100 L搅拌罐) 进行扩大培养。初始种子培养基pH值通过2 mol·L^-1醋酸溶液调为5.1~5.5，整个培养过程中不对pH值进行控制，培养温度、搅拌转速及通气量分别设置为35°C，150 rpm和1 vvm (volume/volume/minute)。L-山梨糖含量达85 g·L^-1以上到达终点后，将种子液以10%接种量转接发酵罐 (650 L/1000 L 搅拌罐)，培养条件同上述种子罐。当醇糖转化率达到98%以上即为发酵终点。获得的培养液通过巴氏消毒法 (80°C, 30min) 灭活黑醋酸杆菌，冷却至20~30°C后无菌保存，备用。

(2)“二步发酵”培养 

取普通生酮古龙酸菌和巨大芽胞杆菌混菌斜面接种于“二步发酵”种子培养基 (75 mL/750 mL锥形瓶)，30??C，200 rpm振荡培养18 h。将培养液按10%接种量转接种子罐 (65 L/100 L搅拌罐) 进行扩大培养。初始种子培养基pH值用25% Na₂CO₃溶液调为6.7~7.0，整个培养过程中不对pH值进行控制，培养温度、搅拌转速及通气量分别设置为30°C，150 rpm和1 vvm (volume/volume/minute)。产酸达5~10 g·L^-1，pH值≤6.7时，将二步种液按10%接种量转接发酵罐 (350 L/1000 L 搅拌罐)。初始L-山梨糖浓度为15~25 g·L^-1，发酵4~8h后开始连续流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，控制流加过程中L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，当流加总糖浓度达到80~85 g·L^-1时流加结束。发酵起始pH值6.7~7.0，24~40 h后调pH值7.1~7.3，发酵40~44 h调pH值7.4~7.6，直至发酵结束。整个发酵过程控制溶解氧在30~50%。

本发明的原理：本研究室利用蛋白质组学、基因组学技术考察了巨大芽孢杆菌裂解液对普通生酮古龙酸菌氨基酸合成的影响，分析了普通生酮古龙酸菌自身氨基酸合成途径，并结合不同批次玉米浆对氨基酸成分和2-KLG发酵的影响，得出L-甘氨酸和L-脯氨酸是对2-KLG发酵有重要影响的两种关键氨基酸。 

相关培养基： 

“一步发酵”种子培养基 (g·L^-1)：D-山梨醇 170，大豆蛋白胨 2.5，酵母膏2.5，NaCO₃ 1.5。用2 mol·L^-1醋酸溶液调起始pH值为5.1~5.5，121??C灭菌15 min；

“一步发酵”发酵培养基 (g·L^-1)：D-山梨醇 220，酵母膏 0.46，大豆蛋白胨 0.38，CaCO₃ 1。用2 mol·L^-1醋酸溶液调起始pH值为5.1~5.5，121??C灭菌15 min；

“二步发酵”种子/斜面培养基 (g·L^-1)：L-山梨糖 20，酵母膏 3，蛋白胨 10，牛肉膏 3，玉米浆1.5，尿素 1，CaCO₃ 1，MgSO₄ 0.2，KH₂PO₄ 1，琼脂 20 (斜面培养基)。用2 mol·L^-1 NaOH溶液调起始pH值为6.7~7.0，121??C灭菌15 min；

“二步发酵”发酵初始培养基 (g·L^-1)：L-山梨糖 20，尿素 12，CaCO₃ 5，MgSO₄ 0.1，KH₂PO₄ 1，玉米浆 5。L-甘氨酸和L-脯氨酸在发酵起始时添加，用25% Na₂CO₃溶液调起始pH值为6.7~7.0，121??C灭菌15 min， L-甘氨酸浓度为0.1~ 1.0 g·L^-1，优选为0.21 g·L^-1； L-脯氨酸浓度为0.1~ 1.0 g·L^-1，优选为0.24 g·L^-1。

2-KLG和L-山梨糖浓度的测定方法： 

2-KLG碘量法测定：准确吸取样品2 mL，于25 mL试管中，加入2 mL 7 mol·L^-1的硫酸，摇匀于沸水中加热煮沸25 min，取出稍冷后用蒸馏水分次洗入250 mL三角瓶中，以淀粉为指示剂，用0.1 mol·L^-1碘标准溶液滴定至蓝色 (30 s不褪色即可) 为终点。

2-KLG含量计算公式： 

式中：

C—I₂液浓度 (mol·L^-1)

V—I₂液消耗数 (mL)

0.9072—维生素C分子量/2-KLG分子量

8.806—由反应式推出1 mL 0.1 mol·L^-1碘液相当于8.806 mg的维生素C

A—2-KLG转化为维生素C的转化率 (%)，(按63.08%计算)

B—吸取发酵液的mL数 (2 mL)

L-山梨糖甘油酮法测定：准确吸取样品0.5 mL (含量高可吸取0.25 mL)，于250 mL锥形瓶中，加入20 mL甘油酮试剂，以蒸馏水冲洗瓶壁，使总体积为50 mL左右，由滴定管加入适量的标准L-山梨糖 (离终点前1.5 mL于电炉加热煮沸)，加次甲基兰指示剂3滴，以半秒半滴的速度滴至终点 (蓝色消失出现砖红色)。

L-山梨糖 (g·L^-1)=(V1-V2)×C/0.5 

式中：

V₁—空白 (即20 mL甘油酮) 消耗标准糖的 mL数

V₂—加入样品后消耗标准糖的 mL数

C—标准L-山梨糖溶液的浓度 (g·L^-1)

0.5—吸取样品的 mL数 

本发明以胞外大量积累2-KLG的维生素C生产菌株普通生酮古龙酸和巨大芽孢杆菌组成的混合菌系为生产菌株，通过在“二步发酵”培养基中添加0.21 g·L^-1 L-甘氨酸和0.24 g·L^-1 L-脯氨酸，发酵周期缩短至40 h (缩短21.6%)，终点2-KLG浓度为80.29 g·L^-1，2-KLG产酸速率达到2.00 g·(L·h)^-1 (增加32.4%)。此外本发明采用2步法发酵，首先将将L-山梨醇转化为L-山梨糖，为二步发酵提供原料，降低了成本。

附图说明

图1  添加L-甘氨酸和L-脯氨酸对2-KLG发酵的影响 

A：对照；B：0.21 g·L^-1 L-甘氨酸 + 0.24 g·L^-1 L-脯氨酸

■: 2-KLG;     ▲: L-sorbose。

 图2  添加0.21 g·L^-1 L-甘氨酸 和 0.24 g·L^-1 L-脯氨酸对2-KLG发酵的影响

■: 2-KLG;     ▲: L-sorbose

 具体实施方式

具体实施方式

本专利“一步发酵”所用菌株为黑醋酸杆菌 (Acetobacter melanogenum)，“二步发酵”所用菌株为普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)组成的混合菌系。 

实施例1

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为16.15 g·L^-1，发酵6 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵39 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为77.09 g·L^-1，发酵周期51 h，产酸速率1.51 g·(L·h)^-1（图1）。

实施例2

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为10.15 g·L^-1，添加0.21 g·L^-1L-甘氨酸和0.24 g·L^-1L-脯氨酸，发酵4 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵29 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为80.29 g·L^-1，发酵周期40 h，产酸速率2.00 g·(L·h)^-1（图2）。

实施例3

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为10.15 g·L^-1，添加0.1 g·L^-1L-甘氨酸和0.8 g·L^-1L-脯氨酸，发酵4 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵29 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为78.34 g·L^-1，发酵周期43 h，产酸速率1.88 g·(L·h)^-1。

实施例4

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为10.15 g·L^-1，添加1.0 g·L^-1L-甘氨酸和0.5 g·L^-1L-脯氨酸，发酵4 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵29 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为79.53 g·L^-1，发酵周期42 h，产酸速率1.93 g·(L·h)^-1。

实施例5

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为10.15 g·L^-1，添加0.6 g·L^-1L-甘氨酸和1.0 g·L^-1L-脯氨酸，发酵4 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵29 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为80.24 g·L^-1，发酵周期40 h，产酸速率2.03 g·(L·h)^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。