用于干扰目标序列的RNAi片段及RNAi表达载体

摘要

本发明属于分子生物学，涉及一种用于干扰目标序列的RNA i片段及其制备方法，所述方法为根据目标序列得到一个可以形成颈环结构的理论序列，根据该理论序列设计并分段合成该序列以及该序列的反向互补序列，将分段合成的序列磷酸化，然后将磷酸化后的序列混合，变性，退火，最后与酶切后的RNAi表达载体连接即得到用于干扰目标序列的RNA i表达载体。本发明还涉及含有用于干扰目标序列的RNA i片段的重组载体及其制备方法，以及所述RNAi片段用于构建RNAi表达载体的用途。本发明所述方法用于构建RNAi表达载体时，能够简化实验步骤，节省实验时间，降低实验成本。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种用于干扰目标序列的RNAi片段及RNAi表达载体，及其制备和构建方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近几年发展起来的高效、特异、易操作的基因沉默新技术，相对于反义及共抑制技术，可获得更高的基因沉默效率。它是真核生物体内由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的降解同源RNA的现象。在细胞中，长的dsRNA被类似RNA酶III的Dicer酶切割成21-26核苷酸(nucleotide，nt)的干扰性小RNA(small interfering RNA或short interfering RNA，siRNA)。随后，siRNA与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，并解链。而有活性的RISC在其中的siRNA反应链指导下同与其互补的转录物结合，导致RNA的降解。这是一种转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)，也称RNA沉默(RNA silencing)(Fire et al，1998；Meister et al，2004)。

RNAi在进化上是高度保守的，是真核生物体内天然的抗外源基因侵入的防御系统。RNAi的最主要的特点在于其作用的高度特异性，这一特点是由siRNA与目的RNA特异性互补所保证的。Semizarov等(2003)针对同一个基因的三个不同靶作用区设计了不同的siRNA序列对靶基因进行沉默诱导，利用DNA芯片(DNA mircoarrays)对RNAi过程中的基因表达特征进行分析以检测siRNA的特异性。结果表明，针对同一作用区的不同siRNA对目的基因施加影响后，目的基因表现出几乎相同的表达特征，可是针对不同作用区的siRNA对目的基因表达的影响各不相同。而Chi等(2003)和Jackson等(2003)通过对特异siRNA干扰后基因组的表达变化进行分析，同样证明了RNAi的高度特异性。其实，也正是因为RNAi具有高度特异性的特点而成为鉴定基因功能(Uhlirova et al，2003；Van et al，2003)，基因组分析(Ashrafi et al，2003；Pothof et al，2003；Kamath et al，2003)，植物抗病毒研究(Kubota et al，2003；Vanitharani et al，2003)，人类多种疾病治疗(McCaffrey et al，2003；Lee et al，2003；Kao et al，2004)研究等的有力工具。

由于利用RNAi技术需要将设计的核苷酸片段导入载体以形成颈环结构的RNAi的表达单位(参见图2)，因此方便有效的RNAi表达载体的构建成为高效利用RNAi技术的关键。

传统的RNAi表达载体构建方法为，根据目的基因高度保守区设计3对引物分别扩增该区段的正、反向片段和loop环序列(即图2中的单链环状区)。利用PCR分别扩增三个片段，再分别酶切连接到相应的载体上，然后测序鉴定阳性克隆。该方法需要多步酶切、连接，操作过程复杂，费时费工。或者采用人工合成整个正反向片段及loop环序列，但是成本很高，且直接酶切的效果差。

发明内容

由于在现有技术中，长度小于60bp的人工合成序列的合成成本(例如0.8元人民币/个碱基)大大低于长度大于60bp的人工合成序列(例如3.8元人民币/个碱基)，因此本发明采取的方法为，分段合成长度小于60bp的序列，每条序列分别磷酸化，退火即得到含有酶切位点粘性末端(或平末端)的RNAi干扰片段。该方法不用反复酶切、连接，简化了实验步骤，而且由于短片段合成成本低，与人工合成整个颈环结构的基因序列相比，大大降低了实验成本。具体地，

本发明的一个方面涉及一种用于干扰目标序列的RNAi片段，其特征在于所述RNAi片段是通过以下方法得到的：

1)针对需要干扰的目标序列，任意设计一段不与目标序列互补的序列S，得到一个理论序列，即5’-目标序列-序列S-目标序列的反向互补序列-3’；

2)将1)中所述理论序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段核苷酸序列按照理论序列从5’到3’的顺序分别命名为F1-FN；将所述理论序列的反向互补序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理论序列反向互补序列从5’到3’的顺序分别命名为R1-RM；同时在F1和R1的5’端分别添加含有限制性内切酶酶切位点粘性末端(或平末端)的核苷酸序列；其中与F(N-1)末端和FN首端的核苷酸序列互补的序列，存在于同一条对应的M段核苷酸序列之一上；

3)将N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’-OH分别进行磷酸化；

4)将磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先变性，再退火，得到用于干扰目标序列的RNAi片段。

所述的变性条件温度为大于等于90℃，优选为92-98℃，更优选为94-96℃，在本发明的一个实施方案中，变性温度为94℃，变性后保持一段时间，所述退火条件为变性后逐渐降低温度至室温，在本发明的一个实施方案中，退火条件为变性后自然冷却到室温。

在4)中退火后可任选地加入对退火产物中符合理论序列大小的片段进行纯化的步骤。对退火产物进行纯化的方法可以为柱层析或电泳纯化的方法，将符合理论序列大小的片段纯化出来。在本发明的一个实施方案中，采用的是电泳纯化的方法。

本发明的还一方面涉及一种用于干扰目标序列的RNAi片段的制备方法，其包括以下步骤：

1)选定需要干扰的目标序列，任意设计一段不与目标序列互补的序列S，得到一个理论序列，即5’-目标序列-序列S-目标序列的反向互补序列-3’；

2)将1)中所述理论序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段核苷酸序列按照理论序列从5’到3’的顺序分别命名为F1-FN；将所述理论序列的反向互补序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理论序列的反向互补序列从5’到3’的顺序分别命名为R1-RM；同时在F1和R1的5’端分别添加含有限制性内切酶酶切位点粘性末端(或平末端)的核苷酸序列；其中与F(N-1)末端和FN首端的核苷酸序列互补的序列，存在于同一条对应的M段核苷酸序列之一上；

3)将N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’-OH分别进行磷酸化；

4)将磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先变性，再退火，得到用于干扰目标序列的RNAi片段。

所述的变性条件温度为大于等于90℃，优选为92-98℃，更优选为94-96℃，在本发明的一个实施方案中，变性温度为94℃，变性后保持一段时间，所述退火条件为变性后逐渐降低温度至室温，在本发明的一个实施方案中，退火条件为变性后自然冷却到室温。

在4)中退火后可任选地加入对退火产物中符合理论序列大小的片段进行纯化的步骤。对退火产物进行纯化的方法包括柱层析或电泳纯化的方法，将符合理论序列大小的片段纯化出来。在本发明的一个实施方案中，采用的是电泳纯化的方法。

在本发明中，所述的需要干扰的目标序列是指通过RNA干扰作用使其降解的序列，其长度可以为10-175bp，优选为30-120bp，更优选为60-80bp。

在本发明中，序列S的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基，优选为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基，在本发明的一个实施方案中为15个碱基。

在本发明中，序列S不与目标序列互补是指序列S无法与目标序列形成互补的双链结构。

为了让序列S形成的环比较柔软，使其更容易形成环结构，可以设计为序列S中的AT含量较高，优选为AT含量大于50％，更优选为60％-90％，在本发明的一个实施方案中，为67％。

其中2)中所述的N段核苷酸序列或M段核苷酸序列的大小为小于等于60bp。

其中2)中所述的N和M各自独立地选自2、3、4、5和6，优选为2、3和4，在本发明的一个实施方案中，N和M为3。

在本发明中，所述的其中与F(N-1)末端和FN首端的核苷酸序列互补的序列，存在于同一条对应的M段核苷酸序列之一上，是指与F1末端和F2首端的核苷酸序列互补的序列、与F2末端和F3首端的核苷酸序列互补的序列、与F3末端和F4首端的核苷酸序列互补的序列、以此类推直至与FN-1末端和FN首端的核苷酸序列互补的序列，分别存在于同一条对应的M段核苷酸序列之一上。这样设计的目的是使FN中各段序列的末端与对应的RM中各段序列的首端，以及FN中各段序列的首端与对应的RM中各段序列的末端相互错开，以避免在不能错开时，在变性和退火后无法形成正确连接的片段。

在本发明的一个实施方案中，与F1末端和F2首端的核苷酸序列互补的序列，存在于R3上，与F2末端和F3首端的核苷酸序列互补的序列，存在于R2上。

在本发明中，末端是指核苷酸序列的3′端，首端是指核苷酸序列的5′端。

在本发明的一个实施方案中，2)中所述的FN与RM的序列相同，即F3与R3相同，且命名为M1。

在本发明中，理论序列是指含有目标序列的能够形成颈环结构的序列，同时当理论序列与其反向互补序列形成双链时，在双链两端加入酶切位点后，也是插入RNAi表达载体的序列。

在本发明中，所述限制性内切酶酶切位点是根据使用的载体的多克隆位点设计的，两个限制性内切酶酶切位点可以相同，也可以不同。

本发明的另一方面涉及所述的用于干扰目标序列的RNAi片段及其制备方法在制备RNAi表达载体中的用途。

本发明的还一方面涉及一种重组载体，其特征在于包含本发明的用于干扰目标序列的RNAi片段。

本发明的还一方面涉及重组载体的构建方法，其包括以下步骤：

1)将载体用本发明制备干扰目标序列的RNAi片段中步骤2)中所述的限制性内切酶进行酶切，与本发明的用于干扰目标序列的RNAi片段连接，即得到用于干扰目标序列的RNAi表达载体。

2)任选地，对1)中得到的重组载体中干扰片段的插入进行验证。

其中本发明制备的用于干扰目标序列的RNAi双链片段是带有缺口的双链序列，在其与载体连接时，由于加入了T₄DNA连接酶，双链序列中的缺口得到了修补。

在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体，所述表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，所述RNAi表达载体包括但不限于pAdTrack-CMV，pShuttle-CMV，pAdEasy-1，PLAPSN，Pbmnz，pBMN-ires-GFP，PLNCX，PLNCX2，pMSCV-HYG，pMSCV-neo，pMSCV-puro，pLEGFP-C1，pAAV-MCS，pAAV-lacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pLVX-AcGFP1-N1，pLVX-DsRed-Monomer-N1，plenti6/V5-lacZ，PLP1，PLP2，PLP/VSVG，pLOX-CW-CRE，pLOX-gfp-iresTK，pMD2.G和pCMV-dR8.74。

在本发明的一个实施方案中，所述RNAi表达载体为p6，重组载体为p6+RNAiF。

随着技术的进步，人工合成序列的合成成本会逐渐降低，低成本合成序列的长度会逐渐增加，本发明的技术方案也会随着技术的改进而做相应地调整，合成片段的长度将不限于60bp，而是随着低成本合成序列长度的增加而增加，因此只要是基于本发明思想的技术方案都在本发明涵盖的范围内。

附图说明

图1根据被干扰目标序列设计的RNAi序列示意图

图2根据被干扰目标序列设计的RNAi序列形成的颈环结构示意图

图3oligo序列连接示意图

图4pCAMBIA-1301载体结构示意图

图5p6载体结构示意图

图6p6+RNAiF重组载体的PCR鉴定

图7经转化的水稻愈伤组织GUS染色结果

左：未转入p6+RNAiF载体的愈伤组织(对照)；右：转入p6+RNAiF载体的愈伤组织

图8经转化的水稻试管苗GUS染色结果

左：未转入p6+RNAiF载体的水稻试管苗(对照)；右：转入p6+RNAiF载体的水稻试管苗

发明的有益效果

本发明采用人工合成6条寡核苷酸序列(oligo序列)，每条长度均小于60bp；6条oligo序列分别磷酸化，混合，变性，然后退火即得到含有酶切位点的RNAi干扰片段。该方法不用酶切，直接就可与酶切后的载体连接成为重组载体。简化了实验步骤，节省了实验时间；而且当人工合成序列大于60bp时，每个碱基要3.8元人民币，小于60bp，每个碱基只要0.8元人民币(根据目前的序列合成费用)，故大大降低了实验成本。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：RNAi干扰BGIosR1基因的oligo序列设计

BGIosR1基因全序列如下：

ATGGGAGCTAATTGCTGTATAGCTGCAAAAGAGAGGCCTCAGCCATGTGTTACTCCAATTGAAGTGTCAGCATTCAGGAACGTAAGACACTCTCCATCATGGAGCTTCCGGTGGGATAACCGCACACACATAGAAGACATAATGGAAATGCCCGCATTGTTTTCCAACCATAGTAGTGGAAGCATTCGGCCTGAAACAAAGAGTGGCTCAATTGCGCCAACTGATGGCTTTTCTAACGGAGGCAGCCCTTCTGATATGTTCAACAAGCTCAAGTGCCATAAATCTGACAGGAAGAGGGAGTCATCTAAGATTGCGAGATCTGACCTTCGAGCAGGTAGATCCACCACAAGCAATTCTTCCCCTGAGGCAAAGCTTTCCAGAAAATCGCTAGACACAGTAAGTGTGGCTTCAGATTCGAAGATGTCAATCTCTGTTCCTTCAACGCCGCCTGCTATATCCAGAGCAGATCCTTCATCATCCTCCAGGGGGCATTCTCTACCAACAGATGCAGATTCAATGAGGAAAGCACGAGGGCGCCTCTCCTGAAGGAAGGCCATCCTCCTCCATGCTCTCAGTCTGCAGCAACGATTTATCTGCAGTAGGATCACATGGCGAGTCATCTGATGGTTGGTCAATGCGAACATTTTCTGAAATGGTCGCATCATCTCAGAGAGAGAGATGGTCAGTTGATAGTGAGCTCTTAGGTTCTGTTTCGAGTAAAATGACAAGATCAAATGCTTCTAATAATCCTACTACACATTCACCTGACCAAGAGGTGTGCAAGCTATGTTTAAAGCTATTAAAGGAACGGTCCACATGGAATGCTCAGGAACTGGCTGTTGTTGCTGTTTTATTGTGCGGCCATGTTTACCATGCTGACTGTTTGGATAGCTTAACTGCAGAAGCTGACAAATATGATCCCCCTTGTCCTGTATGCACCCATGGTGAGAAATGTACAGTGAAGCTATTTGGGAAGTTGGAATCAAAGACAAAGAACAAGATACCTAAAAATGTGATAGTTGATGTTAATCTAGATGGGAGCTCTAAGCATCAGAAGGAAAGTAGGAGAGAGCCCAGATTAGGCACAAGTTCTAGCTTGAAGGGCTCGTTTAGTCGCCCGTTTTTGAGAAGGCATTTCTCTATTGGCTCTCGGCCATCCCAGTCAATTTCAGAGAGCGAGTCTGCCAGAAAGAAGGGCTTCTGGGCAAGGCACTGGAGGGAATAG(SEQ ID NO：1)

加框为71bp RNAi序列，即选定的需要干扰的目标序列。

根据上述71bp序列，任意设计一段AT含量高，不与需要干扰的基因序列互补的15bp序列S。

根据选中的71bp RNAi序列，正反连入15bp碱基序列的左右，得到一个理论序列，即5’-目标序列-序列S-目标序列的反向互补序列-3’：

CGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGACCTGTCTATACAGTTGATACCCTGGTGATCGATCGATCACCAGGGTATCAACTGTATAGACAGGTCTCCGACAGCAAGATTCCATCTCTCAGGTCTCTCAACG(SEQ ID NO：2)

其中加框为15bp序列S。如图1所示。当形成颈环结构，见图2。

根据该理论序列，设计6条oligo序列(F1含有BamHI的酶切位点的粘性末端碱基、R1含有XbaI酶切位点的粘性末端碱基)：

BGIosR1F1(43bp)

GATCCGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGA(SBQ ID NO：3)

BGIosR1F2(59bp)

CCTGTCTATACAGTTGATACCCTGGTGATCGATCGATCACCAGG(SEQ ID NO：4)

BGIosR1M1(59bp)

GTATCAACTGTATAGACAGGTCTCCGACAGCAAGATTCCATCTCTCAGGTCTCTCAACG(SEQ ID NO：5)

BGIosR1R2(59bp)

CCTGTCTATACAGTTGATACCCTGGTGATCGATCCTTTACTCATTGCTCGATCACCAGG(SEQ ID NO：6)

BGIosR1R1(43bp)

CTAGCGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGA(SEQ ID NO：7)

参见图3，其中F 3与R3在本实施例中相同，记为M1。

实施例2：RNAi干扰BGIosR1基因的干扰片段制备

接头序列磷酸化体系：20μl

ddH₂O               14μl

10×PNK Buffer A    2μl

10×ATP             2μl

PNK                 1μl

引物                1μl

于37℃反应30min

5条接头oligo序列分别按照上述步骤进行磷酸化。

其中PNK为T₄多聚核苷酸激酶(T₄ Polynucleotide Kinase)(购自enzymatics公司)。

干扰片段制备反应：

接头序列F1 5μl

接头序列F2 5μl

接头序列R1 5μl

接头序列R2 5μl

接头序列M1 10μl

将上述磷酸化后的5条oligo序列按照上述比例混匀，于94℃水浴反应45s，然后自然冷却到室温，所得即为干扰片段RNAiF(图3)，其序列为：5’GATCCGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGACCTGTCTATACAGTT

3’GCAACTCTCTGGACTCTCTACCTTAGAACGACAGCCTCTGGACAGATATGTCAAGATACCCTGGTGATCGAACAATGAGTAAAGGATCGATCACCAGGGTATCAACTGTATAGACTATGGGACCACTAGCTTGTTACTCATTTCCTAGCTAGTGGTCCCATAGTTGACATATCTCAGGTCTCCGACAGCAAGATTCCATCTCTCAGGTCTCTCAACG 3’(SEQ ID NO：8)GTCCAGAGGCTGTCGTTCTAAGGTAGAGAGTCCAGAGAGTTGCGATC 5’(SEQ ID NO：9)

实施例3：RNAi干扰BGIosR2基因的oligo序列设计

BGIosR2基因全序列如下：

ATGACGTGTCACTCTGCCATGGCGGCTCTCACCGTTGGGCACGCGGCGATCGTCCATGCCACCACGCGTCTCGAGGACGCCCGGTCCACCGGCCGTCGGCGGCGGCGGCGGGGGATGATCACGGTGCGCGCGGCGGCGGCGGCGACGAGCGGGTGGGAGCCGGGCAGCTGGAGGGCGCGGCCGGCGAGGCAAATCCCGGAGTACCCGGACGCGGCGGCGCTGGAGGGCGGGGGACGCCGCCATGGGGCGGGCCTTCCTCCTGCAGGGCGGCGACTGCGCCGAGAGCTTCAAAGAGTTCGCCGCCAACAACATCCGCGACACCTTTCGCCTCATGCTCCAGATGGCCGTCGTCCTCACCTTTGGCGGCCAGATGCCCACCATCAAGGTTGGAAGGATGGCTGGCCAATTTGCAAAGCCAAGATCAAACCCAACTGAGACTATAGATGGAGTGACACTTCCTTCCTATCGAGGTGATATTATTAACAGCGATGGTTTTGATGAGAAGTCGCGTGCACCAGATCCTGAAAGGTTAATTAGAGCCTACAGCCAGTCCGCGAGCACCCTGAATCTTCTGAGAGGATTTGCTCATGGAGGGTATGCAGATCTGCAGAGAGTCACCCAGTGGAATCTTGACTTCTTGAGGGACAGCACGCAAGGGGACAGGTATATGGAGCTGTCCGAGAGGGTTCACGATGCCATCGGATTTATGGTTGCTGCTGGTCTGACTCCTCAGCATCCCATCATGACGACGGCTGAATTCTGGACATCTCATGAGTGCCTTCATTTGCCATATGAGCAAGCATTGACTAGGGTGGACTCCATTTCTGGGCTTTACTACGATTGCTCTGCTCATATGCTTTGGGTTGGGGAGAGGACTCGACAACTGGATGGTGCTCATGTTGAATTCCTTCGTGGTATTTCCAACCCTCTAGGTGTAAAGGTGAGTGACAAGCTCGAACCTTCAGAGCTTGTTAAATTGTGTGAGATTTTGAATCCTCACAACAAGCCCGGAAGACTGACAATCATCACAAGAATGGGTGCTGAGAACACGCGCGTTAAGCTCCCACATATGATCAGAGCAGTCCGCCAAGCTGGGTTGATTGTCACTTGGGTCAGTGATCCCATGCATGGGAACACCATCAGCGCACCATGTGGTCTCAAGACAAGATCATTCGACGCGATCAGGTGCGAGCTGAGGGCTTTCTTCGATGTCCATGAGCAAGAGGGAAGCTACCCTGGAGGGATTCACCTGGAGATGACAGGGCAGAACGTTACAGAGTGCATTGGTGGATCCAAGACGGTGACCCTTGATGATCTCAGCTCTCGCTACCGCACGCACTGCGACCCCAGGCTGAATGCATCGCAGTCGCTTGAACTGGCTTTCGCCATTGCTGACAGGCTAAGGAAGAAACGAGACAGGGCTTGGAATAGGTTGGTGTACAGGGCGGTAGCTTAA(SEQ ID NO：10)

加框为71bp RANi序列，即我们需要干扰的目的基因序列。

根据选中的71bp序列，任意设计一段AT含量高，不与需要干扰的基因序列互补的15bp序列S。

将选中的71bp RANi序列，正反连入序列S的左右，得到一个理论序列：GAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACACCAGCGGCGGGAACGACGCCAGCTCGCGCTCCGCGGAGCGCGAGCTGGCGTCGTTCCCGCCGCTGGTGTTCGCCGGGGAGGCGCGGAAGCTGGAGGAGCGGCTC(SEQ ID NO：11)

加框的为15bp的序列S。如图1所示。如形成颈环结构，见图2。

根据该理论序列，设计6条Oligo序列(F1含有BamHI的酶切位点的粘性末端碱基、R1含有XbaI酶切位点的粘性末端碱基)：

BGIosR2F1(43bp)

GATCGAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACAC(SEQ ID NO：12)

BGIosR2F2(59bp)

CAGCGGCGGGAACGACGCCAGCTCGCGCTCCGACAATGAGTAAAGGACGGAGCGCGAGC(SEQ ID NO：13)

BGIosR2M1(59bp)

TGGCGTCGTTCCCGCCGCTGGTGTTCGCCGGGGAGGCGCGGAAGCTGGAGGAGCGGCTC(SEQ ID NO：14)

BGIosR2R2(59bp)

CAGCGGCGGGAACGACGCCAGCTCGCGCTCCGTCCTTTACTCATTGTCGGAGCGCGAGC(SEQ ID NO：15)

BGIosR2R1(43bp)

CTAGGAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACAC(SEQ ID NO：16)

其中F3与R3在本实施例中相同，记为M1。

实施例4：RNAi干扰BGIosR2基因的干扰片段制备

接头序列磷酸化体系：20μl

ddH₂O               14μl

10×PNK Buffer A    2μl

10×ATP             2μl

PNK                 1μl

引物                1μl

于37℃反应30min

5条接头序列分别按照上述步骤进行磷酸化。

干扰片段制备反应：

接头序列F1 5μl

接头序列F2 5μl

接头序列R1 5μl

接头序列R2 5μl

接头序列M1 10μl

将上述磷酸化后的5条oligo序列按照上述比例混匀，于94℃水浴反应45s，然后自然冷却到室温。将反应产物通过琼脂糖电泳纯化，回收161bp左右的片段，所得即为干扰片段RNAiF2，其序列为：5’GATCGAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACACCAGCGGCGGGAACG

3’CTCGGCGAGGAGGTCGAAGGCGCGGAGGGGCCGCTTGTGGTCGCCGCCCTTGCACGCCAGCTCGCGCTCCGCGGAGCGCGAGCTGGCGTCGTTCCCGCTGCGGTCGAGCGCGAGGCTGTTACTCATTTCCTGCCTCGCGCTCGACCGCAGCAAGGGCGCGCTGGTGTTCGCCGGGGAGGCGCGGAAGCTGGAGGAGCGGCTC 3’(SEQ ID NO：17)GCGACCACAAGCGGCCCCTCCGCGCCTTCGACCTCCTCGCCGAGGATC 5’(SEQ ID NO：18)

实施例5：p6载体的构建

1、玉米Ubiquitin启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+Ubi重组载体的构建

Ubi启动子PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取玉米品种B73(Zea mays mays cv.B73)的基因组DNA，根据该启动子在玉米B73gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1：GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT(SEQ ID NO：19)，加限制性酶切位点Pst I和保护碱基，下游引物R1：GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO：20)，加限制性酶切位点Pst I和保护碱基)。以上述提取的玉米B73的gDNA为模板，高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

表1 基因启动子扩增的PCR体系

                                             

组成                           体积(μl)

                                             

基因组DNA                      0.2

dNTPs(2.5mM)                   2

10×Ex Buffer(含镁离子)        2.5

引物F1(50μM)                  1

引物R1(50μM)                  1

Ex taq                         0.2

ddH₂O                          补齐至25μl

                                             

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)纯化回收。

pMD18-T+Ubi重组载体的构建

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：      10μl

pMD18-T            1μl

2×solution I      5μl

PCR扩增产物        10-20ng，根据其浓度定

ddH₂O              补齐至10μl

于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+P604重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+P604重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加600μl 4℃预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃ 220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+Ubi克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-Ubi。

2、pCAMBIA-1301+Ubi重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，从实施例1构建的转化有启动子Ubi的大肠杆菌DH5α-Ubi中提取带有玉米Ubi启动子序列的克隆载体pMD18-T+Ubi；纯化后用相应的限制性内切酶Pst I(NEB)进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)回收相应的启动子片段。

同时用限制性内切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301质粒(参见图4，中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是The CAMBIA Bios(biological open source)Licensee，Australia)并回收。

酶切体系：             50μl

ddH₂O                  34.9μl

10×buffer 3           5μl

Pst I                  0.1μl(10U)

克隆载体pMD18-T+Ubi或pCAMBIA-1301质粒  10μl(＜1000ng)

将回收的启动子片段Ubi与回收的载体片段根据T₄连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接：

连接体系：                 10μl

10×T₄ buffer              1μl

回收的pCAMBIA-1301质粒     1μl(20ng)

回收的启动子Ubi插入片段    10-20ng，根据其浓度定

ddH₂O                      补齐至9.5μl

T₄ ligase(TaKaRa，D2011A)  0.5μl

于16℃节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上。

将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加600μl 4℃预冷的SOC，37℃下220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(kan)，37℃倒置培养16-24h。得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi。

分别以F1和R1为引物对所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi进行PCR检测，以确证所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需启动子Ub i。

3、NOS终止子的PCR扩增和pMD18-T+NOS重组载体的构建

根据pCAMBI A-1301质粒中NOS终止子的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F2：GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA(SEQ ID NO：21)，加限制性酶切位点SacI和保护碱基，下游引物R2：GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT(SEQ ID NO：22)，加限制性酶切位点EcoRI和保护碱基)。以上述提取的pCAMBIA-1301质粒为模板，高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，获得含有pMD18-T+NOS克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5-NOS。挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序，证明准确。

4、pCAMBIA-1301+Ubi+NOS即p6重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，提取实施例3构建的克隆载体pMD18-T+NOS；纯化后用相应的限制性内切酶Sac I(NEB)和EcoR I(NEB)进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)回收相应的NOS终止子片段。同时用限制性内切酶Sac I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi质粒并回收。

酶切体系：      50μl

ddH₂O           34.9μl

10×buffer 1    5μl

Sac I           0.1μl(10U)

EcoR I          0.1μl(10U)

载体pMD18-T+NOS或pCAMBIA-1301+Ubi质粒  10μl(＜1000ng)

将回收的终止子片段NOS与回收的载体片段用T4连接酶进行连接，转化感受态细胞DH5α得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6(参见图5)。

实施例6 p6+RNAiF重组载体的构建

提取p6质粒，并用相应的限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后回收大片段，然后与实施例2获得的干扰片段RNAiF进行连接，随后转化感受态细胞DH5α得到重组载体p6+RNAiF。其中实施例2获得的干扰片段RNAiF是带有缺口的双链序列，在其与p6质粒连接时，由于加入了T4DNA连接酶，双链序列中的缺口得到了修补。

筛选阳性克隆用CCCTGCCTTCATACGCTATT(SEQ ID NO：23)与CGGCAACAGGATTCAATCTT(SEQ ID NO：24)作为引物(该引物根据载体序列设计)进行PCR检测，结果见图6。因为是71bp正反向插入各一次，加上中间的15bp环，共157bp，所选择的PCR检测引物加上了载体的203个bp，故总长度是360bp左右。这个360bp序列因为其中有颈环结构，其单链能自发形成茎环结构，因为是单链，所以长度只有360的一半，即180bp。故在电泳图中出现360bp和180bp两条条带(参见图6)。后测序确定。

实施例4所获得的干扰片段用上述同样的方法与P6载体重组，得到含实施例4的干扰片段的重组载体。

实施例7 重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF细胞的制备

将如实施例6所述方法构建的p6+RNAiF重组载体质粒，转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(2009年12月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M209315)的感受态细胞，具体方法如下：

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，置于冰上解冻。融化后，加入5μl的p6+RNAiF重组载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃ 160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于加有kan-rif(卡那霉素-利福平)双抗的YM培养基平板上(50mg/l Kan，10mg/l Rif，具体配方参见表4)。28℃倒置培养2-3天。

以CCCTGCCTTCATACGCTATT(SEQ ID NO：23)与CGGCAACAGGATTCAATCTT(SEQ ID NO：24)为引物进行PCR检测筛选转化子。PCR扩增出约180bp条带的为重组载体p6+RNAiF的重组根癌农杆菌。

本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p6+RNAiF的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF。

实施例8 水稻愈伤组织的诱导和转化

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF转化所述愈伤组织。

1)将水稻日本晴种子(2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC P200910)去壳，70％乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表2)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3-4周；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1-3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

3)分别挑取如实施例4所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF)，于添加抗生素(50mg/l Kan，10mg/l Rif)的YM培养基(具体配方参见表3、表4)上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl 100mM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见表5)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF)；

4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤4制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min；

5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(配方参见表6)上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48-60h；

6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周。

实施例9 水稻愈伤组织中的GUS的表达

为检测经过实施例8所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照Chen S Y等在Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF转化的水稻愈伤组织进行染色。

GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl 0.1MX-gluc。

将用重组根癌农杆菌EHA105-p6+RNAiF转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照记录，结果如图4所示，含有p6+RNAiF重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图7右)经染色后呈现蓝色，未转重组载体对照(图7左)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明p6+RNAiF转入水稻愈伤组织。

实施例10：转基因水稻苗中GUS的表达

将实施例6中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表7)分化苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表8)进行生根筛选。

转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例5中愈伤组织的染色过程。结果如图5所示，经含有p6+RNAiF重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、茎、叶(图8右)经染色后呈现蓝色，未转重组载体对照(图8左)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明p6+RNAiF转入水稻苗中。

本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下：

以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20min。

本发明所用试剂配方为：N₆ macro母液(20X)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

N₆ micro母液(1000X)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄.7H₂O分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml，70℃温浴2h，冷却后4℃保存不超过1个月。

N₆维生素贮存液(1000X)：维生素B₁ 0.10g，维生素B₆ 0.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

AAM macro(10X)：2.5g七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，1.5g二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM micro(100X)：0.7g单水硫酸锰(MnSO4·H2O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H3BO3)，25mg二水钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO4.5H2O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl2.6H2O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM有机(1000X)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinicacid)，0.1gVB6(Pyridoxine)，1gVB1(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

MS macro(20X)：硝酸铵33.0g，硝酸钾38.0g，磷酸二氢钾3.4g，硫酸镁7.4g，氯化钙8.8g逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS micro(1000X)：硫酸锰16.90g，硫酸锌8.60g，硼酸6.20g，碘化钾0.83g，钼酸钠0.25g，硫酸铜0.025g，氯化钴0.025g，上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS维生素贮存液(1000X)：维生素B₁ 0.010g，维生素B₆ 0.050g，烟酸0.050g，甘氨酸0.200g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

               表2 N6D培养基

                                       

                           1L

                                       

N₆macro母液(20X)           50ml

Fe₂EDTA贮存液(100X)        10ml

N₆micro母液(1000X)         1ml

N₆维生素贮存液(1000X)      1ml

肌醇(500X)                 2ml

2，4-D贮存液(1mg/ml)       2ml

脯氨酸(Proline)            2.88g

水解酪蛋白(CH)             0.30g

蔗糖(sucrose)              30g

植物凝胶(Phytagel)         3g

                                       

用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌。

表3 YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)

表4 YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)

             表5 AAM培养基

加1N氢氧化钾调节pH值至5.2，常规灭菌。

             表6 N6-AS共培养基

调pH至5.2。

          表7 MS-R分化培养基

调PH值至5.8，常规方式灭菌。

          表8 1/2 MS生根培养基

调PH值至5.8。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。