蓖麻毒素的新型生物条形码检测方法

摘要

本发明公开了一种用于蓖麻毒素高灵敏度检测的新型生物条形码检测方法。该检测方法是将一种新型生物条形码检测方法应用于蓖麻毒素蛋白的检测，所述新型生物条形码检测方法是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性检测的生物条形码检测方法。本发明对蓖麻毒素蛋白的高灵敏度检测具有较大的实际意义，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的检测方法及其应用，特别是涉及一种用于蓖麻毒素高灵敏度检测的新型生物条形码检测方法。

背景技术

蓖麻毒素是一种从蓖麻种子的胚乳中提取的植物糖蛋白，系指蓖麻毒蛋白、蓖麻碱、蓖麻变应原和血球凝集素四种毒性物质，其中蓖麻毒蛋白的毒性最大，是一种重要的生物战剂和生物恐怖源。药物研究中，蓖麻毒素又称蓖麻毒蛋白(Ricin)，是一种核糖体失活蛋白。蓖麻毒素为无味白色粉末或结晶型固体，由A、B两条多肽链以二硫键共价连接组成异二聚体，其中，A链为效应链，分子量约30kDa或32kDa，具有糖苷酶活性，通过破坏核蛋白体60S亚单位而抑制蛋白质合成，致使细胞死亡；B链为结合链，分子量约32kDa，含有两个半乳糖结合位点，通过与细胞膜上含半乳糖基的糖蛋白和糖脂结合，促进毒素分子进入细胞。单独的A链和B链均没有毒性，只有以二硫键连接的蓖麻毒素才呈现很强的细胞毒性作用。

蓖麻毒素毒性极强，对所有哺乳动物的有核细胞都有毒害作用。一个毒素分子进入细胞内，就足以使整个细胞的蛋白质合成完全停止而死亡。1g蓖麻毒素可杀死数万人，其毒性是有机磷神经毒剂VX的385倍，是氰化物的6000倍。蓖麻毒素进入人体后，可损害肝脏、肾脏等实质器官，使之发生出血及坏死，引起急性中毒性肝病、中毒性肾病等；严重者可抑制呼吸及血管运动中枢，最后导致呼吸、循环衰竭而死亡。儿童食入2-5粒生蓖麻籽即可因呼吸窘迫及肾功能衰竭致死。

建立蓖麻毒素快速检测与鉴定方法可有效预防蓖麻毒素引起的生物战和生物恐怖事件。蓖麻毒素形成气溶胶化后无色无味，不易察觉，因此侦检非常困难。历史上最早使用动物实验没定蓖麻毒素的毒性和定量检测。目前根据蓖麻毒素的理化特性、生化特性和免疫原性发展出多种检测方法，其中以免疫检测法为主。免疫检测法主要包括放射免疫、免疫荧光、免疫胶体金标记、ELISA、免疫层析、夹心免疫PCR、电化学发光生物传感器、微电极电化学法和蛋白芯片定量检测。ELISA被国际定为蓖麻毒素检测的金标准，然而与其它免疫检测方法一样，ELISA仍存在着灵敏度有限等问题。

生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)于2003年Mirkin等开发以来，为分子诊断领域，尤其是微量蛋白质检测提供了一个全新的技术平台(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.Science，2003，301(5641)：1884-1886)。该技术检测蛋白的原理是利用标记被检物单抗的磁性微球(magnetic microparticles，MMP)、标记被检物多抗和条形码DNA链的金纳米颗粒(nano-particle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物，利用磁场进行分离，洗脱释放NP上标记的条形码DNA链，通过PCR或银染法鉴定就可确定被检物的存在。

BCA技术中，NP探针标记有双链DNA(48bp)和病原的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(Hurst SJ，Lytton-Jean AR，Mirkin CA.Maximi z ing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes.Anal Chem，2006，78：8313-8318)；MMP探针是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗病原的单克隆抗体。BCA技术通过抗原抗体高度特异性反应捕获抗原，再通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于双链DNA标记的一次放大以及PCR反应和芯片检测的二次放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

传统BCA技术存在着明显的缺陷。在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量不准确；其次，终点PCR容易交叉污染，产生假阳性。传统BCA技术标记的DNA为双链，长度为48bp左右，不仅操作繁琐、检测过程冗长，而且也间接影响到检测灵敏度，此外还不适宜于进行基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测，不能对样品模板进行精确定量分析。条形码DNA的芯片检测由于银染试剂自身的缺点而易产生假阳性，阴阳性不易界定，染色结果因时间、环境因素变化很大。

发明内容

本发明提供了一种用于蓖麻毒素蛋白高灵敏度检测的新型生物条形码检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种蓖麻毒素的新型生物条形码检测方法，是将一种新型生物条形码检测方法应用于蓖麻毒素蛋白的检测，所述新型生物条形码检测方法是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性检测的生物条形码检测方法。

具体来讲，所述蓖麻毒素的新型生物条形码检测方法可包括以下步骤：

(1)NP探针的制备：设计适用荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的条形码DNA单链，然后利用金纳米颗粒、抗蓖麻毒素蛋白的多克隆抗体和条形码DNA单链制备NP探针；

(2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗蓖麻毒素蛋白的单克隆抗体制备MMP探针；

(3)条形码DNA检测：利用NP探针、MMP探针和蓖麻毒素通过抗原、抗体作用制备三明治复合物，然后将复合物上标记的条形码DNA链直接进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测或普通PCR检测，以对蓖麻毒素进行定性、定量检测。

在上述蓖麻毒素蛋白的新型生物条形码检测方法中，所述步骤(1)中的金纳米颗粒直径可为10～40nm，优选为15nm；优选的用于蓖麻毒素蛋白新型生物条形码检测的单链条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列。

所述步骤(2)中磁性微球的直径可为0.5～3μm，优选为2.8μm。

所述步骤(3)中优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQID No：3的核苷酸序列，TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。

为获得更好的检测效果，所述步骤(1)和步骤(2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

所述抗蓖麻毒素蛋白的单克隆抗体和抗蓖麻毒素的多克隆抗体均可采用生物技术领域中的常规方法制备，也可从公司直接购买。

本发明的第二个目的是提供一种蓖麻毒素新型生物条形码检测试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括包被有抗蓖麻毒素蛋白单克隆抗体的MMP探针，包被有抗蓖麻毒素蛋白多克隆抗体和条形码单链DNA链的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针。

在上述试剂盒中，优选的与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列；优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No：4的核苷酸序列。

本发明在传统生物条形码检测方法基础上，对标记的条形码DNA链进行了创新，并引进基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR对标记DNA进行检测，不仅简化了检测步骤，还可对标记DNA进行直接定性、定量检测。本发明与常规的生物条形码检测方法相比，本发明的BCA检测方法采用长片段、单链条形码DNA链制备NP探针，可直接对反应复合物上的条形码DNA链进行检测，不用预先解离，降低了检测成本，并大大简化了检测程序；此外，利用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法对条形码DNA链进行检测，可对被检物进行精确定量，并且消除了常规生物条形码检测方法的阴阳性界限不清等问题，具有准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点。本发明对蓖麻毒素蛋白的高灵敏度检测具有较大的实际意义，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图

图2为条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线图

图3为条形码DNA链的常规PCR检测扩增产物电泳图

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、条形码DNA链和TaqMan荧光探针均由TaKaRa公司合成；纳米金颗粒购自Ted pella公司；磁性微球颗粒购自Invitrogen公司；蓖麻毒素蛋白、抗蓖麻毒素蛋白多克隆抗体和抗蓖麻毒素蛋白单克隆抗体均购自诺维森生物科技有限公司。

实施例1、蓖麻毒素的新型生物条形码(BCA)检测

用本发明的新型BCA检测方法对蓖麻毒素蛋白进行定性、定量检测，具体方法包括以下步骤：

(1)NP探针的制备

条形码DNA链合成：设计并合成用于本发明中NP探针制备的条形码DNA链，其序列为：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTGCGT AAT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中SEQ IDNo：1)。

NP探针制备：取10.5μg待检病原的多抗(购自诺维森生物科技有限公司)加入到100μL纳米金(15nm，10～40nm均可)溶液里混合均匀，之后用0.1M NaOH调节pH值至9.5；室温下振荡30min；加入20μL 100μM的单链DNA链，10℃下孵育16h，使溶液中的纳米金粒子和抗体、DNA能充分作用；加入585μL 10％的BSA室温孵育30min；4℃、13000g离心20min，去除上清；之后用0.1M NaCl作为稳定剂，边加边混匀，使稳定剂的终浓度为0.1M，静置7～10h以上，重悬沉淀，定溶至原来的体积。4～8℃保存。

(2)MMP探针制备

缓冲液(Buffer)A：6.18g H₃BO₃(MW61.83)添加到800mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH值到9.5，使用蒸馏水定溶至1L。

缓冲液B：2.62g NaH₂PO₄ H₂O(MW137.99)、14.42g Na₂HPO₄ 2H₂O(MW 177.99)用蒸馏水定溶到1L，pH值为7.4。

缓冲液C：在缓冲液A或缓冲液B中溶解39.64g(NH₄)₂SO₄，用NaOH或者HCl调节pH值至9.5或7.4，最后用缓冲液A或缓冲液B定溶至100mL。

缓冲液D：0.88g NaCl(MW 58.4)、0.5％(w/v)BSA to 80mL0.01M PBS(pH 7.4)，充分混匀后定溶至100mL，用0.01M PBS(pH 7.4)调节pH 7.4。

缓冲液E：0.88g NaCl(MW 58.4)、0.1％(w/v)BSA到80mL 0.01M PBS(pH 7.4)充分混匀后用0.01M PBS(pH 7.4)定溶至100mL。

把66μL磁珠(直径为2.8μm，0.5～3μm均可，2×10⁹beads/mL)移入EP管后置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清和除去磁场；加入1mL Buffer A或BufferB重悬磁珠，反复吹打；重新置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清；除去磁场；之后加入40μL待检病原的单抗(购自诺维森生物科技有限公司)和20μL的Buffer A，反复涡旋；加入40μL Buffer C之后涡旋振荡，37℃孵育12～18h；重新置入磁场，使磁珠沉淀，去除上清；除去磁场；加入1mL Buffer D 37℃孵育1h；再次置入磁场，使磁珠再次完全沉淀，去除上清和磁场；加入1mL Buffer E，涡旋5～10sec；置入磁场，使磁珠完全沉淀，去除上清和除去磁场；之后重复用1mL Buffer E洗涤；最后用96μL的Buffer E重悬磁珠，使磁珠溶液浓度为20mg/mL。4～8℃保存。

(3)蓖麻毒素新型BCA检测中三明治检测复合物的形成

将15μL MMP(20mg/mL)加入30μL蓖麻毒素蛋白(100fg/mL)中，37℃剧烈振荡1h；加入磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连接的蓖麻毒素蛋白和其它杂质；加入45μL NP探针，剧烈振荡30min；加入磁场，用500μLPBS反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。反复冲洗后用50μL超纯水溶解。得到MMP-蓖麻毒素蛋白-NP三明治结构，复合物中的条形码DNA链可用于下一步的定性、定量检测。

(4)条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测

对步骤(3)中的条形码DNA链进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检测。

25μl反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μl(50mM)，下游引物1μl(50mM)，TaqMan荧光探针1μl(25mM)，三明治复合物样品2μl，ddH2O 7.5μl。

反应条件为：95℃ 10s，95℃ 5s，52℃ 20s，共45个循环，每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。

上游引物：5’-GTT CTC TAG TTG GCA ACC ACC-3’(序列表中SEQ ID No：2)

下游引物：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG-3’(序列表中SEQ ID No：3)

TaqMan荧光探针：5’-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C-TAMRA-3’(序列表中SEQ ID No：4)

条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图如图1所示(曲线a、b、c、d、e和f分别为10²fg/mL、10¹fg/mL、10⁰fg/mL、10^-1fg/mL、10^-2fg/mL和10^-3fg/mL，曲线g为阴性对照。)，条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线如图2所示(标准曲线方程为y＝45.02-3.35x)，上述检测结果表明本检测的蓖麻毒素蛋白检测灵敏度可达10^-2fg/mL。

(5)条形码DNA链的常规PCR检测

对步骤(3)中的条形码DNA链进行常规PCR检测。25μl PCR反应体系为：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物1μl(50mM)，下游引物1μl(50mM)，三明治结构2μl，ddH₂O 8.5μl。PCR反应条件为：95℃ 10s，95℃ 5s，52℃ 20s，72℃ 20s，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃终止反应。反应结束后，取PCR扩增产物各10μl进行3％琼脂糖凝胶电泳检测(100V电泳40min)。

上游引物：5’-GTT CTC TAG TTG GCA ACC ACC-3’(序列表中SEQ ID No：2)

下游引物：5’-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG-3’(序列表中SEQ ID No：3)常规PCR检测结果如图3所示(泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道a～g分别为10²fg/mL、10¹fg/mL、10⁰fg/mL、10^-1fg/mL、10^-2fg/mL、10^-3fg/mL和阴性对照。)，检测结果表明本检测蓖麻毒素蛋白检测灵敏度可达10^-2fg/mL。

实施例2、蓖麻毒素新型BCA检测试剂盒的制备

将实施例1中的条形码DNA链、上游引物、下游引物、TaqMan荧光探针、金钠米颗粒和磁性微球共同包装，得到新型BCA检测试剂盒。

序列表