一种控制生鲜乳中细菌总数的方法

摘要

本发明公开了一种控制生鲜乳中细菌总数的方法，采用蛭弧菌控制细菌总数，所述蛭弧菌菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 209172，保藏日期为2009年8月7日；具体步骤为：(1)将蛭弧菌CCTCC 209172制备成蛭弧菌游泳体菌液；(2)在生鲜乳中加入步骤(1)中制得的蛭弧菌游泳体菌液，其中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到10

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种控制生鲜乳中细菌总数的方法。 

背景技术

“生鲜牛乳”即为未经任何加工的牛乳。在生鲜乳中微生物的含量是评价生鲜乳质量的一个重要指标，对于所有乳制品来说，微生物含量对最终产品质量也是十分重要的。细菌总数高，其中的致病菌就容易产生非常耐热的毒素，这些毒素经过超高温处理后仍有少量残留，消费者饮用后会导致中毒；而且大量的细菌繁殖会加速产酸，从而引起牛乳酸度增加，蛋白质热稳定性下降。在国标“GB/T 6914-1986”中规定了Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级生鲜乳细菌总量应分别≤50万个/mL、≤100万个/mL、≤200万个/mL、≤400万个/mL。 

目前乳制品企业对原料奶收购时普遍采取直接冷藏方式，在加工前也只采取过滤法和离心净乳法，不能从本质上减少其菌落总数。虽然多数奶业生产单位通过规范的牧场管理体系等而获得质量较好的生鲜乳，但也有生产单位，如个体农户等，因奶牛饲养环境条件差，以及部分奶站在原料奶降温和冷藏贮运方面，缺乏很好的配套措施等，从而使得原料奶的微生物菌落总数达到较高的水平。因此，研究一种简便易行且不会破坏牛乳品质的细菌控制方法和/或技术十分必要。 

蛭弧菌为寄生性革兰氏阴性菌，具有寄生、进而裂解其它细菌的作用，是一种优良的微生物控制剂。目前，对于生鲜乳中细菌总数的控制只有零星报道，且多集中在高压，辐照等物理加工处理方式；在利用生物技术控制方面，特别是蛭弧菌控制牛乳中细菌总数方面在国内外均尚无报道。 

已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工业还是在(海洋)水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如：在国外，Lenz and Hespell(1978)研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R.W.，HespellR.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology，1978，119(3)：245-248]。在国内，林茂等(2006)研 究了蛭弧菌对鱼类细胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌BDH21 02对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1)：7-11]。 

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种高效、无毒无副作用的控制生鲜牛乳中细菌总数的方法，解决了目前物理、化学杀菌方法造成的残留和牛乳口味改变的问题。 

本发明的目的通过下述技术方案实现： 

一种控制生鲜乳中细菌总数的方法，采用蛭弧菌控制细菌总数，所述蛭弧菌菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 209172，保藏地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学内，保藏日期为2009年8月7日；具体步骤如下： 

(1)将蛭弧菌CCTCC 209172制备成蛭弧菌游泳体菌液； 

(2)在生鲜乳中加入步骤(1)中制得的蛭弧菌游泳体菌液，其中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到10²pfu/ml，静置或搅拌1-8小时后细菌总数会得到有效控制和减少。 

优选地，所述蛭弧菌游泳体的浓度为10⁴～10⁸pfu/ml。 

所述生鲜乳经过步骤(2)处理后，还经过低温巴氏杀菌或4℃低温保藏可达到更好的杀菌效果。 

优选地，步骤(2)中温度控制在4℃～30℃。 

优选地，所述蛭弧菌游泳体菌液的制备方法如下： 

(1)制备乳链球菌：乳链球菌用MRS培养基摇床培养，160rpm～250rpm、25～32℃培养12～36h，培养物经过5000rpm、4℃离心15～20min，弃上清液，沉淀即为乳链球菌； 

(2)混合培养：将蛭弧菌CCTCC 209172与上述制备得到的乳链球菌加入到DNB培养基中，恒温摇床160rpm～250rpm、25～32℃培养12～36h； 

(3)制备菌液：混合培养物经过6000rpm、4℃离心20min，取上清液，再将上清液16000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清液，向沉淀中加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，制得蛭弧菌游泳体菌液(浓度10⁸～10⁹pfu/mL)。该菌液可以用无菌水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～ 7.6的磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度的蛭弧菌游泳体菌液，备用。 

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果： 

1.本发明所述的使用蛭弧菌游泳体菌液控制生鲜乳中细菌总数的方法效果显著。如图1所示，细菌总数在8小时无冷藏的状况下很好的控制甚至减少了细菌总数，提升了生鲜乳的等级。 

2.本发明所述的控制生鲜乳细菌总数的方法安全性好，已有研究证明，蛭弧菌对人无毒，且普通的低温巴氏杀菌既能将其完全杀灭，不存在诸如辐照或抗生素杀菌等存在的辐射或药物残留问题。 

3.采用生物杀菌可有效避免物理杀菌方法对食品口味、品质等的改变，更有利于保持牛乳最原始的鲜味、品质。 

4.本方法采用的蛭弧菌游泳体菌液不仅能杀灭生鲜乳中常见的大肠杆菌，沙门氏菌等，对常因牛得乳腺炎而感染的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌都有清除的能力。 

附图说明

图1为实施例蛭弧菌游泳体菌液控制生鲜乳中细菌总数的效果图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。 

实施例 

(1)控制生鲜乳中细菌总数的蛭弧菌游泳体菌液的制备 

使用的蛭弧菌菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 209172，保藏日期为2009年8月7日。 

对蛭弧菌BDFM05进行负染后于电子显微镜下形态观察：BDFM05呈单细胞，椭圆形，大小为1.43×0.53μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少2μm；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2～3mm的透明圆形噬菌斑。 

蛭弧菌游泳体通过申请号“200710031166.X”的发明专利公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵：在装有100mL MRS液体培养基(蛋白胨10g，牛肉膏粉8g，酵母膏粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三氨2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，1g吐温80，pH值6.0～6.4)的 锥形瓶中接种0.5mL10⁷cfu/mL乳链球菌(购自广东省微生物菌种保藏中心，编号GIM 1.156)，200rpm、28℃摇床培养18小时，培养液于4℃、5000rpm离心15min，弃上清。将沉淀加入到装有100mL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，再加入1mL含10³pfu/mL的蛭弧菌CCTCC 209172。恒温摇床250rpm、28℃培养36h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液于4℃16000rpm离心20min，保留沉淀，加入DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮蛭弧菌沉淀物，即制得浓度为10⁸pfu/ml的蛭弧菌游泳体菌液。 

用无菌水稀释上述蛭弧菌游泳体菌液，得到不同浓度的菌液，其中： 

菌液A含有的蛭弧菌浓度为10⁸pfu/mL； 

菌液B含有的蛭弧菌浓度为10⁶pfu/mL； 

菌液C含有的蛭弧菌浓度为10⁴pfu/mL； 

(2)将蛭弧菌菌液应用于控制生鲜乳细菌总数 

本实验取新鲜的12L鲜牛乳(山东，荷斯坦奶牛)，将其分为12份，其中3份为对照系列，另9份为实验系列。实验系列中分别加入步骤(1)制好的菌液A、B、C，在25℃下分别静置8小时。每30分钟用无菌移液管吸取10mL牛乳样品，以营养琼脂(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL)为培养基，采用涂布平板法对细菌进行计数(单位为cfu/mL)。所有数据均为三个平行样的平均值。 

检测结果如图1所示。图中所有数据均为三个平行样的平均值。实验结果表明，对照系列在8h后细菌总数增长到9.2×10⁸cfu/mL，而实验系列中3小时后细菌总数均控制在10⁵cfu/mL以下，在5小时后A组甚至降至7.1×10²cfu/mL次方，B组C组也分别降至7.8×10³cfu/mL和9.8×10⁴cfu/mL。8小时结束实验时A组细菌总数为3.2×10²cfu/mL，B组为3.4×10³cfu/mL，C组2.76×10⁴cfu/mL。可见蛭弧菌游泳体菌液控制生鲜乳中细菌总数效果显著，且高浓度蛭弧菌游泳体菌液效果要优于低浓度。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。