一种海洋微生物来源大环内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域。海洋环境的特殊性及海洋微生物的多样性，使得从海洋微生物活性代谢产物中寻找新的抗肿瘤活性的药物先导化合物成为目前研究的热点。本发明提供了一种海洋微生物来源大环内酯类化合物Macrolactin Q在制备抗肿瘤药物中的应用。Macrolactin Q在微克浓度水平对多种人肿瘤细胞株和动物瘤株有强烈的细胞毒作用，对动物瘤株裸鼠移植瘤模型有强烈的抗肿瘤作用。本发明为研究开发新型抗肿瘤药物提供了一种先导化合物，具有作为抗肿瘤药物的潜在用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及本发明涉及一种海洋微生物来源的大环内酯类化合物Macrolactin Q在制备抗肿瘤药物中的应用。 

背景技术

具有新结构或新作用机制的天然化合物不但是化学合成新药的重要依据，同时也是新药开发的主要内容。海洋环境的多样性造就了海洋微生物的多样性，海洋微生物的多样性又使其具有多种多样的代谢作用，因此，海洋微生物能提供多种多样的新颖结构类型的生物活性产物。然而随着现代科学技术的飞速发展，仪器手段越来越灵敏、先进，全球范围内海洋微生物活性物质的研究渐渐成为人们创新药物研究的热点。 

目前，癌症是引起人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织统计数据显示，2000年全球新发癌症病例约1000万，死亡620万，现患病例2200万。预计2020年癌症新发病例将达到1500万，死亡1000万，现患病例3000万。新增癌症患者主要集中在发展中国家。 

在癌症的各种治疗手段中，药物治疗占重要地位。国际上各大制药公司均投入大量资金、人力物力，以期加快抗肿瘤治疗药物的研发进度。海洋环境的特殊性及海洋微生物的多样性，使得从海洋微生物活性代谢产物中寻找新的抗肿瘤活性的药物先导化合物成为目前研究的热点。 

Macrolactin Q是本发明人从中国东海芽孢杆菌的次级代谢产物中分离出的大环内酯类化合物，分子式为C₂₄H₃₄O₆；分子量：418，化学结构式如下式所示。 

本发明人已就Macrolactin Q申请中国发明专利并获得授权，专利号为ZL200710039018.2，发明名称为：一种新的具有抗菌活性的大环内酯类化合物Macrolactin Q，该专利涉及Macrolactin Q化合物以及它对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供Macrolactin Q的新用途，特别是Macrolactin Q在制备抗肿瘤药物中的应用。 

本发明从一株中国东海芽孢杆菌的次级代谢产物中分离出化合物Macrolactin Q，所述的中国东海芽孢杆菌具体为201721海洋菌株(保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期2007年2月5日；保藏编号M207008；分类命名：Bacillus subtilis strain 201721)，但本发明不排除从其他菌株中分离得到Macrolactin Q，或通过合成得到Macrolactin Q。本发明通过研究证明Macrolactin Q在微克浓度(μg/mL)水平对多种人肿瘤细胞株和动物瘤株有强烈的细胞毒作用，对动物瘤株裸鼠移植瘤模型有强烈的抗肿瘤作用。 

本发明提供了大环内酯类化合物Macrolactin Q在制备抗肿瘤药物中的应用。 

其中的肿瘤是胰腺癌、肺腺癌、肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌或T细胞肿瘤；也可以是急性髓系白血病或单核细胞白血病。 

本发明通过人肿瘤细胞株体外试验表明，Macrolactin Q对人胰腺癌细胞株A1990、人胰腺癌导管上皮细胞癌细胞株8898、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株SMMU-7721、人鼻咽癌细胞株CNE-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人急性髓系白血病细胞株HL-60、人胃癌细胞株M85、人 单核细胞白血病细胞株U937、人T细胞肿瘤细胞株Jurkat有强烈的细胞毒作用。 

本发明通过动物瘤细胞株体外试验表明，Macrolactin Q对小鼠巨噬细胞瘤细胞株P338、小鼠肉瘤细胞株S180，小鼠肺癌细胞株Lewis和小鼠艾氏腹水癌细胞株Ehrlich有强烈的细胞毒作用。 

本发明通过小鼠肉瘤S180裸鼠移植瘤模型体内试验，证明Macrolactin Q对S180荷瘤小鼠有强烈的抑瘤作用。 

Macrolactin Q在微克浓度(μg/mL)水平对多种人肿瘤细胞株和动物瘤株有强烈的细胞毒作用，对动物瘤株裸鼠移植瘤模型有强烈的抗肿瘤作用。本发明为研究开发新型抗肿瘤药物提供了一种先导化合物，具有作为抗肿瘤药物的潜在用途。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。 

实施例所用材料：201721海洋菌株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期2007年2月5日；保藏编号M207008；分类命名：Bacillus subtilis strain 201721。人胰腺癌细胞株A1990、人胰腺癌导管上皮细胞癌细胞株8898、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株SMMU-7721、人鼻咽癌细胞株CNE-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人急性髓系白血病细胞株HL-60、人胃癌细胞株M85、人单核细胞白血病细胞株U937、人T细胞肿瘤细胞株Jurkat购自上海中科院细胞所。小鼠巨噬细胞瘤细胞株P338、小鼠肉瘤细胞株S180，小鼠肺癌细胞株Lewis和小鼠艾氏腹水癌细胞株Ehrlich购自上海中科院细胞所。小鼠肉瘤S 180瘤株购自上海中科院细胞所。 

实施例1：201721海洋菌株的发酵培养 

a.201721海洋菌株的发酵培养基如下： 

蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖6.0g，人工海水(或陈海水)1000ml，pH 6.5。人工海水配方：NaCl 25.0g，Na₂SO₄ 4.0g，KCl 0.7g，NaHCO₃ 0.20g，KBr 0.10g，H₃BO₃ 0.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/L MgCl₂溶液，10mL1.0mol/L CaCl₂溶液，0.90ml 0.1mol/L SrCl₂溶液，蒸馏水1000mL，pH调为6.5。 

b.发酵培养过程： 

将201721菌株从试管斜面上接种到装有发酵培养基的12只250mL三角 瓶中进行种子培养，每个三角瓶装70mL培养基，28℃摇床恒温培养，转速90r/min。培养一天后将种子培养液接种到12只2000mL的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装700mL发酵培养基，按10％接种量接种，同上培养条件培养4d。 

实施例2活性化合物的分离提取 

将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌体后收集发酵液上清。将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为氯仿-甲醇(4∶1)。将所得洗脱相蒸干后通过中压液相(瑞士Buchi公司Fraction Collector C-660，UV-PhotomakerC-635，Pump manager C-615，Pump Module C-605)再次纯化，流动相及洗脱条件为：甲醇(0％～40％)-水60min，甲醇(40％～60％)-水180min，甲醇(60％～100％)-水80min，流速3.0mL/min，218nm检测，收集梯度为甲醇(60％～100％)-水的洗脱峰，浓缩后HPLC进一步纯化，使用Zorbax半制备C₈反相柱(9.4mm×250mm)制备，流动相为乙腈∶水(28∶72)，流速2.0mL/min，218nm检测，收集t_R为21.5min的洗脱峰制备出化合物macrolactin Q。 

实施例3活性化合物Macrolactin Q对人肿瘤细胞株和动物瘤细胞株的抑制作用。 

1、方法：MTT法(参见《药理实验方法学》，徐叔云等主编，人民卫生出版社，2006年) 

分别取对数生长期人胰腺癌细胞株A1990、人胰腺癌导管上皮细胞癌细胞株8898、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株SMMU-7721、人鼻咽癌细胞株CNE-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人急性髓系白血病细胞株HL-60、人胃癌细胞株M85、人单核细胞白血病细胞株U937、人T细胞肿瘤细胞株Jurkat、小鼠巨噬细胞瘤细胞株P338、小鼠肉瘤细胞株S180，小鼠肺癌细胞株Lewis和小鼠艾氏腹水癌细胞株Ehrlich，各以2×10⁴/孔细胞接种于96孔板上，分别加入不同浓度的Macrolactin Q，设0.1％DMSO为对照组。培养72h，结束前4h每孔加入5mg/mL MTT 10μL，培养结束时离心并小心吸去上清液，加入200μL DMSO并轻微振荡，使生成的甲黄完全溶解显色后，用Bio-Rad Model 550Microplate Reader以570nm波长测OD值。实验共进行3次，算出平均值。按下式计算抑制率：抑制率(％)＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。用Bliss软件计算细胞生长抑制率达50％的Macrolactin Q的浓度，以IC₅₀表示。 

2、实验结果： 

表1.Macrolactin Q对人胰腺癌细胞A1990的抑制作用 

表2.Macrolactin Q对人胰腺癌导管上皮细胞癌细胞株8898的抑制作用 

表3.Macrolactin Q对人肺腺癌细胞株A549的抑制作用 

表4.Macrolactin Q对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用 

表5.Macrolactin Q对人肝癌细胞株SMMU-7721的抑制作用 

表6.Macrolactin Q对人鼻咽癌细胞株CNE-2的抑制作用 

表7.Macrolactin Q对人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用 

表8.Macrolactin Q对人急性髓系白血病细胞株HL-60的抑制作用 

表9.Macrolactin Q对人胃癌细胞株M85的抑制作用 

表10.Macrolactin Q对人单核细胞白血病细胞株U937的抑制作用 

表11.Macrolactin Q对人T细胞肿瘤细胞株Jurkat的抑制作用 

表12.Macrolactin Q对小鼠巨噬细胞瘤细胞株P338的抑制作用 

表13.Macrolactin Q对小鼠肉瘤细胞株S180的抑制作用 

表14.Macrolactin Q对小鼠肺癌细胞株Lewis的抑制作用 

表15.Macrolactin Q对小鼠艾氏腹水癌细胞株Ehrlich的抑制作用 

上述实验结果表明，Macrolactin Q对人胰腺癌细胞株A1990、人胰腺癌导管上皮细胞癌细胞株8898、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株SMMU-7721、人鼻咽癌细胞株CNE-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人急性髓系白血病细胞株HL-60、人胃癌细胞株M85、人单核细胞白血病细胞株U937、人T细胞肿瘤细胞株Jurkat有强烈的细胞毒作用。Macrolactin Q对小鼠巨噬细胞瘤细胞株P338、小鼠肉瘤细胞株S180，小鼠肺癌细胞株Lewis 和小鼠艾氏腹水癌细胞株Ehrlich有强烈的细胞毒作用。 

实施例4活性化合物Macrolactin Q对小鼠肉瘤细胞株S180移植瘤的体内抑瘤作用 

1、方法： 

在无菌条件下抽取生长7天的小鼠肉瘤S180瘤株，加1倍生理盐水稀释后混匀，接种于昆明种小白鼠右腋皮下，0.2mL/只，随机分为生理盐水对照组，杠柳苷CPP阳性对照组(3.0μg/kg)，PBS溶剂对照组以及不同剂量的Macrolactin Q组。每组7只，接种后24h经腹腔注射给药，每天1次，共7天。实验重复两次。统计分析：数据以X_平均±s表示，采用t检验处理，P＜0.05认为有显著性差异。 

2、实验结果： 

表16Macrolactin Q对动物瘤株S180的抗瘤作用 

^*P＜0.05，其余P＜0.01 

上述实验结果表明：Macrolactin Q对S180荷瘤小鼠有强烈的抑瘤作用。