生物柴油生产过程中形成的脱胶残渣的微生物再加工

摘要

一种对来自天然脂肪初步纯化的脱胶残渣进行再加工的工业方法，以及一种通过该方法获得的饲料添加剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物柴油生产中形成的甘油馏分进行再加工的工业方法，以及一种特别适合该工艺使用的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)新型菌株。

背景技术

天然燃料油组分，即所谓的生物柴油的生产，本质上包括由天然产生的甘油三酯(通常为植物脂类)通过转酯化进行的脂肪酸酯的生产。美国专利2,271,619公开了一种在基本上无水的碱金属氢氧化物作为催化剂存在下，通过添加低于5个碳原子的饱和单羟基脂肪醇转化高级脂肪酸甘油酯为短链醇酯的方法。根据所述专利，该工艺应当在温度86-212℉(30-100℃)下的反应器中进行。醇的量应当不超过1.75甘油酯当量。催化剂的量应当为甘油酯质量的0.1-0.5％。

后续专利修正或补充了所述方法。美国专利2.360.844、2.383.632、2.383.580、2.383.581、2.383.614、2.383.633、2.383.596和2.383.599分别描述了US 2.271.619中公开方法的进一步变化，包括：a)添加酸以及喷雾干燥步骤；b)添加对未反应的醇进行蒸馏的步骤；c)对催化剂效果进行分析，建议pH为5-7；d)使用部分脂肪酸酯技术；e)回收未反应的醇以及对液体进行酸化以改善酯和甘油的分离；f)通过不同方法对部分反应的甘油酯进行转化；g)除了单羟基醇(非甲醇)外还补充部分甲醇，以改善液相的分离；以及h)添加溶剂以改善相分离。

其它专利提供了进一步的改进和提高。美国专利2,494,366、2,383,601、3,963,699、4,303,590、4,371,470、4,668,439、5,399,731、5,434,279、和5,525,126同样大部分基于美国专利No.2.271.619中描述的技术。这些专利分别涉及：a)添加合适数量的酸性催化剂至碱性催化剂；b)重复添加酸性酯化催化剂；c)在常温和从真空至大气压的压力下反应；d)添加第二个碱催化阶段；e)添加第二个酯化阶段并使用吸附剂去除烃基酯；f)引入气态醇；g)在较低温度下添加额外的酸进行反应；g)引入一种使用酸的改进的相分离方法；以及h)使用由醋酸钙和醋酸钡构成的混合物的催化剂。

独立于已采用的技术之外，甘油酯转酯化中需要再加工的副产品是所谓的甘油馏分，包括可溶性的亲水反应产物，即甘油，未使用的催化剂以及剩余的脂肪酸酯和在进一步的转酯化产品分离步骤中使用的其它试剂，即，磷酸和无机盐。在目前使用的大多数工业化生物柴油生产过程和/或副产物再加工中，甘油馏分以“甘油水”的形式存在，其包含20％-80％的甘油，以及技术工艺的剩余物如肥皂(0-5％)、脂肪酸甲酯(0-5％)、甲醇(0-1％)、单甘油酯(0-6％)、灰分(0-5％)和余量的水使体系至100％体积。

生物柴油生产的另一个难以再加工的副产品是所谓的“脱胶残渣”，其形成于为了转酯化而对植物或动物脂肪进行的初始纯化和pH调节，其中使用了磷酸。所产生的副产品主要包括与脂肪、蛋白质及脂肪中存在的其它大分子相连的磷酸残基。进一步的，该副产品包含0-10％的不同浓度的游离的植物和动物脂肪、0-10％的蛋白质、0-5％的灰分、0-1％的甘油，以及水。

副产品的回收和/或再加工是脂处理工业、特别是生物柴油生产中的重要问题。

发明内容

本发明的目标是提出一种再加工脱胶残渣的简易方法。本发明的特殊目的是提出一种有效的方法来从该难以加工的副产品再加工中获得容易吸收且具有高营养性的生物质，该方法可用于工业化的脱胶残渣再加工，其已经考虑到了根据生物柴油生产使用的不同技术工艺而产生的不同组分。所产生的生物质应当具有以下特性：易吸收的蛋白质和维生素的含量高，且适于作为饲料添加剂使用。

意外的，上述问题已经被本发明解决了。

本发明的主题是一种对天然脂肪的纯化、特别是在生物柴油生产过程中产生的副产品进行再加工的工业方法，其特征在于，在含有水溶液培养基中培养解脂耶氏酵母，所述水溶液包含20.0-70.0g/l的脱胶残渣作为碳源，培养温度低于34℃，优选地从约28℃至约31℃，培养基氧载荷为至少20％饱和度的O₂，pH值维持在2.5-7.5，直到培养基中可用的碳源基本上耗尽为止；其中优选地，培养过程维持一种周期性的模式，在一个生产周期末的部分培养液用新鲜培养基进行替换。优选地，培养基含有选自包含下列物质的组的至少一种组分：硫酸铵、磷酸钾、硫酸镁、尿素、硫胺素、氢氧化钠、酵母抽提物、谷类胶、壳聚糖以及俄赛泊(Acepol)，它们的比率为0.5-15g/L培养基。同样优选地使用“甘油水”作为额外的碳源。优选地，培养条件维持pH为约3.4至约3.6，优选地为3.5±0.1，培养完成的指标为pH升至4.5。所得的生物质可以在进口温度约200℃、通道出口温度90℃下喷雾干燥。优选地，培养体积维持在至少1000L。在优选的实施方式中，排出的培养液中得到15-35g/L的干酵母质量，生物质生产以1.5-3.0g/L·h的速度进行，其中蛋白质干物质含量以质量计为30-50％。培养中可以使用解脂耶氏酵母菌株SKOTAN，其保藏于波兰的IBPRS机构，保藏编号KKP 2018p。

解脂耶氏酵母SKOTAN菌株已经依照布达佩斯条约进行保藏，其保藏于波兰农业食品生物技术研究所，波兰华沙(Instytut Biotechnologii Przemyslu Rolno-Spozywczego(Institute of Agricultural and Food Biotechnology，IAFB)，ul.Rakowiecka 36，02-532Warszawa(华沙)下文中简写为IBPRS)，保藏编号KKP 2018p。其为野生型菌株，筛选自在本发明研究期间所检测的由弗罗茨瓦夫大学生命科学院(Uniwersytet Przyrodniczy of Wroclaw)收藏的该菌种的多株菌株。选择标准主要由在基于甘油馏分的培养基中的培养条件构成。首先，使用该解脂耶氏酵母菌株能够获得特别优选的生物质产率以及对诸如增高的渗透压和相对低的培养基pH等有害培养条件的相当程度的耐受力。正是由于这样，其培养过程是更加简单，因为其中被其它微生物污染的风险低。同时，得到的生物质具有优选的营养量，例如高含量的易吸收蛋白质和维生素，特别是该种族的。因此，其可以被用作高质量的饲料添加剂。

本发明的主题还有一种饲料酵母，其含有以干质量计的42％-43.3％的蛋白质。优选地，氨基酸Ile、Leu、Lys、Met、Cys、Phe、Tyr、Thr、Trp和Val的总含量超过36g/100g蛋白质，优选地约36.8至约37.9g/100g蛋白质。同样优选地，所选的氨基酸在所述蛋白质中的含量范围如表3所定义。

保藏信息

本发明的另一个主题是保藏于IBPRS、保藏编号为KKP 2018p的解脂耶氏酵母SKOTAN菌株在脱胶残渣再加工中的应用。优选地，所生产的生物质被用于饲料生产。

具体实施方式

实施例1

在基于生物柴油的生产中得到的甘油馏分的培养基中生产解脂耶氏酵母生物质的基础培养基组分(培养基1)(克/升)：

甘油馏分：20.0-70.0，优选地约50.0

(NH₄)₂SO₄：8.5-15.0，优选地约12.6

尿素：1.5-6.5，优选地约4.0

MgSO₄x 7H₂O：0.5-3.0，优选地约1.0

KH₂PO₄：0.1-2.0，优选地约0.5

酵母抽提物：0.1-2.0，优选地约0.5

自来水：1000ml

pH：2.5-7.5，优选地约3.5-4.0

上述培养基组分(培养基1)的比例应当按照1100L的体积进行称重，并用自来水补充体积至1000L。

在一些情况下，为了适应生产目标(即，减少生长时间，蛋白质最大化，氨基酸的数量以及组成或干质量的最优化等等)，培养基中应当补充其它组分以丰富或调控该工艺，例如下述表1中给出的例子：

表1

“+”表示正影响

“-”表示负影响

在生产过程中使用的原材料中外加矿物质或生物物质(即，重金属，毒素等)的含量不应当超过饲料产品相应规程和条例中允许的规定。

在培养基组分彻底溶解后，将其倾入生物反应器，从工作体积150L的生物反应器中加入100L培养的酵母细胞，所述培养按照上述条件培养。

不同菌株的解脂耶氏酵母的培养条件：

培养温度应当维持25-35℃(优选地约30℃±1)，搅拌转速400-1200RPM(优选地约700-800)，通气速率0.2-4L空气/lL培养基/min(优选地约1-1.5L空气/lL培养基/min)。采用10N NaOH自动控制维持pH。如果产生大量泡沫，应使用如ACEPOL或其它的消泡剂。

使用PH-STAT的过程控制基于饲料酵母培养物生产培养基的pH调控。该调控为监测酵母生产过程中的培养基pH。控制设备将pH控制在3.5，且其在3.4-3.6范围内振荡。初始pH 3.5是必须的条件，其通过添加氢氧化钠实现。稳定的pH水平限制了不希望的细菌群落的生长，从而能够获得不含其它酵母和细菌的解脂耶氏酵母的同质培养物。

pH增至超过4.5意味着酵母生产过程的终止，其表明培养基中所有可获得的营养物已经耗尽。

另一个重要的培养参数是培养基温度。温度应当不超过34℃。反应混合物的最佳温度是28-31℃。

培养的氧合作用同样是重要参数。氧合作用应当超过20％O₂饱和度。该氧合指数可以通过使用具有FRINGS-型充气器(FRINGS涡轮机)的生物反应器来实现。氧合水平影响培养效率以及酵母细胞形态。完全的氧合产生如下图1所示的酵母。不足的培养基通气产生解脂耶氏酵母的菌丝体(图2)。

培养应当维持至培养基中可获得的碳源(在此为甘油)耗尽为止。留下200L细胞悬液，培养基组分(培养基1)应当按照1100L的总体积进行计重，加入900L水。该培养方法(周期的和重复的)可以进行5-15次。

该酵母繁殖过程能够以1.5-3.0g/l·h(优选地约2.5g/l·h)的速率获得15-35g/L(优选地约33g/L)的酵母干质量，其总效率为至少0.4-0.5g酵母干质量/g甘油馏分(优选地对于解脂耶氏酵母SKOTAN菌株为约0.60g/g)。

干酵母蛋白质含量的变化范围为30-50％。使用解脂耶氏酵母SKOTAN菌株，采用按照上述基础培养基的组分(培养基1)得到约42％的酵母干质量蛋白质含量，采用按照上述表1所述的各种额外的培养基变型得到42％-48.6％的含量。

在上述不同培养基变型中培养的解脂耶氏酵母SKOTAN菌株中得到的氨基酸含量(采用克/100克蛋白质的方式表达)的测量值连同关于参照蛋白质的1998FAO-WHO要求一起如下述表2所示。

表2

产生的生物质可以进一步加工，例如通过已知的方式进行干燥，特别是喷雾干燥，然后进行分装并作为高质量的饲料添加剂进行使用，特别是用于牛和鸡的饲料。使用下述方法对酵母悬液进行浓缩用于喷雾干燥：用壳聚糖絮凝，微滤，在过滤离心机中离心。浓缩水平取决于喷雾干燥机的类型。应当在进口温度200℃、通道出口温度90℃下进行干燥。

酵母呈粉末状，具有特别的气味和米黄-浅棕色。

实施例2.在含有脱胶残渣的培养基中进行饲料酵母的生产

意外的，发现了在生产中可以使用脱胶残渣作为主要碳源。生产过程同实施例1所示，区别在于不使用甘油馏分，而是在培养基中添加相似数量的脱胶残渣。培养中使用完全通气和维持pH为3.5±0.1的条件获得了最优选的培养结果。采用该混合物的条件是在反应器中使用适合的通气水平和搅拌方法(采用涡轮机而不是支架搅拌器(frame mixer))。

解脂耶氏酵母干质量中的蛋白质含量在多个重复试验中变化范围为42％-43.3％，其取决于为了丰富混合物而添加的化合物，如表1所示。在含有甘油水和脱胶残渣的不同培养基变型中的解脂耶氏酵母SKOTAN菌株的酵母培养物中得到的氨基酸含量(采用克/100克蛋白质的方式表达)的测量结果连同关于参照蛋白质的1998FAO-WHO要求如下述表3所示。

表3

在脱胶残渣中生产的酵母具有暗的米黄-浅棕色和更显著的气味。