一种高含油量微藻突变株的筛选方法

摘要

本发明涉及一种高含油量微藻突变株的筛选方法，是将小球藻Y019藻液稀释后进行辐射处理；将诱变后的藻液暗培养后涂于HSM固体培养基上培养，再顺序接种于新的HSM固体培养基并编号，测定OD490；在藻液中加入尼罗红染料、DMSO，测定突变藻株的油脂含量；突变株的单位OD490中性脂吸收值B1与小球藻Y019的单位OD490中性脂吸收值B2的比值C大于110％时，则此突变株为高油脂含量突变株，该突变株被命名为Y019-M37，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏登记号为：CCTCC NO.M2010170。本发明筛选、检测过程中简单，耗时少，所得突变株生长迅速、含油量高，是制备生物柴油的有效来源，具有良好的生物柴油开发前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，涉及利用紫外线诱变筛选高含油量微藻的方法，具体地说是一种小球藻紫外线诱变产生的高含油量突变株的高效筛选方法。 

背景技术

随着全球经济一体化的不断发展，世界能源形势日趋紧张，大量使用石油燃料使得能源危机和环境问题日益突出，继续利用石油燃料被广泛认为是不可持续的，寻找一种绿色的可持续发展的新能源，成为各国关注的问题。生物柴油是科学家们研究的绿色可持续发展的新能源，它主要来源于：含油植物、废油和动物脂肪，而这些来源生产的生物柴油远远不能满足现在的燃料需要。 

微藻由于具有种类多样、光合作用效率高、生物产量高、生长繁殖快、生长周期短和自身合成油脂能力强的特点而被许多学者认为是制备生物柴油最佳的原料之一。而且经证实，微藻是唯一的可满足现在燃料需求的生物柴油来源。利用藻类物质生产生物柴油，对缓解人类面临的能源和环境危机有着巨大的潜力，同时对于减少生产生活中对石油的依赖、保证国家能源安全具有深远意义。目前，微藻制备生物柴油的研究主要集中在两个方面：一是对生物柴油生产工艺的研究；二是生物柴油的生产原料的研究。成本过高一直是生物柴油产业 化发展的瓶颈问题，最有效的解决方式是从降低原料成本入手，这成为从源头上降低生物柴油产品成本的重中之重。生物柴油的成本可以通过遗传改良获得高含油微藻、生物炼油技术及光合生物反应器来降低。据统计，生物柴油制备成本的75％是原料成本，改进微藻的产油能力是从根本上解决问题，生物量高及油脂含量高的藻株是成为微藻生物柴油原料的较好选择。小球藻生长迅速，生物量大，故提高小球藻的细胞油脂含量是目前降低成本的关键。 

紫外线对高等植物具有较强的生物学效应，能够在农业上进行诱变育种。在微藻中已有利用紫外线对藻株进行诱变的的成功例子，但对突变株的筛选是一件费时费力的过程，这严重制约了利用微藻制备生物柴油的开发利用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高含油量微藻突变株的筛选方法，通过对小球藻Chlorella vulgaris Y019进行紫外线诱变、筛选得到突变株，该突变株生长迅速、含油量高，是制备生物柴油的有效来源，具有良好的生物柴油开发前景。 

上述小球藻Y019采自海口周边热带淡水水域，通过平板分离纯化法获得。将Y019藻株的18S rDNA基因部分片段与其同源序列进行进化树分析，结果表明：Y-019藻株属于绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，小球藻科，小球藻属，它与Chlorella vulgaris的18S rDNA基因的相似度为100％。小球藻Y019在采用荧光显微镜(Nikon 80i)在明场10×100镜下观察的形态如图9所示，细胞球形，直径5-10μm， 细胞壁薄，色素体杯状，占细胞的一半或稍多。小球藻Y019在采用荧光显微镜(Nikon 80i)在暗场10×100镜下观察的形态如图10所示。 

本发明所采用的技术方案： 

一种高含油量微藻突变株的筛选方法，其具体步骤如下： 

1、取对数生长期的小球藻Y019藻液稀释至10⁵个细胞/ml，然后在培养皿底部铺一薄层稀释藻液，用18W紫外灯进行辐射处理，辐射距离40cm，辐射时间13min。 

2、将诱变后的藻液暗培养12h后涂于HSM固体培养基上，培养15天后挑取体积较大、颜色浓绿的藻落顺序接种于新的HSM固体培养基，置于24℃光照强度50-110μE/m2/s培养15天。 

3、根据藻落顺序进行编号，并按顺序接入酶标板中，然后用已灭菌的去离子水调整藻液浓度以测定OD490。 

4、在步骤3)的藻液中加入0.1mg/ml尼罗红染料0.2ul，99.9％DMSO 2ul，静置10min后，利用荧光发光检测仪(Promega GloMax-muti)测定突变藻株的油脂含量，以490nm为激发波长，570nm为消散波长分别测定荧光密度值A1和A2，二者之差A＝A2-A1即为中性脂的吸收值；单位OD490中性脂吸收值B＝中性脂吸收值A/OD490；突变株的单位OD490中性脂吸收值B1与小球藻Y019的单位OD490中性脂吸收值B2的比值为C，当比值C大于110％时，则此突变株为高含油量突变株，该突变株被命名为Chlorella vulgarisY019-M37，于2010年7月8日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏登记号为：CCTCC  NO.M2010170。 

本发明通过对小球藻Chlorella vulgaris Y019进行紫外线诱变、筛选得到突变株，筛选、检测过程中操作简单，耗时少，能实现高通量筛选，大大提高筛选的工作效率，减少工艺过程中对原材料浪费，属于环境友好型，所得突变株生长迅速、含油量高，是制备生物柴油的有效来源，具有良好的生物柴油开发前景。 

附图说明

图1为紫外线处理小球藻细胞后藻液颜色变化显微镜效果图。 

图2为紫外线照射时间致死率曲线图。 

图3为小球藻突变珠Y019-M37干重与OD490关系曲线图2。 

图4为油脂含量与荧光值(FD570)相关性标准曲线图。 

图5为紫外线诱变株在HSM培养基的生长曲线图。 

图6为紫外线诱变株在HSM培养基的油脂积累对比图。 

图7为诱变株Y019-M37显微镜图片。 

图8为诱变株Y019-M37油脂的荧光定性分析。 

图9为野生型Y019显微镜图片。 

图10为野生型Y019油脂的荧光定性分析。 

具体实施方式

以下结合实例为本发明作进一步详细的描述。 

第一步、用紫外线处理小球藻细胞后，藻液颜色由原来的绿色变浅。在显微镜下观察，存活细胞数目随着照射时间的延长而降低。在照射后第3天藻细胞死亡率稳定时，统计其死亡率(见图1、图2)。实验中使用的各种紫外线剂量对小球藻细胞都有致死作用，其半致死 剂量为IC₅₀＝10min。为了获得较多的突变株，又不至于因为辐射剂量过大造成大部分细胞死亡而残留一些不活跃的细胞，采用18W紫外灯，照射距离40cm，辐射时间13min适合本次实验。 

第二步、紫外线诱变获得突变株。分别取对数生长期的小球藻Chlorella vulgaris Y-019藻液稀释至10⁵个/ml，取出1ml稀释藻液置于9cm培养皿底部，使藻液在培养皿底部铺一薄层，用18W紫外灯，照射距离为40cm，辐射13min。 

第三步、经紫外线照射后的藻液暗培养12h后，均匀的涂于含固体HSM培养基平皿上，置于24℃全日光照培养箱中培养15天，挑取体积较大、颜色浓绿的诱变株并顺序接种于新的含固体HSM培养基平皿上，置于24℃全日光照培养箱中培养15天。 

第四步、根据藻落顺序进行编号，并按顺序接入酶标板中，加入200ul已灭菌的去离子水，调整藻液浓度以测定OD490。 

第五步、在第四步的藻液中加入0.1mg/ml尼罗红染料0.2ul，99.9％DMSO 2ul，静置10min后，利用荧光发光检测仪(PromegaGloMax-muti)测定突变藻株的油脂含量，以490nm为激发波长，570nm为消散波长分别测定荧光密度值A1和A2，二者之差A＝A2-A1即为中性脂的吸收值；单位OD490中性脂吸收值B＝中性脂吸收值A/OD490；突变株的单位OD490中性脂吸收值B1与小球藻Y019的单位OD490中性脂吸收值B2的比值为C，当比值C大于110％时，则此突变株为Y019-M37。 

第六步、小球藻Y019和小球藻突变珠Y019-M37干重的测定。 接种适量藻液至含500ml HSM液体培养基的1L三角烧瓶中，置于220rpm/min光照强度50-110μE/m2/s摇床中培养2天，取出一定藻液离心收集藻细胞，其体积梯度如下：60、80、100、120、140ml，绘制标准曲线(图3)。 

第七步、油脂标准曲线的测定。取Triolein(sigma)稀释至一定浓度，加入一定量尼罗红染色后，静置10min后，利用荧光发光检测仪(Promega GloMax-muti)以490nm为激发波长，570nm为消散波长分别测定荧光密度值A1和A2，二者之差A2-A1即为中性脂的吸收值。浓度梯度设置如下：40、80、120、160、200μg/ml，绘制标准曲线(图4)。 

第八步、微藻生物量的监测。将FACHB-31、Y019和突变株Y019-M37接种至含50mlHSM培养基的100ml三角烧瓶，接种浓度为1.10E+07个/ml，置于220rpm/min全日光照摇床中培养。用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况，每48h用酶标仪测定一次490nm处的光吸收值，取200ul藻液至96孔板中，用酶标仪测定490nm的光吸收值来快速反映藻类的生长情况，监测数据经过标准曲线换算后，结合生长时间绘制微藻生长曲线(图5)，计算生长速率(表1)，同时用显微镜观察藻细胞的生长状况。 

表1 

第九步、藻细胞中脂含量的定性定量测定，取200ul藻液至96孔板中，加入0.1mg/ml尼罗红染料0.2ul，99.9％DMSO 2ul，静置10min后，利用荧光发光检测仪(Promega GloMax-muti)以490nm为激发波长，570nm为消散波长分别测定荧光密度值A1和A2，二者之差A2-A1即为中性脂的吸收值，通过标准曲线换算得出油脂含量(图6)。同时，用荧光显微镜定性检测，在450-490nm激发光下，中性脂发金黄色荧光，而极性脂发红色荧光(图7，图8，图9，图10)，通过荧光显微镜进行含油量的定性检测及油滴的细胞定位分析。 

结果显示：突变株Y019-M37经过固体HSM培养基上培养置于24℃全日光照培养箱中培养15天后，通过观察其生长状况及测定油脂含量筛选出生长迅速及高含油藻株是一种操作简单且有效节约时间的方法。通过诱变得到Y019-M37，在采用荧光显微镜(Nikon 80i)在明场10×100镜下观察得出，其细胞体积明显大于小球藻Chlorellavulgaris Y019，且叶绿素含量低于Y019。在HSM培养基中，诱变株Y019-M37的油脂含量与野生型小球藻Y019相比，提高了17.88％(如图8、图10)，与普通小球藻FACHB31(中国科学院武汉水生所藻种保存中心提供)相比，提高了22.00％，达到37.19％，。提高由于小球藻的相对生长速率大，生物量大，且小球藻突变株Y019-M37的油脂含量有了明显提高，具有良好的生物柴油开发前景。