天花粉皂苷及其在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途

摘要

本发明公开了一种天花粉皂苷及其在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途。本发明天花粉皂苷的提取方法：先将原料天花粉粉碎，粉碎后加入水进行超声提取，提取后将其所得提取液进行萃取，萃取后将其上清液通过大孔吸附树脂进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化，纯化后先采用水洗脱至澄清，再用乙醇洗脱，最后将收集的乙醇洗脱液依次采用旋转蒸发干燥、真空干燥，干燥后得到天花粉皂苷。本发明产品天花粉皂苷具有显著延长小鼠断头后呼吸时间和呼吸次数、降低脑水肿、增加脑缺血动物的生存率和延长生存时间、减少脑梗塞面积、抑制体内血栓的形成等作用，并且毒副作用小。因而，本发明得到的天花粉皂苷对缺血性脑血管疾病具有较好的治疗作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种天花粉的提取方法及其有关用途，特别是涉及一种天花粉皂苷及其在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途。

背景技术

脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一，在全球范围内，每年死亡约460万人，同时其又存在发病率高和致残率高的特点。脑血管疾病分为缺血性和出血性脑血管病。前者临床较多见，约占全部脑血管病人的70～80%。由于脑动脉硬化等原因，使脑动脉管腔狭窄，血流减少或完全阻塞，脑部血液循环障碍，脑组织受损而发生的一系列症状。后者多由长期高血压病、脑血管畸形、颅内动脉瘤等因素所致，约占脑血管病的20～30%左右。由于颅内出血后常压迫脑组织，血液循环受阻，病人表现颅内压增高、意识障碍等症状。目前在治疗缺血性脑血管疾病时主要针对：抗凝治疗、溶栓治疗、脑保护剂、降纤治疗、钙离子拮抗剂治疗、抗血小板聚集治疗、清除自由基治疗等方法。但这些药物的治疗靶点单一，尽管有一定疗效，但迄今为止还没有一种特效药。由于脑血管疾病的发生发展机制复杂，涉及到多系统多环节的异常。而中药含多种有效成分，因此在治疗时可同时在多层次、多靶点、多环节发挥作用，且毒副作用小。目前，临床上用于治疗脑血管疾病的常用中药有银杏叶提取物、丹参提取物、三七皂苷等。

天花粉为葫芦科植物栝楼的干燥根，味甘、微苦，味微寒，具有清热泻火、生津止渴、消肿排脓之功效。主要来自栝楼(Trichosanthes kirilowiiMax)和双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harm），且栝楼和双边栝楼皆为2010版《中国药典》收载。但不局限于南方栝楼（T.da miaoshanensis C. Y. Cheng et Yueh）、大子栝楼（T.truncata C. B . Clarke）、王瓜（T. cucumeroides （Ser.） Maxim）、蛇瓜(T. anguinaL.)、日本栝楼（T. kirilowii Maxim Var japonica(Miq.)kitam）、大苞栝楼(T. tricuspidata Lour. )、异株栝楼（T. dioica Roxb.）、凤瓜（T. integrifolia ( Roxb.) kur）等。现代研究表明：栝楼含有多种黄酮类、三萜类和甾醇等化合物，具有扩张冠状动脉、提高耐缺氧能力等作用，而皂苷具有抗氧化、抗血小板聚集等多种作用，因而在防治心脑血管疾病中发挥重要药理作用。经对天花粉的系统研究发现，天花粉皂苷为天花粉的有效部位，但至今未见天花粉皂苷在制备用于治疗脑缺血、脑缺血/再灌注、脑梗塞等脑血管疾病药物中应用的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种天花粉皂苷及其在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途。本发明对原材料天花粉通过提取，得到天花粉皂苷有效部分，经动物实验结果表明，通过本发明得到的天花粉皂苷提取物具有显著延长小鼠断头后呼吸时间和呼吸次数、降低脑水肿、增加脑缺血动物的生存率和延长生存时间、减少脑梗塞面积、抑制体内血栓的形成等作用。因而，本发明得到的天花粉皂苷提取物对缺血性脑血管疾病具有较好的治疗作用。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种天花粉皂苷，所述天花粉皂苷是通过以下方法提取得到的：

a、将原料天花粉进行粉碎，粉碎后过20～60目筛，在粉碎后的天花粉中加入水，水的加入量为粉碎后天花粉的10～30倍，加入水后采用超声波提取器进行超声提取，提取时间为5～30min，提取次数为2～4次，将提取液进行合并；

b、将步骤a合并得到的提取液采用萃取仪进行萃取，萃取后得到上清液，将所得上清液先通过大孔吸附树脂进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化，纯化后将其样品先采用5～10倍柱体积的水洗脱至澄清，再用4～8倍柱体积的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；

c、将步骤b收集的乙醇洗脱液，采用旋转蒸发仪进行干燥，干燥后得到膏状天花粉皂苷，最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥、粉碎，得到粉状天花粉皂苷。

根据上面所述的天花粉皂苷，步骤a中所述超声波提取器的频率为20～40 kHz，功率为300～800W。

根据上面所述的天花粉皂苷，步骤b中所述采用萃取仪进行萃取时，采用的萃取溶剂为石油醚、正丁醇、氯仿和乙酸乙酯中的任一种；步骤b中所述采用萃取仪进行萃取时，采用的萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为1～50：1。

根据上面所述的天花粉皂苷，步骤b中所述萃取仪采用Ninson超声波萃取仪。

根据上面所述的天花粉皂苷，步骤b中所述大孔吸附树脂的型号为D101，D101B， D201，D301， D3520， AB-8，DM130，X-5， XDA-1， XDA-1B， XDA-7，H-20， H-30， H-40，H-60，HPD-100，HPD-300， HPD-600， NK-2， NKA-2， NK-9 和WLD中的任一种；所述大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为4～10：1；

所述采用硅胶柱层析法进一步纯化时，其硅胶目数为60～300目；所述采用硅胶柱层析法进一步纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为8～12 ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为50～85：14～40：1～10。

根据上面所述的天花粉皂苷，步骤b中所述采用5～10倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速为0.3～5ml/min；步骤b中所述用4～8倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为0.3～5ml/min，乙醇的体积浓度为20～95%。

根据上面所述的天花粉皂苷，步骤c中所述采用旋转蒸发仪进行干燥时，压力为0.01～1Mpa，干燥温度为40～80℃，旋转蒸发仪的旋转速度为1～120rmp，旋转蒸发干燥时间为2～5小时；

步骤c中所述将膏状天花粉皂苷进行真空干燥时，真空度为0.07～0.09Mpa，干燥温度为50～80℃，干燥时间为2～4小时。

一种上面所述的天花粉皂苷在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途。

根据上面所述的天花粉皂苷在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途，所述天花粉皂苷为天花粉皂苷或天花粉皂苷单体。

根据上面所述的天花粉皂苷在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途，所述天花粉皂苷为石油醚提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物或乙酸乙酯提取物。

本发明的积极有益效果：

1、通过本发明的技术方案可从天花粉中提取到天花粉皂苷，并且所提取到的天花粉皂苷，其纯度大于90%。

2、本发明经过大量的动物实验，其实验结果表明：本发明从天花粉提取到的天花粉皂苷具有显著延长小鼠断头后呼吸时间和增加呼吸次数、降低脑含水量、增加脑缺血动物的生存率和延长生存时间、减少脑梗塞面积、改变凝血纤溶系统、保护脑神经元、抑制体内血栓的形成等作用。因而，本发明从天花粉中提取到的天花粉皂苷对脑缺血、脑血栓、脑梗死等缺血性脑血管疾病具有很好的治疗作用，对缺血性脑血管疾病发生后的神经元具有很好的保护作用；并且天花粉皂苷毒性低、副作用小，使用安全、质量可控（详见具体实施方式中动物实验实施例）。

四、具体实施方式：

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

天花粉皂苷实施例：

实施例1：

本发明天花粉皂苷，是通过以下方法提取得到的，其详细步骤为：

a、将原料天花粉进行粉碎，粉碎后过20～60目筛，在粉碎后的天花粉中加入水，水的加入量为粉碎后天花粉的20倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为30 kHz，功率为400～450W）进行超声提取，提取时间为15～20min，提取次数为3次，将提取液进行合并；

b、将步骤a合并得到的提取液采用萃取仪（采用Ninson超声波萃取仪）进行萃取，采用的萃取溶剂为石油醚，石油醚萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为20：1，萃取后得到上清液，将所得上清液先通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为D101，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为6：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化（采用硅胶柱层析法进行纯化时硅胶目数为60～300目；采用硅胶柱层析法进行纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为10ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为83：16：1），纯化后将其样品先采用8倍柱体积的水洗脱至澄清（采用8倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速为1～2ml/min），再用6倍柱体积的乙醇洗脱（用6倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为2～3ml/min，乙醇的体积浓度为50～60%），收集乙醇洗脱液；

 c、将步骤b收集的乙醇洗脱液，采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为0.6Mpa，干燥温度为50℃，旋转蒸发仪的旋转速度为60rmp，旋转蒸发干燥时间为3小时），干燥后得到膏状天花粉皂苷，最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.085Mpa，干燥温度为55℃，干燥时间为3小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

实施例2：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤a中：水的加入量为粉碎后天花粉的10倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为20 kHz，功率为300～350W）进行超声提取，提取时间为5～10min，提取次数为2次，将提取液进行合并；

步骤b中：采用的萃取溶剂为正丁醇，正丁醇萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为30：1，萃取后得到上清液，将所得上清液通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为D301，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为8：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化（采用硅胶柱层析法进行纯化时硅胶目数为60～300目；采用硅胶柱层析法进行纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为8ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为76：22：2），纯化后将其样品先采用5倍柱体积的水洗脱至澄清（采用5倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速为0.5～1ml/min），再用4倍柱体积的乙醇洗脱（用4倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为0.5～1ml/min，乙醇的体积浓度为20～30%），收集乙醇洗脱液；

步骤c中：采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为0.5Mpa，干燥温度为60℃，旋转蒸发仪的旋转速度为65rmp，旋转蒸发干燥时间为3小时），最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.07Mpa，干燥温度为80℃，干燥时间为3小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

实施例3：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤a中：水的加入量为粉碎后天花粉的30倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为40 kHz，功率为750～800W）进行超声提取，提取时间为25～30min，提取次数为4次，将提取液进行合并；

步骤b中：采用的萃取溶剂为氯仿，氯仿萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为40：1，萃取后得到上清液，将所得上清液通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为AB-8，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为4：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化（采用硅胶柱层析法进行纯化时硅胶目数为60～300目；采用硅胶柱层析法进行纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为12ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为68.5：27.5：4），纯化后将其样品先采用10倍柱体积的水洗脱至澄清（采用10倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速为4～5ml/min），再用8倍柱体积的乙醇洗脱（用8倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为4～5ml/min，乙醇的体积浓度为30～40%），收集乙醇洗脱液；

步骤c中：采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为1Mpa，干燥温度为40℃，旋转蒸发仪的旋转速度为40rmp，旋转蒸发干燥时间为5小时），最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.08Mpa，干燥温度为60℃，干燥时间为4小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

实施例4：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤a中：水的加入量为粉碎后天花粉的15倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为25 kHz，功率为400～450W）进行超声提取，提取时间为10～15min，提取次数为3次，将提取液进行合并；

步骤b中：采用的萃取溶剂为乙酸乙酯，乙酸乙酯萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为10：1，萃取后得到上清液，将所得上清液通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为XDA-1，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为5：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化（采用硅胶柱层析法进行纯化时硅胶目数为60～300目；采用硅胶柱层析法进行纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为11ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为65：30：5），纯化后将其样品先采用6倍柱体积的水洗脱至澄清（采用6倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速为1～2ml/min），再用5倍柱体积的乙醇洗脱（用5倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为1～2ml/min，乙醇的体积浓度为70～95%），收集乙醇洗脱液；

步骤c中：采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为0.1Mpa，干燥温度为80℃，旋转蒸发仪的旋转速度为100rmp，旋转蒸发干燥时间为2小时），最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.09Mpa，干燥温度为50℃，干燥时间为2小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

实施例5：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤a中：水的加入量为粉碎后天花粉的25倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为35 kHz，功率为700～750W）进行超声提取，提取时间为20～25min，提取次数为4次，将提取液进行合并；

步骤b中：采用的萃取溶剂为正丁醇，正丁醇萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为5：1，萃取后得到上清液，将所得上清液通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为H-30，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为6：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化（采用硅胶柱层析法进行纯化时硅胶目数为60～300目；采用硅胶柱层析法进行纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为9ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为61：33：6），纯化后将其样品先采用7倍柱体积的水洗脱至澄清（采用7倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速2～3ml/min），再用6倍柱体积的乙醇洗脱（用6倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为2～3ml/min，乙醇的体积浓度为60～70%），收集乙醇洗脱液；

步骤c中：采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为0.8Mpa，干燥温度为50℃，旋转蒸发仪的旋转速度为120rmp，旋转蒸发干燥时间为3小时），最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.09Mpa，干燥温度为70℃，干燥时间为3小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

实施例6：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤a中：水的加入量为粉碎后天花粉的26倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为38 kHz，功率为600～650W）进行超声提取，提取时间为25～30min，提取次数为4次，将提取液进行合并；

步骤b中：采用的萃取溶剂为氯仿，氯仿萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为50：1，萃取后得到上清液，将所得上清液通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为HPD-300，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为7：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化（采用硅胶柱层析法进行纯化时硅胶目数为60～300目；采用硅胶柱层析法进行纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱，洗脱流速为10ml/min；所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为54：38.5：7.5），纯化后将其样品先采用9倍柱体积的水洗脱至澄清（采用9倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速3～4ml/min），再用7倍柱体积的乙醇洗脱（用7倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为3～4ml/min，乙醇的体积浓度为70～80%），收集乙醇洗脱液；

步骤c中：采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为0.05Mpa，干燥温度为80℃，旋转蒸发仪的旋转速度为120rmp，旋转蒸发干燥时间为5小时），最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.08Mpa，干燥温度为70℃，干燥时间为3小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

实施例7：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤a中：水的加入量为粉碎后天花粉的18倍，加入水后采用超声波提取器（所述超声波提取器的频率为28 kHz，功率为500～550W）进行超声提取，提取时间为20～25min，提取次数为3次，将提取液进行合并；

步骤b中：采用的萃取溶剂为氯仿，氯仿萃取溶剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为25：1，萃取后得到上清液，将所得上清液通过大孔吸附树脂（大孔吸附树脂的型号为NK-9，大孔吸附树脂与上清液二者之间的体积比例为6：1）进行分离纯化，接着采用硅胶柱层析法进一步纯化，纯化后将其样品先采用8倍柱体积的水洗脱至澄清（采用8倍柱体积的水洗脱时，其洗脱流速2～3ml/min），再用6倍柱体积的乙醇洗脱（用6倍柱体积的乙醇洗脱时，其洗脱流速为3～4ml/min，乙醇的体积浓度为80～95%），收集乙醇洗脱液；

步骤c中：采用旋转蒸发仪进行干燥（压力为0.3Mpa，干燥温度为70℃，旋转蒸发仪的旋转速度为80rmp，旋转蒸发干燥时间为4小时），最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥（真空度为0.08Mpa，干燥温度为70℃，干燥时间为3小时）、粉碎，得到粉状天花粉皂苷，其纯度大于90%。

动物实验实施例：

实施例1：天花粉皂苷对小鼠断头后呼吸时间和呼吸次数的影响

（1）实验方法：选体重20±2g的雄性小鼠45只，随机分为3组（n＝15）。对药物组灌服本发明提取的天花粉皂苷，剂量为40mg/kg，阳性对照组灌服尼莫地平22.5 mg/kg，空白对照组灌服等体积的蒸馏水，每天给药1次，连续给药3天。于末次给药1h后断头（耳后2mm处）观察小鼠自断头开始到喘息停止的时间和张嘴次数。    

（2）实验结果：如表1所示

表1 天花粉皂苷对小鼠断头后呼吸时间和呼吸次数的影响（X±S）

^**表示P＜0.01；^*表示P＜0.05。

（3）结论：由上述表1实验结果可见，本发明提取到的天花粉皂苷能非常显著的延长小鼠断头后呼吸时间和呼吸次数。实验结果证明天花粉皂苷对脑缺血动物有保护作用。

实施例2：天花粉皂苷对小鼠断头后脑含水量和脑指数的影响

（1）实验方法：选体重20±2g的雄性小鼠60只，随机分为4组（n＝15）。药物组灌服本发明提取的天花粉皂苷，剂量为40mg/kg，阳性对照组灌服尼莫地平22.5 mg/kg，假手术组、脑缺血对照组灌服等体积的蒸馏水，每天给药1次，连续给药3天。于末次给药1h后断头（耳后2mm处），称重后取脑、称重、干燥至恒重再次称重，两者的差值即为脑含水量。以t值检验各组与空白对照之间差异的显著性。

（2）实验结果：如表2所示

表2 天花粉皂苷对小鼠断头后脑含水量的影响

 

^**表示P＜0.01；^*表示P＜0.05。

（3）结论：由表2的实验结果可见，脑缺血模型组脑含水量及脑指数与假手术组比较有显著性差异，脑含水量增加，而天花粉皂苷治疗组脑含水量明显减少，与对照组有显著性差异，证明天花粉皂苷能减轻脑缺血动物的脑水肿。

实施例3：天花粉皂苷对脑缺血小鼠存活率的影响

（1）实验方法：昆明小鼠雄性40只，体重20±2g，随机分为生理盐水对照组、假手术组、天花粉皂苷组和尼莫地平组（阳性药物组），药物组灌服本发明提取的天花粉皂苷，剂量均为40mg/kg，阳性对照组灌服尼莫地平22.5mg/kg，对照组、假手术组灌服等体积的蒸馏水，每天给药1次，连续给药3天，于末次给药1h后3.5%水合氯醛麻醉后，颈部正中切口，钝性分离两侧颈总动脉，并在两侧颈总动脉下置线两根，打松结备用，等动物清醒后，结扎两侧颈总动脉，两线之间剪断。观察结扎6h内动物反应及死亡情况。

（2）实验结果：如表3所示

表3 天花粉皂苷对脑缺血小鼠存活率的影响

 

^**表示P＜0.01,；^*表示P＜0.05。

（3）结论：由表3的实验结果可见，本发明提取的天花粉皂苷能够增加脑缺血动物的生存率和延长生存时间。

实施例4：天花粉皂苷对局灶性脑缺血的作用

（1）实验方法：健康成年雄性wistar大鼠20只，体重250±20g，动物随机分为两组，每组10只。缺血对照组：生理盐水灌胃；天花粉皂苷组除用药不同外，其他措施相同。

动物模型的建立：采用两血管闭塞合并放血法，造成急性脑缺血。实验动物先用麻醉药麻醉后固定在手术台上。经颈正中切口，钝性分离两侧颈总动脉，丝线结扎悬挂30min，同时断尾放血0.8mL，然后松开结扎丝线10min，再次结扎双侧颈总动脉30min后松开。术后给予进食进水。

观察指标：

①凝血系统凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶时间（APTT）、纤维蛋白原测定（FBG）。

②脑梗死面积的测定：术后一定时间采血后处死，取一定数量大鼠大脑，去掉小脑和脑干，冠状切为0.3 cm的脑片，观察有无缺血灶。将脑片浸入TTC中，恒温后甲醛固定，利用图像病理分析系统测定梗死面积。

③病理学检测：脑片经染色后，在光镜下观察脑组织的病理变化。

（2）实验结果：

①、凝血纤溶系统的检测结果：如表4所示。

表4 凝血纤溶系统的检测结果

^**表示P＜0.01；^*表示P＜0.05

结论：由表4实验结果可见，治疗组灌胃后可以看出TT、APTT、FBG含量较对照组高，当双侧颈总动脉结扎造成大鼠大脑缺血性损伤后，可使TT、APTT延长，且FBG的降低与对照组相比均有显著性差异。

②大鼠局灶性脑缺血一定时间后梗死面积及药物的影响结果：如表5所示。

表5 脑梗死范围

  

^**表示P＜0.01,；^*表示P＜0.05

结论：由表5实验结果可见，天花粉皂苷治疗组的脑梗死面积明显低于缺血对照组，证明天花粉皂苷能减少脑缺血动物的脑梗死面积。

③、病理学改变：对照组光镜下观察发现组织间隙增宽，水肿，有空泡形成，神经元细胞核缩小，甚至溶解消失。而天花粉皂苷治疗组可以看到组织间水肿较对照组轻，细胞间隙改变不明显，神经元细胞核大小基本正常，核较深染，病灶中心区有少许空泡形成。

实施例5：天花粉皂苷对体内血小板血栓形成的影响

（1）实验方法：

健康成年wistar大鼠，体重250±20g，动物随机分为两组，每组10只，实验组给予天花粉皂苷（40mg/kg），对照组给予等量生理盐水。最后1次给药1h后麻醉，固定，分离气管插入气管导管，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在聚乙烯管中放入一根已经称重的丝线。用含肝素的生理盐水充满聚乙烯管。将管的一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静脉，开放血流15min后中断，取出丝线称重，计算血栓重量。

（2）实验结果：

结果对照组血栓重32.67±8.74mg，天花粉皂苷治疗组血栓重20.99±6.82mg。

（3）结论：天花粉皂苷可抑制体内血栓形成。

实施例6：急性毒性实验

（1）实验方法：

①、口服给药的急性毒性实验：取体重20±2g小鼠40只，雌雄各半，用本发明提取的天花粉皂苷按4.8g/kg（相当于生药120g/kg），每天给药3次，然后连续观察7天。

②、腹腔注射给药的急性毒性试验：取体重20±2g小鼠40只，雌雄各半，用本发明提取的天花粉皂苷按4.8g/kg（相当于生药120g/kg），每天给药3次，然后连续观察7天。

（2）实验结果：相当于人体用药100倍的用量的情况下，没有小鼠死亡，未测得LD₅₀。

（3）结论：本发明天花粉皂苷的毒性较低。

综上所述，以上实验及其实验结果可得出如下结论：

天花粉皂苷具有显著延长小鼠断头后呼吸时间和增加呼吸次数、降低脑含水量、增加脑缺血动物的生存率和延长生存时间、减少脑梗塞面积、改变凝血纤溶系统、保护脑神经元、抑制体内血栓的形成等作用，故对脑缺血、脑血栓、脑梗死等缺血性脑血管疾病有很好的治疗作用，对缺血性脑血管疾病发生后的神经元有很好的保护作用，且毒性低，副作用小，使用安全、质量可控。