用于治疗急性疟疾的二噻唑*盐或者其前体和青蒿素或者其衍生物的组合

摘要

本发明涉及包含二噻唑盐(式(VI)的化合物或者其前体)以及青蒿素或者其衍生物的组合。本发明还涉及包含至少一种二噻唑(式(VI)的化合物或者其前体)盐以及青蒿素或者其衍生物的药物组合物。本发明还涉及本组合在制备用于治疗或者预防急性疟疾的药物中的用途。本发明最后涉及用于治疗或者预防急性疟疾的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及抗疟疾的活性成分的新的组合，即二噻唑盐或者其前体和青蒿素或者其衍生物的组合，也涉及包含该组合的药物组合物，用于治疗和/或预防疟疾。

背景技术

疟疾(malaria)是在世界范围内的原发感染性死因之一且每年影响着超过5亿个体，其中每年死亡150万至300万个体。这种灾祸主要发生在非洲亚撒哈拉(sub-Saharan Africa)、东南亚和拉丁美洲。

通过疟蚊(Anopheles mosquitoes)转运的疟原虫(Plasmodium)属的四种类型的寄生虫(恶性疟原虫P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)、间日疟原虫(P.vivax)和卵形疟原虫(P.ovale))传播疟疾。恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，其在非洲广泛蔓延，是最致命的寄生虫且是造成大多数致死形式的疾病的原因。

在最近几年内观察的疾病的强烈泛滥归咎于几个因素，其中包括许多恶性疟原虫株对目前所用的药物的抵抗，所述的药物诸如氯喹、甲氟喹、阿莫地喹或者抗叶酸药(antifolics)和抗叶酸剂(antifolinics)，诸如乙胺嘧啶和磺胺多辛。

许多患有疟疾的个体表现为急性感染，除轻微贫血和脾容积增大(脾大)外几乎没有显现的体征。症状取决于疟疾的种类。然而，一般的临床特征具体为：感觉不舒服(feeling unwell)、体温过高(发热)、头痛、消化问题诸如恶心、呕吐和/或腹痛、腹泻、虚弱、肌肉痛、关节痛(arthralgia)(关节痛(jointpain))和黄疸。

治疗通常通过给予氯喹(或者在如果对氯喹发生抵抗时给予碱式盐酸奎宁)来进行直到得到改善且血液中寄生虫消失(通常在3和5天之间)。然后患者通常接受由1.5g磺胺多辛和75mg乙胺嘧啶构成的单一剂量的药物。

也使用其它基于抗叶酸药和抗叶酸剂的治疗或者可替换地基于malarone的治疗。

经恶性疟原虫引起的严重疟疾为脑型疟(cerebral malaria)，其伴有实质性体温升高(40℃)和昏迷(coma)，这种昏迷即使治疗也具有预后不良，且其死亡率有时在成年人中升至20％且在儿童中升至15％。严重疟疾的表现为逐步的或者突发的。其在一种或多种肌肉的瞬时和短暂的抽搐后发生，接着发生去收缩(decontractions)。它们位于或者遍布于全身。这类疟疾伴有眼球震颤(眼睛从一侧到另一侧不停地跳动)，有时伴有颈强直和反射紊乱。严重疟疾也可伴有视网膜出血、低血糖、肺水肿、肾牵连(kidney involvement)、贫血和/或呕血(始于受损器官的血液逆流，血液被吞咽然后以伴有出血的呕吐物形式重现)。

在恶性疟原虫引起的复杂的疟疾或者脑型疟和其它严重的表现中，当1％的红血球(血红细胞)或者更多寄生在还未对此疾病产生免疫的个体中时，其为医疗急症。

如果发生严重疟疾，优先的治疗为大量且迅速地(在治疗开始后24至48小时之内)减少寄生虫血症(parasitemia)以排除致命的预后。一旦寄生虫血症得到控制且证实了极端重要的预后，可施用例如更常规的抗疟疾治疗，诸如氯喹或者碱式盐酸奎宁。

严重疟疾的治疗难于口服或者直肠给药，这是因为患者经常遭受伴有大量腹泻的呕吐。

青蒿素，其在1972年从植物青蒿素(Artemisia annua(qinghaosu))中分离，且已在中国使用了几个世纪，其具有有力的抗疟疾活性。具有改善的药理性质的衍生物诸如青蒿素甲醚(artemether)、蒿乙醚(arteether)和青蒿酯(artesunate)也可商购使用。

青蒿素及其衍生物，尤其是青蒿酯，在当今是最有效的抗恶性疟原虫的活性成分的一部分。然而，这些化合物难以使病情完全恢复，且注意到病情的泛滥。因此，在单一疗法中的青蒿素或者其衍生物的使用可以是选择抗寄生株的因果因素。

科学性组织目前推荐使用活性成分的组合，且尤其是青蒿素或者其衍生物与其它抗疟疾活性成分的组合。这些名为ACT(基于青蒿素的组合疗法)的多药疗法，从2002年起已被世界卫生组织(WHO)认可。它们提供多重优势：对于耐药株的改善的治疗效果、两种活性成分对耐药性表现的相互保护、疾病传播的降低以及耐药性传播的降低。

已知有几种这种类型的组合。

例如已经提出以的名称销售的青蒿素甲醚和本芴醇(lumefantrine)之间的组合，就如同青蒿酯和阿莫地喹的组合那样。

二茂铁喹(Ferroquine)与青蒿素衍生物的组合在文件WO 2006/111647中有述。

然而，ACT多药疗法的有益效果既不是明显的也不是可预知的。例如，C.Snyder等人的出版物Experimental Parasitology，115(2007)，296-300披露了哌喹与化合物OZ277的组合显示相比于哌喹与青蒿素衍生物诸如青蒿素甲醚的组合更有前景。

类似地，氯喹和青蒿酯的组合不能实现满意的效能水平(Am.J.Trop.Med.Hyg.，2003，69(1)，19-25和Transactions of the Royal Society of TropicalMedicine and Hygiene，2003，97，429-433)且可导致对耐药株的选择，尤其是抵抗氯喹的株。

因此，即使ACT策略被WHO认可，对于抗疟疾活性成分的新的组合的探索依然不易且应该继续。

发明内容

本发明涉及二噻唑盐(bisthiazolium salt)和青蒿素或者其衍生物的组合，所述的二噻唑盐为如下定义的式(VI)的化合物或者其前体。在本发明中使用的青蒿素衍生物中，可提及例如青蒿酯、青蒿素甲醚、蒿乙醚、氢化青蒿素(hydroartemisinin)或者二氢青蒿素。

该组合显示了优势和意料不到的协同作用，因此用于在预防和/或治疗疟疾尤其是严重疟疾中使用。

用于本发明目的的式(VI)的化合物以及其前体，在公开的编号为EP 1196371的专利中有述。用于本发明目的的式(VI)的二噻唑盐的前体对应于EP 1196371的式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)。实际上本专利描述了具有抗疟疾作用的药物前体，其特征在于它们是能够产生二季胺盐的产物且它们对应于通式(I)：

其中

-A和A′彼此相同或者不同且表示：

·分别为下式的基团A₁和A′₁：

其中n为2至4的整数；R’₁表示氢原子、C₁至C₅烷基，其任选取代有芳基(具体是苯基)、羟基、烷氧基，其中所述的烷基含有1至5个碳原子，或者芳基氧基(具体是苯氧基)；

且W表示选自氯、溴或者碘的卤素原子、或者离核(nucleofugal)基团诸如甲苯磺酰基CH₃-C₆H₄-SO₃-、甲基磺酰基CH₃-SO₃-、CF₃-SO₃-基团或者NO₂-C₆H₄-SO₃-基团，

或者基团A₂，其表示甲酰基-CHO或者乙酰基-CO-CH₃，

-B和B′彼此相同或者不同且表示：

·如果A和A’分别表示A₁和A’₁，分别为基团B₁和B’₁，B₁和B′₁表示基团R₁，其具有如上R’₁的相同定义但不能是氢原子，

·或者如果A和A′表示A₂，分别为B₂和B′₂，则B₂或者B′₂为如上所定义的基团R₁或者下式的基团：

其中-Ra表示RS-或者RCO-基团，其中R为直链、支链或者环状的C₁至C₆尤其是C₁至C₅烷基，适当时取代有一个或者多个羟基、烷氧基或者芳基氧基，或者氨基和/或-COOH或者COOM基团，其中M为C₁至C₃烷基；苯基或者苄基，其中适当时苯基取代有至少一个C₁至C₅烷基或者烷氧基，所述的基团任选取代有氨基或者含氮或者含氧的杂环基、-COOH基团或者-COOM基团；或者基团-CH₂-杂环基，其中所述的杂环基具有5或者6个原子且为含氮的和/或含氧的(oxygenated)；

R₂表示氢原子、C₁至C₅烷基或者-CH₂-COO(C₁至C₅)烷基；

且R₃表示氢原子；C₁至C₅烷基或者烯基，所述C₁至C₅烷基或者烯基适当时取代有-OH、磷酸酯基团(phosphate group)、烷氧基，其中所述的烷基为C₁至C₃烷基，或者芳基氧基；或者烷基(或者芳基)羰基氧基；

或者R₂和R₃一起形成含有5或者6个碳原子的环；R和R₃可连接以形成含有5-至7个原子(碳、氧、硫)的环；

-α表示：

·当A和A′表示A1和A′1时，或者当A和A′表示A₂，即-CHO或者-COCH₃基团，且B₂和B′₂表示：

时，

α表示单键

·或者当A和A’表示A₂且B₂和B′₂表示R₁时，α表示下式的基团：

或者下式的基团：

其中(a)表示与Z连接的键且(b)与氮原子连接的键，

-Z表示C₆至C₂₁，尤其是C₁₂或者C₁₃至C₂₁烷基，适当时其插入有一个或者多个多重键和/或一个或者多个杂原子O和/或S，和/或一个或者多个芳环，

以及这些化合物的药用盐，条件是当n＝3或者4，R₁表示C₁至C₄烷基且Z表示C₆至C₁₀烷基时，R’₁不表示H或者C₁或者C₂烷基。

EP 1196371也描述了如上所述的前体化合物的亚组，对应于通式(II)：

其中R₁、R′₁、W、n和Z如上所定义。

EP 1196371也描述了前体化合物的亚组，包括如上定义的前体，其中Z表示C₁₃至C₂₁烷基。

EP 1196371也描述了前体化合物的亚组，包括在前面亚组中所述的前体，其中Z表示-(CH₂)₁₆-基团。

EP 1 196 371具体描述了选自N，N′-二甲基-N，N′-(5-氯戊基)-1，16-十六烷二胺二盐酸盐或者N，N′-二甲基-N，N′-(4-氯戊基)-1，16-十六烷二胺二盐酸盐的前体。

EP 1 196 371还描述了下组前体，对应于通式(III)：

或对应于通式(IV)：

或者对应于通式(V)：

其中Ra、R₁、R₂、R₃和Z如上所定义。

EP 1 196 371具体描述了如上定义的式(III)、(IV)和(V)的前体化合物，选自：

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-S-硫基苯甲酰基-4-甲氧基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TE4c)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-S-(对二乙基氨基甲基苯基羧基)硫基-4-甲氧基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TE4f)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-S-(对吗啉代甲基苯基羧基)-硫基-4-甲氧基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TE4g)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-S-硫基苯甲酰基-4-甲氧基丁-1-烯基]-1，16-二氨基十六烷(TE8)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-(2-氧代-4，5-二氢-1，3-氧硫杂环己烷-4-亚基)乙基]1，12-二氨基十二烷(TE3)；

或者选自：

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基四氢糠-2-基甲基二硫基-4-羟基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TS3a)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-丙基二硫基-4-羟基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TS3b)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-苄基二硫基-4-羟基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TS3c)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-(2-羟基乙基)二硫基-4-羟基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TS3d)，

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-丙基二硫基-4-甲氧基丁-1-烯基]-1，12-二氨基十二烷(TS3d)和

-N，N′-二甲酰基-N，N′-二[1-甲基-2-丙基二硫基乙烯基]-1，12-二氨基十二烷(TS6b)，

或者选自：

-2，17-(N，N′-二甲酰基-N，N′-二甲基)二氨基-3，16-S-硫基对甲氧基苯甲酰基-6，13-二氧杂十八-2，16-二烯(TE9)，

-2，17-(N，N′-二甲酰基-N，N′-二苄基)二氨基-3，16-S-硫基对甲氧基苯甲酰基-6，13-二氧杂十八-2，16-二烯(TE10)，

-3，18-(N，N′-二甲酰基-N，N′-二甲基二氨基-4，17-S-硫基苯甲酰基二十-3，17-二烯二酸乙酯(TE12)，

-3，18-(N，N′二甲酰基-N，N′-二苄基)二氨基-4，17-S-硫基苯甲酰基二十-3，17-二烯二酸乙酯(TE13)，

或者最后选自：

-2，15-(N，N′-二甲酰基-N，N′-二甲基)二氨基-1，16-S-硫基苯甲酰基十六-1，15-二烯(TE15)，

-2，15-(N，N′-二甲酰基-N，N′-二苄基)二氨基-1，16-S-硫基苯甲酰基十六-1，15-二烯(TE16)。

EP 1 196 371还描述了由噻唑盐前体产生的环化的衍生物，其具有好的抗疟疾活性且对应于通式(VI)：

其中

·Rb表示R₁或者T，T表示下式的基团：

条件是当Rc、Rd、R₂和R₃表示甲基时，或者当一方面Rc和Rd一起形成含有6个碳原子的芳环，且另一方面R₂和R₃一起形成含有6个碳原子的芳环时，Z不表示C₆至C₈烷基，

·Rd表示R₂或者P，P表示下式的基团：

·Rc表示R₃或者U，U表示下式的基团：

R₁、R₂、R₃和Z如上所定义，

可理解的是如果Rc＝R₃且Rd＝R₂，则Rb＝T；如果Rc＝R₃且Rb＝R₁，则Rd＝P；且如果Rb＝R₁且Rd＝R₂，则Rc＝U。

根据本发明，式(VI)的化合物可为游离碱、盐、水合物或者溶剂化物的形式。

具体的，在如上所述的环化的衍生物中，EP 1 196 371提及的衍生物选自：

-1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑]二溴化物(T3)；

-1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-甲氧基乙基)噻唑]二碘化物(T4)；

-1，12-十二亚甲基二(4-甲基噻唑)二碘化物(T6)；

-1，16-十六亚甲基二[4-甲基-5-(2-甲氧基乙基)噻唑]二碘化物(T8)；

-3，10-二氧杂十二亚甲基二[5-(1，4-二甲基)噻唑]二碘化物(T9)；

-3，10-二氧杂十二亚甲基二[5-(1-苄基-4-甲基)噻唑]二溴化物(T10)；

-十二亚甲基二[5-(1-甲基-4-乙氧基羰基乙基)噻唑]二碘化物(T12)；

-十二亚甲基二[5-(1-甲基-4-乙氧基羰基乙基)噻唑]二溴化物(T13)；

-十二亚甲基二[4-(1-甲基)噻唑]二碘化物(T15)；

-十二亚甲基二[4-(1-苄基)噻唑二溴化物(T16)。

最后，EP 1196371描述了得到上面提及的二噻唑盐和二噻唑前体的方法，具体是式(VI)的化合物诸如T3、T4、T6、T8、T9、T10、T12、T13、T15和T16的合成。具体的是，T3的合成在EP1 196 371的18页有述。类似地，T3化合物的抗疟疾活性在同一文件的28页的表13中有述。

因此，本发明涉及组合，其包含作为活性成分的二噻唑盐和青蒿素或者其衍生物，所述的二噻唑盐为式(VI)的化合物或者其前体。

根据第二个主题，本发明涉及二噻唑盐和青蒿酯的组合，所述的二噻唑盐为式(VI)的化合物或者其前体。

根据第三个主题，本发明涉及二噻唑盐和青蒿酯的组合，所述的二噻唑盐为式(VI)的化合物，其选自：

-1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑]二溴化物(T3)；

-1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-甲氧基乙基)噻唑]二碘化物(T4)；

-1，12-十二亚甲基二(4-甲基噻唑)二碘化物(T6)；

-1，16-十六亚甲基二[4-甲基-5-(2-甲氧基乙基)噻唑]二碘化物(T8)；

-3，10-二氧杂十二亚甲基二[5-(1，4-二甲基)噻唑]二碘化物(T9)；

-3，10-二氧杂十二亚甲基二[5-(1-苄基-4-甲基)噻唑]二溴化物(T10)；

-十二亚甲基二[5-(1-甲基-4-乙氧基羰基乙基)噻唑]二碘化物(T12)；

-十二亚甲基二[5-(1-甲基-4-乙氧基羰基乙基)噻唑]二溴化物(T13)；

-十二亚甲基二[4-(1-甲基)噻唑]二碘化物(T15)；

-十二亚甲基二[4-(1-苄基)噻唑]二溴化物(T16)。

根据第四个主题，本发明涉及式(VI)的二噻唑盐和青蒿酯的组合，所述的式(VI)为1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑二溴化物(T3)。

在这些主题中，每个活性成分以反映它们各自在治疗感染中的效能的浓度下使用。在每个组合中，这些化合物各自的量由它们的活性剂量决定。

本发明的组合中存在的1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑]二溴化物(T3)具有下述结构：

本发明的组合中存在的青蒿酯具有下述结构：

本发明的主题还为药物组合物，其包含作为活性成分的如上所定义的式(VI)的二噻唑盐或者其前体(具体是T3)和青蒿素或者其衍生物(具体是青蒿酯)的组合。

该药物组合物含有治疗有效量的二噻唑盐和青蒿素或者其衍生物，以及至少一种药用赋形剂，所述的二噻唑盐为式(VI)的化合物或者其前体。根据药物剂型和理想的给药方法，所述的赋形剂选自本领域技术人员所知的常规的赋形剂。每种化合物的比例范围根据其剂量来定义，其在单一疗法中发挥抗疟疾活性且反映它们各自在治疗感染中的效能。

适当的单位给药剂型包括口服剂型诸如片剂、软明胶胶囊或者硬明胶胶囊、粉末、颗粒和口服溶液剂或者混悬剂，舌下给药剂型、含服(baccal)给药剂型、气管内给药剂型、眼内给药剂型或者鼻内给药剂型，通过吸入给药、局部给药、经皮给药、皮下给药、肌内给药或者静脉内给药(推注或者灌注)的剂型，直肠给药剂型和植入剂。对于局部给药，本发明的化合物可在乳膏剂、凝胶剂、软膏剂或者洗剂中使用。

设想的给药途径为口服途径、直肠途径和肠胃外途径，特别是肌内途径、直肠内途径和静脉内途径，尤其是经滴注(drip)途径。

对于肠胃外给药，可使用水性混悬剂、等渗盐水或者无菌溶液和注射用溶液，其含有药理学相容的分散剂和/或润湿剂，例如丙二醇或者丁二醇。如果必要，混悬剂也可含有抗氧化辅料，或者本发明的活性成分可在适当的溶液中稀释，所述的溶液诸如葡萄糖或者NaCl，用于接下来的经滴注给药。

对于肠胃外给药，且尤其是经滴注给药，本发明的两种活性成分的组合中的每种优选每日剂量如上文所指明的那样：

-式(VI)的二噻唑盐，尤其是T3：剂量在0.01和3mg/kg之间；

-青蒿素或者其衍生物，尤其是青蒿酯：剂量在1和5mg/kg之间。

也包对于高剂量或者低剂量均适用的特别情况；该剂量不脱离本发明的范围。根据常规实践，适于每个患者的剂量由医师根据给药方法和所述的患者的体重和反应性来确定。

本发明的组合旨在用于连续给药1至4天，每天一次或者多次摄入两种活性成分的每种，优选的为每天摄入1至3次(口服或者直肠)或者推注。本治疗时间优选地限定在4天或者以下，这特别地有利于大量且迅速地减少寄生虫血症，并允许使得男性或女性患者在避免其致命预后之后接下来对疟疾进行自身治疗。所述的接下来的治疗可通过青蒿素衍生物的单一疗法、其它任何已知的治疗疟疾的方法以及给药本发明的组合的方法来进行。

给药的剂量和方法的实例可为对表现有严重疟疾的患者进行第一个24小时的治疗(D1)：2.4mg/kg/天的青蒿酯和1mg/kg/天的T3，然后进行接下来的48小时的治疗(D2和D3)：1.2mg/kg/天的青蒿酯和0.8mg/kg/天的T3，青蒿酯和T3经滴注给药，在D1以单一的滴注袋(drip bag)形式给药，在D2和D3以分开的滴注袋形式给药。

两种活性成分中的每种的给药可同时或者分开进行或者随时间分散给药(连续给药)来进行。

当同时进行给药时，两种活性成分可在单一药物剂型中组合(固定组合)，诸如适于口服给药的片剂或者凝胶剂，或者在同一滴注袋中组合，或者以适于直肠内给药的制剂给药。

本发明的组合的两种活性成分的给药无论同时或者不同时给药时，都可以不同的药物形式存在。为了达到该效果，本发明的组合也可为试剂盒的形式，其在一方面包含式(VI)的化合物或者其前体，特别是T3或者其盐、水合物或者溶剂化物，另一方面包含青蒿素或者其衍生物，特别是青蒿酯，所述的式(VI)的化合物诸如T3和青蒿酯在不同的隔室中且旨在用于同时、分开或者按照随时间分散给药(连续给药)的方式给药。

作为举例，片剂形式的T3的单位给药形式包含以下成分：

T3                                6mg

甘露醇                            224mg

交联甲羧纤维素钠                  6mg

玉米淀粉                          15mg

羟丙甲基纤维素                    2mg

硬脂酸镁                          3mg

同样地，作为举例，片剂形式的青蒿酯的单位给药形式可包含50或者100mg青蒿酯和常规的赋形剂，例如乳糖、交联甲羧纤维素、无水胶体二氧化硅、微晶纤维素和硬脂酸镁。

同样地，作为举例，包含青蒿酯和T3的组合的单位给药形式可包含1.5mg T3和50mg青蒿酯，也包含诸如上面提及的那些常规赋形剂，对于成年人实现的每日剂量为4次摄入一片或者一次摄入4片。

相同剂量的T3、青蒿酯、或者T3和青蒿酯的组合以单位形式使用，用于直肠给药，所述单位形式含有本领域技术人员中已知的赋形剂。

对于通过肠胃外注射给药的方法，T3的单位给药形式可包含例如在小瓶中的1mg T3，以及本领域技术人员所知的常规的赋形剂，诸如丙三醇和磷酸盐缓冲液，所述的小瓶按照10kg体重来设计。

同样地，作为举例，在小瓶中的青蒿酯和T3的单位给药形式可包含24mg青蒿酯和1mg T3，以及诸如上面提及的那些常规的赋形剂，所述的小瓶的给药比例为每10kg体重一瓶。

本发明的主题也为治疗和/或预防疟疾的方法，其包括给予患者有效治疗剂量的至少一种噻唑盐和有效治疗剂量的青蒿素或者其衍生物特别是青蒿酯，所述的噻唑盐为式(VI)的化合物或者其前体，特别是T3，所述的剂量如前面所述同时或者先后给予所述的患者。

本发明还涉及如上所定义的用于治疗和/或预防疟疾(尤其是严重疟疾)的方法。

本发明的主题也为一种组合在制备用于治疗或者预防疟疾(尤其是严重疟疾)的药物中的用途，所述的组合包含作为活性成分的二噻唑盐和青蒿素或者其衍生物特别是青蒿酯，所述的二噻唑盐为如上所述的式(VI)的化合物或者其前体。

最后，本发明的主题为

-用于治疗或者预防疟疾的试剂盒，其一方面包含至少一种二噻唑盐，其为式(VI)的化合物或者其前体，且另一方面包含青蒿素或者其衍生物，特别是青蒿酯，所述的式(VI)的化合物/前体和青蒿素/衍生物在不同的滴注袋中或者在隔室中且旨在用于同时或者先后给药，以及

-如上所定义的试剂盒，其特征在于其一方面包含至少一种1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑]二溴化物，且另一方面包含至少一种青蒿酯。

本发明的组合是在感染有恶性疟原虫型的疟原虫(文氏鼠疟原虫(Plasmodium vinckeipetteri)株)的小鼠中的体内药理和生化测试的对象，可用于证明其提供的用于治疗疟疾的效能和协同作用。

在感染有文氏鼠疟原虫的小鼠中的对1，12-十二亚甲基二[4-甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑]二溴化物(T3)与青蒿酯的组合的抗疟疾活性的体内测量

在本测试中使用的术语的定义：

-ED₅₀＝在感染小鼠中观察到的产生寄生虫血症减少50％的剂量(mg/kg/天)，

-ED₉₀＝在感染小鼠中观察到的产生寄生虫血症减少90％的剂量(mg/kg/天)，

-iD＝腹膜内给药，

-iv＝静脉内给药，

-ir＝直肠内给药。

1.使用的体内测试的描述

-小鼠感染

在第0天(D0)，对雌性“Swiss”小鼠(OF1，22-26g)(Charles RiverLaboratories France，59rue de la Paix，76410Saint-Aubin-les-Elbeuf)通过在尾脉静脉注射来接种10⁸个悬浮在200μl NaCl(0.9％)中的寄生虫感染的红细胞。所用的寄生虫为文氏鼠疟原虫型(279 BY株，由Dr.I Landau，Paris，France提供)。

预先两周使小鼠适应环境。使它们任意进食和进水。

在第一天(D1)注射10⁸个寄生虫感染的红细胞导致寄生虫血症水平在5％和10％(7.2％±0.2％)之间。文氏鼠疟原虫株的数量通过每周在小鼠内感染10⁷至10⁸个悬浮在磷酸盐缓冲液(0.9％)中的寄生虫感染的红细胞(经腹膜内给药来感染)来保持。

-T3和青蒿酯溶液的制备

将产物在0.3M磷酸盐缓冲液(pH＝8.1)中溶解。取决于剂量，T3溶液的最终浓度在40和200mg/l之间。取决于剂量，青蒿酯溶液的最终浓度在100和500mg/l之间。

产物经腹膜内给药。给药体积为100μl的级别，但由小鼠的体重决定。

-治疗

对小鼠每天治疗一次，治疗4天，在D1、D2、D3和D4天治疗(Peters，W.，J.H.Portus，and B.L.Robinson.1975.The chemotherapy of rodent malaria.XXII.The value of drug-resistant strains of P.berghei in screening for bloodschizonticidal activity.Ann.Trop.Med.Parasitol.69：155-171；and：Ancelin ML，Calas M.，Bonhoure A.，Herbute S.and Vial H.，In vivo antimalarial activity ofmono and bis quaternary ammonium salts interfering with Plasmodiumphospholipid metabolism.Antimicrob.Agents Chemother.，2003，47，2598-2605)。每个剂量使用四只小鼠。

根据情况对动物经腹膜内给药来给予T3、青蒿酯或者增溶的两种活性成分的混合物。

寄生虫血症的测量

在第五天，从小鼠尾部取几滴血以通过FACS(荧光激活细胞分类器(fluorescence-activated cell sorter))来确定寄生虫血症并进行血涂片(bloodsmear)。寄生虫血症首先在20000个细胞上通过FACS来确定。将取出的用于FACS的红细胞用戊二醛固定然后用荧光染料标记，所述的荧光染料标记DNA因此仅标记寄生虫感染的细胞(Barkan，D.，Ginsburg，H.，and Golenser，J.2000.Optimisation of flow cytometric measurement ofparasitaemia in plasmodium-infected mice.Int.J.Parasitol.30：649-653)。接着在涂片上重新计算低于15％的寄生虫血症。将涂片用甲醇固定然后用吉姆萨染色剂(Giemsa stain)进行染色。在显微镜下对寄生虫感染的血细胞进行计数。将寄生虫血症表示为在标本中存在的感染的红细胞的百分数，样品为2000个细胞。在D5确定ED₅₀和ED₉₀值。寄生虫血症在从第一天到第十天的治疗中确定，然后在第15天、第22天和第47天确定。

对于在D5的涂片显示无寄生虫痕迹的小鼠，将其在治疗结束后再观察至少一个月，以检测任何可能的寄生虫生长。治愈剂量为可在一个月后保证整批治疗的动物存活的产物剂量。

ED₅₀值的确定

0％抑制相应于在未治疗的感染的小鼠中观察到的寄生虫血症的平均值。100％抑制相应于非常弱的或者无寄生虫血症，低于0.01％。ED₅₀值通过用对数浓度表示的剂量响应曲线的线性插值法来确定。

2.在文氏鼠疟原虫寄生虫株上的对T3和青蒿酯的抗疟疾活性的体内测量

为了证实两种化合物之间的协同作用，很重要的是知晓当它们单独给药时的活性，以在接近它们ED₅₀的剂量时将它们组合。其肠胃外给药的情况对应于严重疟疾的临床情形。在这种情况中，重要的是在治疗的前几天内迅速地减少寄生虫血症。以测试的剂量，单独给予青蒿酯在第一天不能减少寄生虫血症，且在接下来的几天内也有相似情况(图1)。在剂量为1mg/kg/d时治疗4天后T3有效地减少寄生虫血症，但在治疗的第一天后不能预防寄生虫血症的增加(图2)。

得到的ED₅₀值在下述的表1中显示：

表1

  ED₅₀(mg/kg/天)  T3  0.55  青蒿素  ＞25

ED₅₀越低，活性越好。因此，单独使用T3(0.55mg/kg/天)显示了相对于单独使用青蒿酯(＞2.5mg/kg/天)对寄生虫血症的更好的活性。此外，单独使用剂量为0.5mg/kg/天的T3可在一个月后达到完全恢复(结果未显示)，而单独使用剂量为2.5mg/kg/天的青蒿酯不能达到完全恢复。

3.在文氏鼠疟原虫寄生虫株上对T3/青蒿酯组合的抗疟疾活性的体内测量

对该组合的研究，选择剂量为2.5mg/kg/d的青蒿酯(略低但接近ED₅₀)，0.5mg/kg/d的剂量在4天中对寄生虫血症完全无活性。将T3以较低的剂量在组合中评价，所述接近且在ED₅₀之上，即0.2、0.5和1mg/kg/d。

令人惊讶的是，如在图3、4和5中显示，通过与单独T3或者单独青蒿酯的分开给药进行比较，包含T3(以所有上面提及的剂量)与以剂量为2.5mg/kg/天存在的青蒿酯的组合可显著地减少寄生虫血症的水平。具体地，重要的是需要注意，在第一次给药(第2天)的24小时后且无论给予何种剂量的T3，观察到在小鼠中的寄生虫血症有所减少，而在此时间点，单独给予的产物是无活性的。表II(和图3、4和5)显示了在此第2天所记录的寄生虫血症的平均值(每个剂量4只动物)。应该注意的是，在第一次给予(第2天)在组合中的剂量为0.2、0.5和1mg/kg的T3与剂量为2.5mg/kg的青蒿酯24小时之后，有统计学上的协同作用。在治疗第一天之后，这种非常显著的协同作用对在治疗严重疟疾的情况中是尤为重要的，其中临床医师精确地探寻患者寄生虫血症的大量且迅速的减少，以避免致命的预后。

表II

起始于剂量为0.5mg/kg/天的T3与剂量为2.5mg/kg/天的青蒿酯的组合，在治疗前、整个治疗期间内，寄生虫血症保持其初始值，而单独给药各产物不能实现此效果(表II，图3、4和5)。

T3化合物对于在一个月后小鼠完全恢复的主要作用来说是重要的。剂量为2.5mg/kg/天的青蒿酯共同给药不能改善单独使用T3所得的治愈剂量。

表III概括了上面讨论的结果。

表III

因此，当2种活性成分组合给药时，在治疗的前4天内寄生虫血症显著减少。与单独给药两种活性成分中的每种确定的剂量相比，所述组合在相当的剂量或甚至更低的剂量的作用要大的多。

尤其是当T3与青蒿酯组合给药时，其中青蒿酯的剂量至少为2.5mg/kg/天，在寄生虫血症的减少中观察到有益的作用。因此可理解的是两种活性成分的组合对治疗窗是尤其有效的，所述的治疗窗通过化合物中的一种的最小剂量以及化合物中的一种相比于在本治疗窗之内的其它化合物的比例来限定。

在感染有文氏鼠疟原虫的小鼠体内得到的结果证明了本发明的组合对于治疗疟疾尤其是严重疟疾是有利的，所述的组合包含青蒿素或者其衍生物(特别是青蒿酯)，以及二噻唑盐，所述的二噻唑盐为式(VI)的化合物，特别是T3。