携带视网膜色素上皮细胞衍生因子的超顺磁纳米载体

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种携带视网膜色素上皮细胞衍生因子的超顺磁纳米载体。本发明通过纳米技术制备超顺磁纳米铁微粒，功能化修饰其表面，将视网膜色素上皮细胞衍生因子构建在含绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒相关表达载体AAV-GFP上，进而将USPIO与AAV-GFP交联，体外诱导胶质瘤细胞将其吞噬。本发明利用所述载体其磁性标记作用，活体无创监测PEDF对脑胶质瘤生长、分化、侵袭性的影响，为胶质瘤基因治疗的临床应用开辟新的导入及监测途径，为临床抗肿瘤治疗的研究提供创新性的操作手段和积累探索性的试验经验。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种携带视网膜色素上皮细胞衍生因子(PEDF)的超顺磁纳米载体(PEDF-USPIO)。

背景技术

研究显示，脑胶质瘤源自脑内神经胶质细胞，是最常见的脑部恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的50％，其恶性表型以迅速增殖、局部侵袭和血管生成为主要特征。虽然对胶质瘤治疗的许多研究工作在进行，但其发生、发展和恶化的机理以及相关治疗方法却一直未见明显的突破。临床实践显示，即使经历了手术、术后放射治疗以及化学治疗，甚至应用还不成熟的生物治疗等方法，大多数患者复发和进展仍不可避免，所以发现和开辟新的治疗方法已成为研究者们关注的热点。

视网膜色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)是一种神经营养因子，最先在胎儿视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial，RPE)培养液中发现，它可以诱导体外培养的视网膜神经母细胞瘤细胞Y79分化，继而，研究发现它存在于人体许多组织中，特别在脑组织中有大量表达。PEDF除了对培养的视网膜母细胞瘤细胞中有神经营养作用，对正常神经细胞也有作用。Taniwaki等研究发现，PEDF对正常小脑颗粒细胞(cerebellar granule cell，CGC)有营养作用；Bilak等发现PEDF还能维持脊索的大体形态和神经元总数；PEDF可以有效地促进脊髓运动神经元的生长分化，避免神经变性；除了营养神经效果，PEDF还能通过激活NFkappaB和ERK1/2途径，有效保护神经元免受谷氨酸盐介导的神经毒性侵害。Sugita和同事还观察到PEDF另一个惊人的特性。随着神经元的死亡，CGC培养液中原先混有的胶质细胞会迅速增殖，最后会占据整个培养皿。然而存在PEDF的情况下，星形胶质细胞生长相当缓慢，小胶质细胞形态改变，加速衰老。PEDF完全阻止集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulation factor，GMCSF)对胶质细胞的分裂作用，被称之为“胶质细胞静息”效应。PEDF还能有效抑制新生血管形成，PEDF抑制血管内皮细胞移行的活性比血管生成抑制素(angiostatin)、血小板反应素-1(thrombospondin-1)、内皮细胞抑制素(endostatin)都要高，故PEDF被视为目前最有效的内源性的新生血管抑制因子之一。

PEDF的神经营养、神经保护特性，对新生血管抑制作用以及独特的“胶质细胞静息”效应，让研究者联想到PEDF对许多中枢神经系统的肿瘤，尤其是胶质瘤的治疗可能不无益处，

随着基因治疗进入临床前期实验，其可操作性存在较多争议：如何有效地将治疗基因导入患者肿瘤细胞内成为基因治疗临床应用需克服的一个难点。随着“分子影像”时代的来临，将肿瘤特异性标记探针与先进成像技术相结合，则革命性的改变了临床对肿瘤诊治研究的手段。用磁共振探测大分子，必须使用特异结合配体，这些配体尚需与MR对比剂相共轭以产生可探测的信号差异；同理，对细胞的显示则要用对比剂标记目的细胞。钆螯合剂虽然可以用于MR分子或细胞成像，但此类对比剂的驰豫性较低，细胞内摄后会进一步减低，而且钆剂不具备生物相容性，对其去螯合后潜在毒性的了解甚少。USPIO则具备以下特性：1)可以产生单位金属MR信号的最大变化，且含有数以千计的铁原子，大大提高了MRI的敏感性；2)由可生物降解的铁组成；3)其表面包被物(如葡聚糖)可以直接与功能基团和配体进行化学结合；4)易于用光镜和电镜显示；5)随大小变化可具有不同的磁属性，有利于其构象的研究。基于以上原因使得越来越多的研究使用USPIO作为MR分子和细胞成像的活体无创监测探针标记物。

纳米载体在介导基因转移方面除了非病毒载体的共同优势以外，由于其特殊的结构及表面电荷，具有很高的基因转移效率；可介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因的长期、稳定表达；可保护转导基因不受机体血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏，有利于目的基因在转导进入靶细胞后能更好、更稳定地发挥其作用；纳米本身具有抵抗或杀死某些病毒(包括HIV病毒)，因此纳米控释系统在基因转染与基因治疗领域的应用具有广阔的前景。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种携带视网膜色素上皮细胞衍生因子PEDF的超顺磁纳米载体。

本发明提供了一种携带PEDF的纳米磁性微粒载体，并利用其磁性标记作用，活体无创监测PEDF对脑胶质瘤生长、分化、侵袭性的影响，为胶质瘤基因治疗的临床应用开辟新的导入及监测途径，为临床抗肿瘤治疗的研究提供创新性的操作手段和积累探索性的试验经验。

本发明通过纳米技术制备超顺磁纳米铁微粒(USPIO)，功能化修饰其表面，将视网膜色素上皮细胞衍生因子(PEDF)构建在含绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒相关表达载体AAV-GFP上，进而将USPIO与AAV-GFP交联，体外诱导胶质瘤细胞将其吞噬。

本发明通过下述方法和步骤制备超顺磁纳米铁微粒(USPIO)

1)制备表面功能化超顺磁纳米铁微粒(USPIO)

利用化学共沉淀法合成纳米Fe₃O₄磁性离子，表面葡聚糖包被后，进行羧基化功能基团修饰，并利用透射电镜显示纳米磁性微粒(图1)。

2)合成人AAV-PEDF与USPIO交联制成基因载体(PEDF-USPIO)

(1)制备PEDF-USPIO载体：

按常规方法PCR扩增PEDF cDNA，将PCR扩增出的PEDF cDNA用BamHI和NcoI双酶切后，连入真核表达载体中，构建成AAV-PEDF表达载体。

本发明中，所述的真核表达载体为AAV-GFP。

(2)PEDF-USPIO载体的核磁成像：

上述PEDF-USPIO加入胶质瘤细胞培养基中，与细胞孵育，确定细胞内铁浓度与PEDF-USPIO的浓度以及孵育时间的关系。

本发明中，随着USPIO的浓度的增高，细胞内蓝染铁颗粒也增多。在USPIO浓度为150～180μg/ml时，显示对胶质瘤细胞的活性无明显的影响；但当USPIO的浓度达到230μg/ml，显示USPIO影响胶质瘤细胞的活性，表现为MTT法检测到死亡细胞增多以及流式细胞仪检测大量胶质瘤细胞凋亡。

本发明优选USPIO的浓度为180μg/ml，孵育时间为24小时。

研究显示，本发明制得的PEDF对胶质瘤生长的抑制作用。并为进一步将PEDF安全、特异、有效的导入胶质瘤细胞，以便进一步追踪观察其对肿瘤细胞生长、分化、侵袭的影响提供了有实践意义的参考数据。可进一步研制活体无创监测PEDF对脑胶质瘤生长、分化、侵袭性的制剂。

本发明实验采用的试剂，细胞，细胞培养基及真核表达载体等均可通过市购或通过现有技术获得。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1已经成功合成的表面功能化超顺磁纳米铁微粒

图2重组质粒AAV-PEDF双酶切图谱

图3PEDF-USPIO在含有纳米铁微粒培养基中24h时吞噬铁微粒。

具体实施方式

实施例1

一、表面功能化超顺磁纳米铁微粒(USPIO)的制备

利用化学共沉淀法合成纳米Fe₃O₄磁性离子，表面葡聚糖包被后，进行羧基化功能基团修饰，并利用透射电镜显示纳米磁性微粒，见图1。

二、合成人AAV-PEDF与USPIO交联制成基因载体(PEDF-USPIO)

1)PEDF-USPIO载体的制备：

将PCR扩增出的PEDF cDNA用BamHI和NcoI双酶切后，连入真核表达载体AAV-GFP中，构建成AAV-PEDF表达载体。经双酶切测序正确后(附图2)，取1mg磁性微球和20μg AAV-PEDF，分散在0.6ml的交联缓冲液中，50℃的振荡反应3h后，柠檬酸缓冲液室温下洗涤磁性微球3次，无糖核酸酶水在65℃洗涤2次。

2)PEDF-USPIO载体的核磁成像：

50μg/mL的PEDF-USPIO加入胶质瘤细胞培养基中，与细胞孵育3至96小时，决定细胞内铁浓度与PEDF-USPIO的浓度以及孵育时间的关系。

图3清晰的显示PEDF-USPIO在含有纳米铁微粒培养基中24h时吞噬铁微粒，证明PEDF-USPIO载体的成功构建。

由于USPIO的主要毒副作用来自于铁的含量，如果铁在体内含量过高，会引起肝硬化等危害，因此，本发明研究确定了USPIO的浓度，研究显示，随着USPIO的浓度的增高，细胞内蓝染铁颗粒也增多。当USPIO浓度为150～180μg/ml时，对胶质瘤细胞的活性无明显的影响；当USPIO的浓度达到230μg/ml，USPIO影响胶质瘤细胞的活性，表现为MTT法检测到死亡细胞增多以及流式细胞仪检测大量胶质瘤细胞凋亡。因此180μg/ml的USPIO作为最佳浓度用于后期实验中。